Oběhový systém a imunita Krev nebo hemolymfa propojuje tkáně vzájemně i s okolním světem - transport, obrana, hydrostatická fce. Do určité velikosti a aktivity není cirkulace nezbytná. Neexistuje pravá vnitřní tělní tekutina. Bičíky a svaly obstarají výměnu vody v gastrovaskulární dutině. Do určité velikosti a aktivity není cirkulace nezbytná. Neexistuje pravá vnitřní tělní tekutina. Bičíky a svaly obstarají výměnu vody v gastrovaskulární dutině. S tělní tekutinou: Čím větší a aktivnější, tím dokonalejší cévní sst. Hmyz výjimka. Otevřené a uzavřené cévní systémy. Hlavonožci mají dobře vyvinutý uzavřený cirkulační sst. Jak chobotnice tak sépie mají relativně vysoký krevní tlak – během aktivity až 75 torrů. Stejně jako u obratlovců artérie slouží jako rezervoár kinetické energie při systole a rozepnou se. Struktura elastických bílkovin ve stěnách je však odlišná od obratlovců – jde o nezávislý evoluční znak. Arteriální systémové srdce a s. pomocná Korýši. Hmyz. Úlohu transportu plynů může převzít tracheální sst. Tři typy pump: Samotný pohyb krve je možný díky několika fenoménům: a) peristaltické kontrakce hladké svaloviny samotných cév. b) síla vznikající rytmickými kontrakcemi komorového srdce s chlopněmi, elastický návrat naplněných cév v diastole, c) stlačování cév při pohybu kosterních svalů s chlopněmi, U bezobratlých je relativní úloha komorového srdce mnohem menší než u obratlovců. Srdce korýšů (desetinožců) Srdce má jen tepny. Krev se nasává pod tlakem ostiemi. V srdce je zavěšeno v perikardiálním sinu Problém s návratem krve otevřených systémů Srdce je obklopeno pojivovou membránou zvanou perikard. Tlak v dutině perikardu se mění podle činnosti srdce a velikost oscilací. Závisí jednak na změně objemu srdce, jednak na rigiditě (tuhosti) perikardu. Například u žraloků je perikard tuhý. Podobný najdeme u korýšů a mlžů. Systola komory pak znamená pokles tlaku v dutině perikardu a vznik podtlaku působí roztažení předsíní a usnadňuje žilný návrat krve. Takto je energie komorové systoly využito dvakrát. velevrub 1) Rozdíl mezi systolickým a diastolickým tlakem je malý. 2) Periferní odpor je malý, s čímž souvisí i malá intenzita srdeční činnosti (výkon srdce). 3) Krev neproudí plynule. 4) Podmínky výměny látek s tkáněmi jsou horší vzhledem k menší ploše styku hemolymfy s tkáněmi. 5) Transportní mechanizmus je sice méně energeticky náročný, je však také méně výkonný. 6) Omezená možnost regulace prokrvení a tlaku, 7) Mísí se krev nesoucí živiny a kyslík s metabolity Hemocél leží mezi ekto a entodermem a může zabírat až 40% tělesného objemu. Tlak je malý – asi jen 5-10 Torrů. Vyšší tlak nepř u Helix nebo mlžů je výjimečný. Někdy je tvořen činností srdce, ale u mlžů spíše tlakem svaloviny nohy. Všeobecně mají zvířata s otevřeným systémem limitované možnosti měnit intenzitu průtoku a distribuci krve do různých částí těla. Důsledkem je poměrně malá účinnost výměny kyslíku. Nicméně krabi, humři, langusty mají také už možnost kontroly nad srdečním výkonem a distribucí krve a dosahují vysokých metabolických výkonů. Otevřené a uzavřené sst. Otevřené a uzavřené sst. Klasický pohled. Různé tkáně dostávají různý průtok - Ušeň černá Menší možnost regulace prokrvení, ale i u otevřených cévních systémů je možná jistá prostorová a časová regulace prokrvení lakunárními kanály. Různě metabolicky aktivní tkáně dostávají na jednotku hmotnosti různý podíl cirkulující hemolymfy. Takže není proporční hmotnosti, ale spotřebě kyslíku I v otevřených systémech existuje systém lakun vedoucích krev především do míst s největší metabolickou potřebou. U pavouků a štírů je oběh podobný hmyzu, ale může mít větší roli při dýchání. Hemolymfa štírů může obsahovat hemocyanin a obě skupiny mají jasně definované plíce promývané hemolymfou. U pavouků vedou do nohou samostatné artérie, protože relativně vysoký krevní tlak je důležitý pro lokomoci. Pavoučí nohy nemají extenzorové svaly, takže tlak hemolymfy působí natažení nohou. U skákavek dosahuje tlak hemolymfy impresivních 400 Torrů. Využití tlaku hemolymfy pro pohyb těla. Pavouk v klidu 5 Torr, 45 po stimulaci. Zakotvení mlže Expanze těla hmyzu Tlak hemolymfy U obrovské žížaly Megascolides australis (dlouhé až 6m) peristaltické kontrakce hřbetní cévy ženou krev do hlavového konce a plní sérii laterálních srdcí pumpujících krev do cévy břišní. Prvních 13 segmentů těla má mnohem výraznější cirkulaci než zbytek těla, který nemá laterální srdce. Díky hřbetní peristaltice je tlak v hřbetní cévě mnohem výraznější než v břišní. Tlak hemolymfy Oběh hmyzu: Septa (diafragmy), siny, pomocná srdce. Problémem otevřené cévní soustavy je dostatečné zásobení slepých výběžků. K tomu slouží přídatné pulzatilní orgány. Na bázi nohou pumpují hemolymfu z perineurálního sinu do perikardiálního. Oběh hmyzu: septa, siny, pomocná srdce. Po průchodu kolem mozku nad jícnem (oesophagem) aorta náhle končí a předává hemolymfu do tělní dutiny, přes sinus, který probíhá za mozkem podél eosophagu. Tykadla a končetiny jsou často rozděleny podélnou membránou - septem, přičemž krev přichází do tykadla nebo končetiny na jedné straně a opouští ji na druhé straně septa. Mimoto břišní dutina některých druhů hmyzu je rozdělena dvěma horizontálními septy (dorzálním a ventrálním) na tři části – siny: perikardiální, perineurální (zahrnující břišní nervovou pásku a viscerální. Hemolymfa proudí ho hlavové části dorzální stranou a vrací se zpět ventrální stranou těla. Septa vstupují i do končetin, pomocná srdce na bázi nohou pomáhají prokrvit a řízení směru průtoku je řízeno pomocí chlopní. Pomocná srdce na bázi tykadel. Vzdušné vaky hmyzu stlačované svaly se podílejí na čerpání hemolymfy a řízení směru průtoku – pomáhají cirkulaci. Přepínají tok mezi dorzálním a ventrálním sinem v končetině hmyzu. Svaly mohou tlačit na vzdušný vak a ten uvede do pohybu a usměrní tok hemolymfy (Klowden). Oběh hemolymfy ve výběžcích těla je kromě pulzatilních orgánů zajišťován: 1.částečně pohybem jejich vlastní svaloviny 2.částečně změnami tlaku v abdomenu způsobovanými dýchacími pohyby (larvy Aeschna, jepic), přičemž pulzové vlny v nohách jsou synchronizovány nikoliv s pulzem srdce, nýbrž s dýchacími pohyby 3. částečně tím, že zadní část přepažené nohy (nebo jiného tělního přívěsku) je spojena s perikardiálním sinem v němž je poměrně vysoký tlak, kdežto přední část končetiny je spojena s periviscerálním sinem, kde je tlak nižší. Pohyb hemolymfy v končetině je následkem jak činnosti srdce, tak pulzujících orgánů v thoraxu. 4. U těch druhů, u nichž je břišní přepážka (septum) dobře vyvinuta (Orthopetra, Hymenoptera, Lepidoptera), může obsahovat svalová vlákna a vlnovitými kontrakcemi aktivně napomáhat při čerpání krve směrem dozadu a do stran. Křídlaté svalynezbytné pro plnění u otevřené soustavy bez pevného perikardu. V diastole spolu s dor. diafragmou vytváří podtlak. Jako u savců, i u hmyzu se uplatňuje negativní tlak při diastole. Krev přitom vniká do srdce ostiemi. Stah srdce při systole je vykonáván srdeční svalovinou, v srdci vzniká přetlak a krev je tlačena dopředu (srdce bývá vzadu většinou uzavřené). Srdce myogenní a neurogenní (Decapoda, pavouci, štíři) Humr - neurogenní Srdce švába je spojeno vpředu dvěma laterálními nervy obsahujícími srdeční uzlinu s ganglii viscerální nervové soustavy. Mimoto je srdce spojeno senzitivními a motorickými vlákny se segmentální uzlinou břišní nervové pásky. Přesto, že činnost srdce je ovlivňována nervově i hormonálně, je schopnost rytmických kontrakcí vázána na srdeční svalovinu. Srdeční tep švába je tedy myogenický. U řady druhů hmyzu (larvy vážek Aeschna, Anax) není srdce ve spojení s žádnými nervovými buňkami nebo ganglii a přece může i zcela izolované srdce nebo jen jeho fragment pokračovat v rytmické činnosti. Tato rytmická činnost je do značné míry ovlivněna elastickým pnutím perikardiálních svalů, nebo dokonce tahem podmíněným jejich kontrakcí. Tak např. srdce potápníka Dytiscus tepe 30 - 70 krát za minutu, kdežto po přetětí perikardiálních svalů klesá frekvence tepů na 15 za min. Acetylcholin působí zrychlení činnosti. Adrenalin ale vyvolává také zrychlení. Po nakrmení švába Periplaneta americana je stimulována činnost corpora cardiaca a dalších neurohemálních org. i v blízkosti aorty, které uvolňují cardioactive peptides. Ty zvyšují frekvenci a intenzitu srdečního tepu. Také při rozepínání křídel, letu. Frekvence tepů hřbetní cévy značně kolísá z mnoha důvodů. Je nižší např. u méně aktivních vývojových stadií, jakým je kukla: u housenek Sphinx ligustri je frekvence 40-45 tepů za min., kdežto u kukly klesne na 20-10 za min. Působením zvýšené teploty se zvyšuje i frekvence tepů. Zvyšuje se také vlivem pohybové aktivity: u imága Sphinx ligustri je frekvence tepů v klidu 40- 50 za min, během letu se zvýší na 110-140 za min. K podobnému kolísání tepu dochází u pomocných pulzujících orgánů. Hemolymfa hmyzu bývá zelenavá nebo žlutavá, někdy i bezbarvá tekutina. Hustota se pohybuje okolo 1.03. Reakce bývá slabě kyselá (pH=6.4-6.8), může se ovšem měnit během vývoje. Pufrovací schopnost hemolymfy je dána přítomností bikarbonátů, fosfátů, aminokyselin a bílkovin. Celková molární koncentrace je dosti vysoká. Vyjádřeno koncentrací izotonického roztoku NaCl, obdržíme místo 0.9% (hodnota obvyklá u savců) 1.5-2.1%. Iontové složení velmi různé, závislé na potravě. Poměr Na/K může u různých druhů značně kolísat. U četných druhů hmyzu je koncentrace K v hemolymfě tak vysoká, že může teoreticky zabránit přenosu vzruchů nervovou membránou. Není však narušena proto, že buňky perineuria (uložené pod vláknitým obalem, který pokrývá nervový systém) udržují kolem axonů tkáňovou tekutinu s velmi nízkým obsahem K. Jinou zvláštností u hmyzu je vysoký obsah aminokyselin (20- 30krát vyšší než u savců a člověka). Prolin pro let, Tyrozin pro sklerotizaci, glutamát jako neurotransmitter. Obsah bílkovin v hemolymfě může být buď podobný jako v plazmě savců (kolem 6%) nebo bývá obvykle nižší. Vitelogeniny, enzymy, transportní lipoforiny, imunitní b., hemoglobin, termálně histerezní, zásobní (u housenky i pro další stádia, která už nežerou) Sacharidy: musejí být ve větších koncentracích díky horší cirkulaci. Hlavně (až 5%) trehalóza, t.j. neredukující a nekvasitelný disacharid, štěpený trehalázou na 2 molekuly glukózy. Glc je v potravě běžná a nízká koncentrace v hemolymfě usnadňuje její transport ze střeva. Užití trehalozy umožňuje udržet vysoké koncentrace krevního cukru a neohrozit difuzi ze střeva. Pouze u některých druhů hmyzu je hlavním cukrem v hemolymfě glukóza (např. včela) Složení hemolymfy hmyzu Cytologie, hemocyty. V hemolymfě hmyzu nebo přisedlé ke tkáním hemocyty, tvarově velmi proměnlivé. Počet hemocytů se zvětšuje během metamorfózy, kdy odstraňují produkty histolýzy. Při poranění se hemocyty hromadí na okrajích rány, zabraňují vytékání hemolymfy a účastní se na hojení rány. Pohlcují baktérie vniklé do těla, obklopují cizorodá tělíska i parazity a uzavírají je do váčků (kapsulí). Při tom buňky často splynou v membránu, z níž vymizí buněčná jádra. Plazmatocyty často obsahují mukopolysacharidy, které se z nich uvolňují v období svlékání, jakmile buňky přilnou k povrchu tkáně. Všechny organismy mají jistou vrozenou všeobecnou imunitu kombinující různé mechanismy jako je fagocytóza krevních nebo tkáňových buněk, destrukce pomocí enzymů nebo kyselými sekrety žaludku, enkapsulace, kožní nebo kutikulová bariéra, nebo přítomnost látek v krvi (komplement, protilátky), které napadají a likvidují cizí materiály. Všichni živočichové mají jistou formu vnitřní dutiny vyplněné tekutinou. V té nalézáme cestující amoebocyty. Hlídkují a vyhledávají cizí vetřelce, zvláště ty, označené opsoniny. Získaná, vysoce specifická imunitní odpověď je vlastní obratlovcům. Ale náznaky změny reakce existují i u bezobratlých – možná se bude muset revidovat. Rozeznání vlastního od cizího má dávné kořeny. Protozoa jsou schopni rozeznat a odvrhnout cizí, transplantované jádro. Houby tvoří kolonie agregovaných jedinců se schopností odvrhovat jedince transplantované z cizí kolonie ale přijmout jedince z kolonie vlastní. Totéž platí pro láčkovce (např. sasanky). Dokonce opakované odmítnutí cizího štěpu, transplantátu proběhne rychleji než při prvním setkání – existuje zde paměťová komponenta odvržení. Imunitní reakce bezobratlých. Kroužkovci mají v hemolymfě baktericidní substance a amoebocyty schopné fagocytózy. Není tu však imunizace – následná odpověď je stejná jako první. Podobně jako jiní bezobratlí, reagují na invazi parazitů enkapsulací. Například hlísti (stejně jako inertní materiál) jsou obklopeni amoebocyty a pak enkapsulováni a obaleni vláknitým obalem, který může později kalcifikovat. Měkkýši obecně postrádají silnou adaptivní odpověď na cizí částice nebo bakteriální invazi. Může to být volbou jiného obranného systému – totiž slizového obalu nepropouštějícího baktérie – na podráždění se jeho sekrece zvyšuje. Jinak ale platí, že jejich krev obsahuje řadu hemocytů – amoebocytů, granulocytů a hyalinocytů schopných fagocytózy, dále aglutinujících proteinů. Imunitní reakce bezobratlých. Buněčná i látková odpověď, nespecifická. Pattern RP Opsonizující P Proteolytická kaskáda Hemocyty, epidermis a t. těleso Rozeznání vlastního a cizího je zajišťováno specifickými pattern recognition receptors (proteins – PRP). U savců jsou to např. Toll-like receptors. Dostaly jméno podle Toll receptorů objevených u Drosophily, kde se podílejí na rozeznávání povrchových značek jak při imunitě tak ve vývoji. PRP hmyzu cirkulují rozpuštěné v hemolymfě a vážou se na baktérie. Po této aktivaci se vážou na Toll receptory imunitních buněk a zapínají v nich geny pro produkci efektorových proteinů jako je např. drosomycin. Amébocyty (hemocyty) participují na inflamation-like odpovědi na zranění nebo infekci: jsou lákány chemotaxí do místa zranění, kde fagocytují invadující patogeny. U některých bezobratlých produkují reaktivní oxidové radikály zabíjející mikroby - stejně jako u savců. Podílejí se na enkapsulaci a produkci antimikrobiálních peptidů. Pouze čelistnatí obratlovci jsou majiteli protilátek adaptivní imunity, většina ostatních má také vrozené proteiny s příbuznou rolí: opsonizovat – označit patogeny pro fagocytózu. Společným typem jsou tzv. lektiny vážící se na glykoproteiny cizích buněčných povrchů. To vede i ke shlukování patogenů. Také existují opsonizující proteiny patřící do rodiny Ig. Mohou to být předchůdci Ig. Příkladem je hemolin známý od nočních motýlů. I u bezobratlých spolu imunitní buňky komunikují látkami podobnými interleukinům. Tyto cytokiny vedou k lákání fagocytů k místu infekce. Jde tedy nejspíše o starobylou funkci. Imunitní reakce bezobratlých. Pro bezobratlé typické: nodulace a enkapsulace. Vetřelec, který je příliš velký na fagocytování, je uvězněn. U některých druhů hmyzu je používána proti parazitickým červům, houbám, vajíčkům od parazitických vosiček atd. Povrchové proteiny na vetřelci spustí kaskádu enzymatických reakcí, které vedou k aktivaci profenoloxidázy na aktivní formu. Uvolňuje se při prasknutí hemocytů. Další faktory lákají další hemocyty. Hemocyty obklopí v několika vrstvách patogen nebo porušenou kutikulu a dojde k vytvrzení a uzavření nepropustné schránky. Figure 10: Nodule formation in fatbody and trachea of B.mori. Magnification 60X Figure 11: Mature dark melanized nodule of B.mori as observed under phase contrast microscope at 600X magnification Enkapsulace a nodulace. Fenoloxidázová kaskáda. Vytvoří melanizovaný, toxický a nepropustný obal pro mikroorganismy podobný kutikule. Zástavě krvácení napomáhá stažení svalů v okolí rány a aktivace tvorby zátky, která melanizací vytvrdne. Jsou zapojeny jiné proteiny než u obratlovců, protože heparin je bez účinku a jiné spouštěcí mechanismy nutné pro otevřený cirkulační systém. Figure 16: Blood clotting system (horseshoe crab) Horseshoe crab blood clotting system can be activated by bacterial LPS or fugal beta-1,3glucans. Binding of LPS to Factor C auto activates Factor C, which then triggers the serine proteinase cascade, leading to activation of proclotting enzyme. Clotting enzyme cleaves coagulogen to form gel-like materials coagulin. Another pathway of this system is activated by beta-1,3-glucans, in which binding of glucans to Factor G auto activates Factor G. Figure 14: Encapsulation of bacteria as evidenced by clumped mass of bacteria and degenerated cells of B.mori. Bar = 10 µm Nodule formation  During nodule formation insect hemocytes aggregate to entrap bacteria. Nodules can attach to tissues or may be encapsulated.  An insect lectin scolexin was found to be involved in nodule formation in Manduca sexta. Scolexin is produced by epidermal and midgut cells upon wounding or bacterial infection.  In the medfly (Ceratitis capitata), a protein with molecular mass of 47 kDa is secreted by hemocytes after LPS stimulation and aggregates E.coli cells by the presence of tyrosine and tyrosinase. Figure 10: Nodule formation in fatbody and trachea of B.mori. Magnification 60X Figure 11: Mature dark melanized nodule of B.mori as observed under phase contrast microscope at 600X magnification The Humoral Reactions Melanisation • The formation of the black pigment, melanin is catalysed by the enzyme phenoloxidase, which is converted to its active form by a serine protease cascade. • The inactive proenzyme, prophenoloxidase is synthesized in the hemocytes and after releasing by cell rupture it is either actively transported to the cuticle or deposited around wounds and encapsulated parasites. • Prophenoloxidase has been purified and subsequently characterized from the hemolymph of a range of insect species. • The insect prophenoloxidase enzyme contains a sequence with similarity to the thiol-ester region of the vertebrate complement component proteins C3 and C4. Immune proteins • The third humoral reaction to infection is the rapid de novo synthesis of a battery of antimicrobial peptides (Boman, 1996; Hetru et al., 1998). • The principal site of synthesis is the fat body, but also the hemocytes, the cuticular epithelial cells, the gut, the salivary gland, and also the reproductive tract. • During the research work conducted in the last decade nearly 60 peptide antibiotics have been described in insects. Though diverse in structure, they are basically amphipathic molecules acting at membranes and thereby killing the target cell eventually by lysis. • The insect antimicrobial proteins are grouped into families, based on structural and sequence similarities and their proposed target in the bacterial cell wall. • The attacin-like bacteria inducible proteins have been identified in butterflies and in Drosophila. These proteins are active only against gram negative organisms, where they affect cell division mechanisms by inhibiting the synthesis of outer membrane proteins. The family of these factors includes glycine-rich peptides (20-28kDa) characterized by the presence of one or more copies of the G domain (Hultmark, 1993). • Lysozyme hydrolyses β-(1,4)-glycosidic bonds in peptidoglycan of bacterial cell wall. Insect lysozymes are proteins(14 kDa) with sequence similarity to vertebrate lysozymes. The lysozyme gene or cDNAs have been cloned in several insect species (Kylsten et al., 1992; Sun et al., 1991; Lee & Brey, 1995). In Drosophila, the lysozymes are encoded by at least seven genes and expressed in different parts of the digestive tract and at different stages of development. • Cecropins have antibacterial activity against both gram-positive and gram negative bacteria since they interact with lipid membranes forming voltage dependent ion channels. The cecropins (4 kDa) are devoid of cystein, and exhibit a structure of two αhelices joined by a hinge region. Families of cecropin genes with some sequence differences have been found in butterfly species, in the flesh fly (Sarcophaga peregrina) and in Drosophila. A mammalian cecropin was identified in pig intestine (Lee et al., 1996) and bovine adrenal glands (Strub et al., 1995) which implies that cecropins may be widespread in the animal kingdom. • Defensins attack mainly Gram-positive bacteria in contrast to attacin-like antibacterial peptides. They act on the cytoplasmic membrane and lyse cells by the formation of membrane channels. Insect defensins are cationic peptides (4 kDa) containing six conserved cystein residues engaged in three disulphide bridges. They possess three distinct domains: amino-terminal loop, an α-helix, and an antiparallel β sheet. About thirty defensins have been characterized in various insect species. Although numerous defensins have been isolated from mammalians and from plants, further analysis revealed that they are not homologous to the defensins of insects. • The proline rich antimicrobial peptides lyse Gram-negative bacteria by increasing the membrane permeability. They are peptides with molecular mass of 2 - 4 kDa, lacking cysteine and containing at least 25% proline. The O-glycosylation at the threonin residues is essential for their biological activity. Apaedicins and abaecin from honeybee, drosocin and metchnikowin from Drosophila, pyrrhocoricin, lebocin and metalnikowin belong to this family. Also, the pig intestine and bovine leukocytes have been shown to produce proline-rich antibacterial peptides, although these peptides do not share sequence homology to the proline-rich peptides of insects. • Diptericins have so far been described only in dipteran species. They are 9-kDa peptides containing both an attacin-like G domain, a C-terminal glycine rich residue and a short N-terminal proline-rich region containing a consensus site for O-glycosylation. Diptericins are lytic for Gram-negative bacteria which may be due to a way of action similar to that of attacins. • Other inducible antibacterial proteins have been isolated from insects not fitting into the groups described above. Coleptericin, holotricin-2, hemiptericin and gallysin-1 act on Gram negative bacteria, while moricin, thanatin (homologous to frog-skin antimicrobial peptides of the brevinine family), and hymenoptaecin can lyse both Gramnegative and Gram-positive bacteria. • Inducible peptide antibiotics against fungi have been discovered in insects. The peptide named AFP, tenecin-3 and holotricin-3 share similarities while drosomycin shows a significant homology with a family of plant antifungal peptides. Furthermore, the antibacterial peptides metchnikowin and thanatin have antifungal activity.