Termální fyziologie Teplota jako zásadní faktor prostředí a postavení bezobratlých při termoregulaci. Rozmezí teplot, v němž žijí různé organismy na Zemi je velmi široké - od -80 st.C. po teploty nad 100 st.C. Podstatné je také časové kolísání teplot. ENOOTHERMY Z O No \ O > Yes No Yes Poikilotherms or ectotherms Hndotherms Nonthermoregulating poikilotherms or ectotherms Nonthermoregulating endotherms Thermoregu lating poikilotherms or ectotherms Behavioral thermoregulators Thermoregulating endotherms Homeotherms Figure 8.1 Animals fall into four categories of thermal relations based on whether they display endothermy and whether they display thermoregulation ENDOTHERMY Mammals (torpid) Mammals Large flying insects Large reptiles Teplota jako zásadní faktor prostředí a postavení bezobratlých při termoregulaci. Naked mole rat POIKILOTHERMY HOMEOTHERMY Birds (torpid) Monotremes Fish (polar) Invertebrates (aquatic, polar) Fish (tropical) Invertebrates (soil, temperate) Amphibians Reptiles Fish Invertebrates Invertebrates (aquatic, tropical) ECTOTHERMY Figure 13.6 Thermal Strategies Most animals can be classified as homeotherm or poikilotherm. or alternately, ectotherm or endotherm. This figure illustrates the many species whose thermal strategies combine elements of multiple strategies. For example, monotremes are less homeothermic and less endothermic than other mammals. 1 mg 10 mg 100 mg Body mass 1 g 10 g r T T 100 g -1— 1 kg Terrestrial vertebrate ectotherms Terrestrial vertebrate endotherrns Terrestrial invertebrate ectotherms Heterothermic species may occur Jen velcí si mohou dovolit termoregulovat. Behaviorální termoregulace je ale dostupná i malým. Termoregulace jako evoluční krok k volným nikám. Teplota a metabolismus u ektotermů a endotermů. Mění se aktivita enzymů, vlastnosti membrán (gel x tekutost). Protože zejména slabé vazby jsou teplotou ovlivněny, mění se vlastnosti proteinů a lipidů. H můstky a van der W. síly s teplotou slábnou, hydrofobní interakce (vazby) sílí. Záleží tedy na relativní důležitosti a zastoupení vazeb._ Teplotní optimum proteázy sumky a čas trvání experimentu. Při ochlazení se adaptuje - roste aktivita, a optimum se posouvá do nižších teplot. ■ 7* v o Cl O U 4) 840 700 o 560 'i £ 420 280 1 140 CL 50 h/ 26 h y 10 hy v 3 h 10 20 30 40 Temperature (°C) 50 60 Figure 4.1 The effect of temperature on a protein splitting enzyme (protease) from the ascidian Hahcynthia. The enzyme effect seems to have a temperature optimum, but this optimum is lower the longer the duration of the experiment. This is explained in the text. [Berrill 1929] Adaptace, Aklimace Existují velké rozdíly v teplotách, jimž jsou různé druhy přizpůsobeny. Např. Thermobia (šupinušky, Apterygota) jsou aktivní v rozmezí 12-50 °C. Grylloblatta, cvrčkovec, který žije ve vysokých horách Severní Ameriky, je aktivní při teplotě -2.5 -11.5 °C, teplotu 20 °C. již nesnese. I u téhož jedince může dojít ke změně odolnosti vůči abnormálním teplotám v důsledku adaptací. Např. šváb adaptovaný na teplotu 36°C upadá do stavu strnulosti (chladový šok) při snížení teploty na 9.5°C. Byl-li však chován alespoň 24 hod při teplotě 15 °C, pak dojde ke chladovému šoku až při 2°C. A. Kontrola fluidity membrán • Délka řetězce • Saturace • Fosfolipidová třída (fosfatidilcholin x fosfatidilethanolamin) 4. Cholesterol - udržuje fluiditu za nízkých T B. Syntéza ochranných látek (teplo i chlad) C. Změny spektra izoenzymů Low fluidity High fluidity Figure 13.12 Phospholipid properties and membrane fluidity Cells change the fluidity of membranes by altering the composition of membrane phospholipids. Vlivy vysokých teplot: Letálním limitem je denaturace a koagulace proteinů - inaktivace enzymů. Rozpad navazujících enzymatických drah s různými teplotními optimy - smrt. Některé případy života při teplotách kolem 130° C jsou záhadou. Termoregulující hmyz. Matabolismus včel (včetně frekvence křídel) klesá s rostoucí teplotou. As the air temperature falls, incubating queen bumblebees thermoregulate by increasing their metabolic rate and thus the rate at which they generate heat. G C V (A J— Cl Flying honeybees beat their wings less frequently and thus generate less heat at high air temperatures than at low air tempertures. 300 r 250 ~P 200 150 Wing-beat frequency m CD c O 09 -i X 20 40 Air temperature (°C) 0 10 15 20 25 Air temperature (°C) Figure 8.44 The effect of air temperature on wing-beat frequen and metabolic rate in flying honeybees {Apis mellifera) The lin< average-response lines, based on hundreds of individual measurei Termoregulující hmyz. Chlazení odpařováním vody - kapička u úst. Stojí na česně a větrají úl, kde se odpařuje voda z medu a tak se ochlazuje. Včely se zahřívají svalovou činností - bez viditelných vibrací křídla jsou kutikulární zarážkou zaseknuta v jedné poloze. Když zahřívají plod, vlezou si do prázdných buněk mezi obsazenými nebo tisknou hruď k víčku. Termoregulující hmyz. Velcí lišajové (Sphingidaé) nemohou vzlétnout bez zahřátí svaloviny třesem a vibracemi křídel dokud teplota nevystoupí nad 30 °C. Třes vzniká současným zatínáním opozičních svalů. Současně s třesem srdeční hřbetní céva se kontrahuje jen pomalu a slabě a proudění hemolymfy je tak omezeno v podstatě pouze na hrudní svalovinu. Pak vzlétnou a během letu teplota dosahuje až nad 40 °C. Frekvence a intenzita stahů hřbetní cévy se zvyšují a teplo je odváděno i do zadečku, což má zase naopak význam pro prevenci přehřátí. Na regulaci směru a intenzity proudění se podílí i ventrální diafragma. —i-l1_i_i_i_i_i 10 20 30 40 Air tcmperature (°C) Termoregulující hmyz. Tepelný výměník lišajů i včel. Současně s třesem se srdeční hřbetní céva kontrahuje jen pomalu a slabě a proudění hemolymfy je tak omezeno v podstatě pouze na hrudní svalovinu. Pak vzlétnou a během letu teplota dosahuje až nad 40 °C. Frekvence a intenzita stahů hřbetní cévy se zvyšují a teplo je odváděno i do zadečku, což má zase naopak význam pro prevenci přehřátí. Na regulaci směru a intenzity proudění se podílí i ventrální diafragma. Jsou i mimosvalové cesty tvoření tepla z chemických vazeb. Čmelák Bombus affinis má F-1,6 - fosfatázu asi 40 krát aktivnější než včela. To mu umožňuje intenzivní metabolický cyklus mezi F-6-P a F-1,6-DP za spotřeby ATP, čímž se ovšem generuje teplo a je udržena teplota hrudi. Výsledkem je, že může létat a krmit se za mnohem nižších teplot, než to mohou včely. Glycolysis Glucose (6C) \7 ATP ADP Glucose-6-phosphatc (6Q This is t carbon com po 4 Fructose-6-phosphatc (6C) ATP ADP <7 Fructosc-l,6-diphosphate (6C) )ihydroxy- i—N Glyccraldehyde-3-phosphale (. acetone phosphate (3C) 0 ___ 2 NAD 2 XAD1 h <7 2 1,3-Diphosphogiyceric acid (3C) ■2 ADP 2 ATP 2 3-Phosphoglvcerk acid (3C) i 2 2-Phosphoglyceric acid (3C) h—►2H,0 2 Phosphoenolpyruvic acid (3C) -—2 ADP ATP O 2 Pyruvic acid (3G) Šupiny a chlupy můr a včel i jiná izolační zařízení pomáhají udržovat teplotu těla za letu. Mnoho druhů hmyzu využívá k zahřátí těla energie slunečního svitu. Nepatrné změny v tloušťce vrstev šupin mohou velmi významně ovlivnit, zdaje sluneční tepelná energie odrážena nebo naopak absorbována (interferenční děje) Rozdíly v tloušťce asi 10 nm, přesto jsou zásadní. Je-li tloušťka šupinky rovna asi 1/4 vlnové délky světla, vlny odražené od horního a dolního povrchu jsou posunuty o polovinu fáze, interferují - odečítají se a veškerou energii ve formě tepla odevzdají chitinu šupinky. Všeho moc škodí - horní limit teploty pro kutikulu a ztráty vody. (a) Average responses of four species „ 1.0 X B £ o (N x £ 0.8 0.6 •Si 0.4 * 0.2 Um 2i 0 Cockroach nymph Butterfly larvae The transition temperature at which the permeability of the integument increases abruptly varies from one species and life stage to another. Locust adults (Schistocerca) Mealworms -L 1 20 30 40 50 Temperature of cuticle (°C) 60 (b) Data for adult migratory locusts (Locustn) 0.7 r to X 0.6 £ £ ■S 0.5 CJC 0 X 0.4 [ bp ¥ 0.3 1 0.2 r o % 0.1 0 • • V • : '1 1 0 10 20 30 40 50 60 Air temperature (°C) Vlivy vysokých teplot: Jestliže jsou poikilotermové krátce vystavení stresující ale neletální vysoké teplotě, rychle syntetizují proteiny zvané heat shock proteins nebo stresové proteiny -chaperony. Jsou známy od téměř všech skupin organizmů a jsou zřejmě evolučně velmi staré, neboť jejich aminokyselinová sekvence je téměř shodná. Jsou to proteiny, které užívají energie ATP k tomu, aby opravily terciární strukturu jiných bílkovin poškozeným reverzibilní denaturací teplem. Chaperony jsou strážci, kteří kontrolují a zabezpečují správnou prostorovou strukturu proteinů a brání vzniku nesprávných vazeb. Chaperony hsp60 dokonce umí špatně sbalené proteiny opět rozbalit. Např. u měkkýšů skalnatých pobřežních pásem, kde teplota značně kolísá na slunci a ve vodě, je syntéza těchto proteinů běžná. Heat shock proteins - chaperons Cytoplasm ©_ / Hsp70 © © Denatured protein Complex of HSF and Hsp's under unstressed conditions. Heat stress causes complex to dissociate. Hsp70 binds to denatured proteins. HSF monomers associate into trimers. Trimers move into the nucleus and bind to the promoter of genes with heat shock element (HSE). Í Í Hsp70 gene transcription increases. Poly A+ mRNA is exported to the cytoplasm. Poly A+ mRNA is translated to form more Hsp70. Nucleus Poly A+ mRNA The increase in Hsp70 levels allows the complex to form again, stopping transcriptional activation. Figure 13.15 Heat shock response Vlivy nízkých teplot: Vícesložkové proteiny se rozdělí na jednotlivé části již za teplot kolem 0 °C a nižší teploty mohou způsobit nevratnou denaturaci neboli přechod z funkčního do nefunkčního prostorového uspořádání. Rovněž biologické membrány přecházejí z funkční fluidní fáze do nefunkční fáze gelové. Tvorba ledových krystalů uvnitř buněk je letální. Chlad Hula 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Tři stavy vody a tomu odpovídající strategie přežití při chladu. Tělní voda začíná mrznout někde mezi -0,5 a -38 °C. Jakmile se zformuje zárodečný krystal, poslouží jako nukleační jádro, k němuž se rychle připojují další molekuly vody. Projeví se to náhlým uvolněním skupenského tepla, jež můžeme snadno měřit jako reálný bod mrznutí (neboli bod podchlazení) 20 10 o -10 2 -20 o a E h -30 -40 Body temperature Melting point of body fluids -50 -60 Supercooled fluid Ice Supercooling point Freeze tolerance Time Různé druhy hmyzu přezimují v centrální Aljašce pod odlupující se kůrou odumírajících smrků a osik, plně vystaveni teplotám klesajícím až na -55 °C. Pokud je z organismu odstraněna voda, hlavní problém je vyřešen. Anhydrobiotický organismus přežije téměř všechno, včetně zchlazení na teplotu kapalného helia. Musí se ale umět vyrovnat s hyperosmotickým prostředím, nahromaděním reaktivních radikálů. Četné druhy hmyzu však přezimují v plné hydratovaném stavu. Takže se musí nějak vyrovnat s fázovým přechodem vody. Existují dvě možnosti jak to učinit, a hmyz využívá obě. Buď je možné oddálit tvorbu ledu a udržet vodu v kapalném podchlazeném stavu, nebo tolerovat promrznutí, či je dokonce řízené zahájit při poměrně vysokých teplotách. Některé druhy hmyzu pak posunuly podchlazovací schopnost až za hranici teoretických limitů, téměř na -60 °C. I za těchto teplot v nich nalézáme kapalnou vodu a žádný led. Jak je to možné? 1. jde o velmi malý objem, v němž se silně uplatňují kapilární vlivy při interakci vody s povrchy membrán a makromolekul. 2. metabolismus hmyzu produkuje ohromující množství kryoprotektivních látek, etylenglykol u lýkožrouta Ips acuminatus. Běžnějším kryoprotektantem hmyzí říše je glycerol(v koncentracích až 5000 mM) a dále různé vícesložkové směsi, obsahující kromě glycerolu jednoduché cukry a od nich odvozené polyoly. 3. biosyntéza speciálních proteinů (anti-freeze proteins, AFPs). Ty dokážou „obalit" zárodečný krystal ledu a zabránit mu v dalším růstu. Funkčně podobné proteiny najdeme také u antarktických ryb. 4. Je potřeba se zbavit nukleátorů ledu, například vyprázdnit střevo a odstranit nukleační bakterie. 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Ochrana proteinů a membrán proti ztrátě hydratačních obalů - při anhydrobióze. Vesmír 88, červen 2009 Hmyz přezimujícív podchlazeném stavu v mírném pásmu velmi často hromadí směsi cukrů a poiyolů (řádově stovky miliosmolů na kg). Takové množství nijak významně nesníží bod podchlazení. Přesto zvýšená koncentrace těchto látek většinou dobře koreluje se schopností přežívat v chladu. V naší laboratoři jsme prokázali, že i malé množství kryoprotektantů může zlepšit odolnost vůči chladu, avšak jiným způsobem. Nesnižuje bod podchlazení vody, ale patrně chrání funkční prostorové uspořádání proteinů a biologických membrán. Pyrrhocoris apterus ribitol _1 sorbitol m mannitol trehalóza glukóza m myo-inositol ■ glycerol Ips typographus Dynamika vícesložkových kryoprotektantů u lýko-žrouta smrkového (Ips typographus), jehož dospě-lec prezimuje v lýku napadených smrků, a ruměni-ce pospolné (Pyrrhocoris apterus), která přečkává zimu v opadance pod lipami. Teplota mikroprostře-dí závisí na vystavení výkyvům počasí. Zatímco pod kůrou stojících smrků je zima, v opadance může být poměrně teplo, zvláště pod sněhovou pokrývkou. Snímky © Vladimír Košťál (ploštice) a František Weyda (lýkožrout). 150 XI XII I II III 1999/2000 E tatu 10 Z ž 2 ■y 0 I lota -10 -20 2005/2006 Peptide backbone a-helix Disaccharide a-Helix of antifreeze Ice-crystal lattice Polar residue Non-polar residues Adsorbed antifreeze molecules Highly curved fronts (high energy) Step Fig. 8.13 The repeating structure of glycopeptide antifreezes; and a model of how this may allow adsorption to ice crystals, preventing growth at the sites of attachment and forcing intermediate sites to grow out into a series of curved ice fronts of high surface energy which require lower temperatures for further growth. Antifrízy zabraňují růstu ledového krystalu. Water molecules Figure 13.16 Antifreeze proteins Antifreeze proteins bind to the surface of ice crystals to prevent their growth. They bind along the face of the ice crystal, where the protein forms weak bonds with water molecules immobilized in the ice crystal. Because ice growth is very orderly, the presence of the bound protein prevents ice crystal growth. (Source: Modified from Davies et al. 2002) Druhá strategie - tolerance promrznutí. Strategie vzácná u obratlovců, kromě několika žab, ale běžná u hmyzu, plžů, mlžů, kroužkovců a h listů. Některé druhy hmyzu dosahují úplné kryobiózy při -196 °C. Důležité je zmrznout včas a pomalu. Led může být tolerován pouze extracelulárně, i tak jsou buňky vystaveny osmotickému i mechanickému stresu. Mušky druhu Chymomyza costata obývají sever Evropy, Asie a Ameriky a žijí i v České republice. Jejich larvy přezimují v dormantním stavu pod kůrou padlých stromů. Během prezimovaní jsou schopny se podchlazovat, ale přežijí i promrznutí. Jejich larvy naplňují kryogenický sen. Přestože mají plně vyvinuté orgány, dokážeme je postupně zchladit až na teplotu kapalného dusíku, a to v plně hydratovaném stavu. A larvy to přežijí! Podmínkou jejich úspěšné kryoprezervace je předchozí pomalá laboratorní aklimatizace. Během ní se mění struktura buněčných membrán a hromadí se potenciální kryoprotektanty a anhydroprotektanty - prolin a trehalóza. 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Záznam letálního promrzání larvy Chymomyza costata. Zhruba 5 mm dlouhá larva je umístěna na podložku o teplotě -25 °C. Začne promrzat, až když tělní teplota klesne pod -20 °C. Do této teploty zůstává tělní voda v kapalném, podchlazeném stavu. Promrznutí bylo velmi rychlé a odehrálo se mezi 15. a 18. sekundou. Podmínkou pro přežití promrznutí je však zcela jiný způsob mrznutí: • voda musí zmrznout za relativně vysoké teploty blízko 0 °C (to je zajištěno přímým kontaktem s okolním ledem); • následný pokles teplot musí být pomalý (pomalejší než 0,1 °C); • teprve když tělní teplota dosáhne zhruba -30 °C, může být larva prudce zchlazena až na teplotu kapalného dusíku (-196 °C). Všechny snímky © František Weyda. Obě strategie - srovnání. Table 8.5 Freeze tolerance and freeze avoidance. Characteristic Freeze-avoiders Freeze-tolerators Ice formation Lethal Extracellular ice tolerated LCT 5 to -20°C (rarely 60°C) 20 to-70°C Supercooling capacity High Low Supercooling point Close to LCT Well above LCT Ice-nucleating agents Absent or masked Present and active (proteins) Antifreezes Polyols ± peptides in fish — Cryoprotectants — Polyols, ± trehalose, ± proline Occurrence Many invertebrates Some vertebrates, notably polar fish Common in invertebrates A few frogs LOT, lower critical temperature. Kryptobióza Klesá-li teplota, zpomaluje se pohyb částic a s ním všechny biofyzikálni děje. Snižuje se energie částic a jejich schopnost vstupovat do biochemických reakcí. Při určité teplotě se tedy život zcela zastaví. Je však možné, aby po následném zvýšení teploty život opět pokračoval? Možnosti cestování prostorem a časem (?). 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Anhydrobióza Vyschnutí - hrozba, ale i ochrana před mrazem hlístice, vířníci, želvušky, larva pakomára Polypedilum 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Pomalým vysušováním klesne obsah vody kolem 2 %, hluboko pod mezní hranicí pro aktivní biochemické procesy. Pokud jsou anhydrobiotické larvy skladovány v suchu, temnu a při pokojové teplotě, vydrží minimálně 19 let i víc. Anhydrobiotické organismy vydrží ovšem i leccos jiného: zchlazení na teplotu kapalného helia (-270 °C), zahřátí na teplotu 150 °C, koupel v 100% alkoholu nebo v organických rozpouštědlech, pobyt ve vakuu, vysoké dávky rentgenového záření či tlak 6000 atmosfér. Tyto extrémní výkony přivedly některé vědce k myšlence testovat schopnost přežití anhydrobiotů v otevřeném vesmíru. Želvušky byly na 10 dnů vystaveny působení vakua, UV radiace a kosmického záření. Přežily! Další test v kosmu s anhydrobitickými pakomáry. Jejich plánovaný měsíční pobyt v otevřeném prostoru se kvůli hurikánu nakonec protáhl na celý rok. Američtí astronauti museli opustit oběžnou dráhu o den dříve a nestihli již odmontovat z vnějšího pláště speciální kontejner s pakomáronauty. Přežili. 306 Vesmír 88, květen 2009 I http://www.vesmir.cz Postupná dehydratace aktivuje biosyntézu cukerných látek - u bezobratlých trehalózu. Ta může činit až 20 % celkové hmotnosti těla. U larev pakomárů je to kolem 18 %. Pozitivní působení trehalózy: Termodynamické vlastnosti systému voda-trehalóza-protein (membrána) znesnadňují denaturaci proteinů (popřípadě změnu vlastností membrány) při vzrůstající koncentraci destabilizujících iontů v roztoku, ze kterého postupně mizí voda. Pokračující dehydratace vede až ke ztrátám molekul vody přímo z hydratačních obalů proteinů a membrán. V prostředí bez trehalózy by to znamenalo fatální ztrátu funkčního prostorového uspořádání. Proteiny by denaturovaly a agregovaly, membrány by přešly do gelové nebo hexagonální fáze. Mezi trehalózou a povrchem proteinu či membrány se však vytvoří vodíkové můstky, jež nahradí chybějící molekuly vody. Koncentrovaný roztok trehalózy je navíc silně viskózni a může přecházet až do amorfní sklovité, syrupovité struktury. Vitrifikace užívaná při kryoprezervaci. Biochemické procesy se zastavují, volný prostor po molekulách vody vyplňuje trehalóza. Zdá se, že vlastnosti velmi podobné trehalóze mají i některé proteiny. Nález LEA proteinů u vysychajících hlístic a vířníků potvrdil jejich rozšíření i mezi živočichy. LEA proteiny jsou poměrně malé a silně hydrofilní. Mohou proto vázat ionty koncentrující se ve vysychající buňce, zvyšovat viskozitu prostředí a podporovat přechod do skelné fáze. Interagují rovněž s povrchem proteinů a membrán a konzervují jejich strukturu. Kromě toho patrně (stejně jako trehalóza) vychytávají volné kyslíkové radikály. To je důležité, neboť ochrana proti oxidativnímu poškození je dalším významným opatřením pro přežití v dehydratovaném stavu. Tento ochranný systém a také systém šokových proteinů jsou obvykle aktivovány nejen při vysychání, ale i při různých jiných stresových stavech, do kterých se živé buňky dostávají. Praktické aplikace: Využití trehalózy při dlouhodobém skladování buněk, orgánů nebo celých organismů v suchém stavu a za pokojových teplot zní jako velmi lákavá alternativa k nákladnému a složitému uchovávání hluboko pod bodem mrazu.