Imunochemické metody • • •- stanovení Ag či Ab v histologických preparátech, tělních tekutinách, a jiných vzorcích, Imunoeseje, reakce třetí generace. •základem je reakce: • • • • Ag + Ab IK • - imunokomplex -jeden z reaktantů nese značku a tím je vizualizován výsledek. Detekčnísystém tak zvyšuje citlivost reakce a umožňuje modifikace, které prostou precipitací reakce nejsou dosažitelné. -enzym EIA, EMIT enzyme multiplyed immunoassay technique • geneticky upravený enzym CEDIA • radioizotop RIA • fluorescenční látka FIA • chemiluminiscenční látka LIA • ü •* Charakteristika reaktantů •Antigeny Ag– makromolekuly (polymery: proteiny, polypeptidy…) ü navozují specifickou imunitní opovědˇ ü specificky reagují s protilátkami ü hapten – nízkomolekulární látka (léčiva, drogy) navázána na • vysokomolekulární nosič •Protilátky Ab – bílkoviny (glykoproteiny) tělních tekutin ü vykazují specifickou vazebnou schopnost vůči antigenu, na jehož • podnět se vytvořily, mohou být cíleně připravené a) jen proti jedné chemické skupině b) která je společná pro více strukturně chemicky příbuzných látek • moderní imunologické diagnostické metody, vznikly v 80.letech min. století vychází z poznatků imunologie, molek. biol., enzymologie, fotometrie a radiochemie •Heterogenní imunometody – separace molekul značeného reagens vázaného v imunokomplexu od volných molekul značeného reagens v roztoku (radioimunometody, ELISA) – vysoká citlivost •Homogenní imunometody – bez separace frakcí, jsou jednodušší, rychlejší, lze je automatizovat (enzymová, fluorescenční a chemiluminiscenční imunoanalýza) • • •Imunochemické metody RIA ~ radioimmunoassay •zavedena 1959 •Princip metody: spojuje jednoduchou imunologickou reakci Ag s Ab s metodikami radiochemie, která používá Ag nebo Ab značené radionuklidy •- citlivost: 10-9- 10-17 mol/l ®velmi významné, nejcitlivější •- je možné stanovovat látky i v tělesných tekutinách /krev, moč, mozkomíšní mok.../ i v pg10-12(pikogramech) •- stanovujeme jakékoliv látky, proti nimž lze vytvořit protilátku • protilátku získáme komerčně nebo injikací Ag či haptenu do králíka nebo morčete •- POSTUP: • •V metodě je využito kompetice, kdy stanovený Ag a známé mn. téhož Ag značeného radioaktivním izotopem soutěží při tvorbě imunokomplexu o omezený počet vazebných míst specifické Ab (ta je v lim. množství) •Ê imunizace ~ příprava Ab: • •- injekce Ag či haptenu do zvířete /králík, morče/ • - nekompletní Ag – je potřeba navázat makromolekulární nosič • • •Ë značení radioaktivním prvkem (Ag = X...značka) •- 3 prvky: 3H,14C,125I, 131I •- označený Ag ® Xx •Ì vlastní reakce: •- 4 složky: •Xx.................značený Ag •Ab lim60%........protilátka ze zvířete /je limitováno ~ známo její množství/ •XN.................neznámý antigen •XS.................standardní antigen •Í oddělení IK: •· imunochemické – sekundární protilátka Abs •- vyrobí se proti prvotní protilátce Ab ~ Ab pak vystupuje jako Ag •® Abs + Ab ...vznikají sraženiny IK •- izolace IK -imunochemicky – Abs, fyzikálně - filtrace, centrifugace... •molekulární metody – elektroforéza, chromatografie ... •Î vyhodnocení: •- čím více molekul X se bude v každé zkumavce nacházet, tím méně molekul Xx se bude moc navázat s protilátkou •Vyhodnocení: • •- výhody: * vysoká citlivost, specifičnost, přesnost, automatizace procesů • * mikromnožství látek přímo v bioloogických kapalinách •- nevýhody: * nakladné zařízení, drahé přístroje-scintilátor, drahá scintilační tekutina •* radioaktivní materiál – zdravotní riziko, γ nebo β záření, zvl. bezpečnost při práci, likvidace radioakt. materiálu • * vlastnosti radionuklidů ~ znehodnocování krátkým poločasem rozpadu – časová náročnost (musí se provést hned), u izotopů vydávajících γ záření (,125I, 131I, 75Se) je omezena expirace souprav krátkým poločasem rozpadu • •využití: •využití v kriminalistice, soudním lékařství (detekce jedovatých látek), stanovování velmi malého množství látek (nízko i vysokomolekulárních) např.:kardiotonika, cytostatika (léčba infekčních onemocnění, nádorových onemocnění), hladiny hormonů, léčiv, vitamínů, drogy, minoritních složek séra, ve virologické diagnostice, vyšetření specif. autoprotilátek např. proti acetylcholinovému receptoru při myastemia gravis, • •v alergendiagnostice: RAST test (radioallergensorbent test)je vyvinutý pro detekci Ab proti specifickému alergenu, RIST test (radioimmunosorbent test) je testem vyvinutým pro zjistění antigenu, Radioimunoprecipitace je pokládána za nejpřesnější metodu pro stanovení IgE v sérech • FIA •Vypracována v r. 1941, uvedena do praxe v 50. letech •Princip: navázáním fluoresceinu – fluorochromu na bílkovin séra (Ag nebo Ab), podmínkou je neztratit imunologické vlastnosti. Výsledkem je spojení vysoké specifity imunologických reakcí s citlivostí průkazu fluorescence pomocí fluorescenčního mikroskopu- citlivost: 10-9- 10-12 mol/l • • fluorescenční barviva: TMRITC........tetramethylrodaminizothiokyanát •FITC ............fluorescein izothiokyanát, •PE….. .….. phycoerythrin •- podstata: molekula přechází ze základního energetického stavu při absorbování energie do stavu EXCITOVANÉHO, kde je nestabilní a vyzářením energie ve formě tepla či světla (emise) se vrací zpět •- energie dodána lampou v přístroji •ENNÍ •- vlastnosti SONDY: • •* intenzita fluorescence dostatečně vysoká •* fluorescenční signál odlišitelný od pozadí •* vazba na sondu nesmí deformovat vazebné vlastnosti Ag a protilátky • nenavázané barvivo musí být lehce odstranitelné •! biologický materiál sám o sobě vyzařuje energii ® pozadí •- 2 druhy: •¬ HOMOGENNÍ • HETEROGENNÍ • HETEROGENNÍ:- vlastnosti: •· intenzita fluorescence se v průběhu reakce nemění •· stanovení vysokomolekulárních látek •· nutné oddělení IK od volných reaktantů •- 2 způsoby oddělování: •* PRECIPITACE ~ srážení v imunologii •- PEG ~ polyethylenglykol ® srazí se •* navázání na pevný nosič ¬HOMOGENNÍ:- vlastnosti: •· intenzita fluorescence se při vzniku konjugátu mění ·· nemusíme oddělovat IK od volných reaktantů ·stanovení nízkomolekulárních látek /hapten/ - antibiotika,sedativa, hypnotika ... · • • • •Citlivost je omezována interferencí s různými látkami ve vzorku (zejména v krevním séru), malý stupeň fluorescenčních změn. • •Podstata: kompetitivní princip, využívá se fluorescenční polarizace, zhášení, stupńované fluorescence, excitační přenos fluorescence, fluorescenčně značený substrát. •- třístupňový proces u FLUOROFORŮ a FLUOROCHROMŮ •- schopny absorbovat určité množství světla /struktura – ar. kruh/ •1. FÁZE ® EXCITACE • •2. FÁZE ® DOBA EXCITOVANÉHO STAVU •- trvá 10-9s ~ velmi krátká •· konformační změna ·disipace energie ® část energie se ztrácí ·– přechází na nižší stav • •FLUORESCENCE •3.FÁZE ® EMISE •- vyzáření energie, přechází na základní stav ® vyzáření EMISNÍ ENERGIE •/~ energie emisního spektra/ •energie EXCITAČNÍ se NErovná EMISNÍ !!! •Eex> Eem h .(c/lex) > h .(c/lem) •Þ lex < lem Þ vl. délka excitační je menší než emisní