Metody používané v klinické praxi •Metody využívající sérologické reakce •Testy funkce a počtu buněk imunitního systému •Základy alergologického vyšetření •Imunologické vyšetření a základy interpretace •výsledků imunologických laboratoří •Příklad vyšetření v laboratořích metody využívající sérologické reakce A. Precipitační metody V kapalinách V gelu B. Imunodifuzní metody •Jednoduchá imunodifúze •dvojitá imunodifúze C. Imunoelektroforetické metody Kombinace s elfo •Imunoelektroforéza podle Williamse a Grabara •Raketová imunoelektroforéza •Protisměrná •Dvojrozměrná •D. Aglutinační metody E. Hemaglutinační F. Komplementové G. Immunoblotting Zákalové reakce •Imunonefelometrie •Imunoturbidimetrie H. Imunochemické metody a) RIA b) FIA c)EIA Časové rozdělení metod •Metody I.generace •Některé techniky v roztoku – precipitační, aglutinační, KFR •Metody II.generace •Kvantitativně i složité směsi antigenu, •Imunodifúze, imunoelfo •Metody III.generace •Velmi citlivé metody, stanoví Ag, Ab i hapteny •Imunoanalýzy – př. RIA, FIA, EIA, imunoturbidimetrie •– nefelometrie, -fluorimetrie, popř jejich kombinace •Metody IV.generace •Kontinuálně měří Ag, Ab i hapteny •imunosenzory Příklady metod I.-IV. generace •Metody I.generace – pacientův vzorek obsahující S. aureus koaguluje králičí plasmu •Metody II.generace – ve vz. pacienta se identifikují povrchové Ag S. aureus pomocí fibrinogenu / IgG, rutinní, následuje citlivost •Metody III.generace – stanovení Ag pouzdra S. aureus, odhalení MRSA (metycilin rezist.), bez pouzdra – reakce s fibrinogenem nebo neo IgG •Metody IV.generace – zjištění rezistentního kmene hned! CM-MP částice (Carboxylate modified microparticles) navázány na latex a detekují kapsulární polysacharidy S. aureus ve vzorku pacienta. Silná, jasně viditělná aglutinace za 20s. • • • •1929 Heidelberg a Kendall – popsali reakci rozpustného Ag s odpovídající Ab ve vhodném poměru. •Výsledek reakce – precipitát •Stanovili precipitační křivku a 3 oblasti reakce Ag s Ab •Precipitační křivka •Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) •Oblast ekvivalence •Precipitační metody •Oblast nadbytku protilátky •Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie • turbidimetrie • s markerem EIA, IRMA.. •Oblast nadbytku antigenu •Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA.. • homogenní EMIT (EIA)… • •- faktory ovlivňující precipitaci: •· typ Ab /např. IgG/ •· teplota – se zvyšující se teplotou se urychluje precipitace /např. 38°C/ •· vzájemná koncentrace Ag a Ab •· pH •· iontový náboj •· tvar a velikost části •Serologické metody - precipitace Precipitační křívka •Závislost tvorby precipitátu na vzájemné koncentraci protilátka – antigen (Stanly, 2002) •Ag + Ab ® Ag-Ab • precipitinogen precipitin precipitát sraženina •solubilní /rozpustný/ •Koncentrace 0,1g/ a vyšší!! •- dělíme: •A) v kapalinách : •I. prstencová • – prstenec sraženiny precipitátu • • •II. sklíčková – určení pod mikroskopem •B) v gelu: •IMUNODIFÚZE • • •PRECIPITAČNÍ metody: •využití : ke stanovení Ag, Ab, H •praxe – 1. zjištění výskytu či stanovení Ab v séru při inf. onemocnění 2. identifikace Ag (patogena) •Koncentrace Ab se vyjadřuje jako TITR SÉRA. • => nejmenší zředění Ab, které ještě reaguje s Ag •- hodnocení : kvalitativně – odečtení okem •· kvantitativně : •a, zjištěním množství precipitátu •b, zjištěním množství Ag v precipitátu či supernatantu •c, změna optických vlastností vzorku – 2 metody : •NEFELOMETRIE –* TURBIDIMETRIE •Velmi nízké mn. precipitátu lze hodnotit pomocí detekčních systémů využívajících Ab nebo Ag značené radioizotopem, fluoresc. Látkou, enzymem, luminiscenční látkou •PRECIPITAČNÍ metody: • • • • •Titrace séra př. Precipitační imunochemické metody •Screeningové metody – jednoduché precipitační testy terénní kazetové •testy pracující v oblasti ekvivalence, imunochromatografické •Vzorky: moč, výtěr z nosu, pochvy, konečníku, ne krev! Stanovení Ag •nebo Ab a jejich vizualizace barevnou složkou • • • • • • • S T C S T C •Negativní výsledek Pozitivní výsledek • •Za nepřítomnosti nebo nedostatku drogy ve vzorku moče •vytvoří protilátka imunokomplex (precipitát) se značenou •drogou vázanou v místě testu T. (S – vzorek, C – kontrola) • • •Využití: •Rychlé chromatografické testy – stanovení přítomnosti drogy v tělesných tekutinách, •Ab (na desce přítomný antigen •nebo Ag (na desce přítomná protilátka, např.u infekčních nemocí (Chlamydie, Streptococcus pneumoniae, gonádotropin u těhotných žen •Adenovirus, Rotavirus, Helicobacter pylori, Influenza A,B) Imunodifúze •- specifická reakce Ag s Ab - precipitace •/gel z agaru nebo agarózy/- AGAR ~ směs polysacharidů extrahovaných z červených mořských řas • * ® přírodní agar nutno přečišťovat ~ frakcionací vznikají 2 složky:· agaróza •- neobsahuje vedlejší aniontové skupiny - pro difúzi více vhodná •- standardnější složení než agar a nižší schopnost nespecifické adsorpce •· agaropektin •- obsahuje aniontové skupiny ® pro difúzi nevhodný imunodifúze •příprava gelu: • rozvaření agarózy v pufru na vodní lázni •nanesení na skleněné destičky – ztuhnutí ve vodorovné poloze /při teplotě pod 42°C/ •princip ID: •- vzájemná volná difúze Ab a Ag v gelu na základě koncentračního spádu až do místa střetnutí ~ zde vznikají precipitační linie®obloučky®prstence®kruhy /záleží na použitém materiálu/ •- vzniklé precipitáty detekujeme: •* okem - zákal •* barvením – Coomassie blue, amidočerň •* sekundárními protilátkami •* Au, Ag, radioizotopy •- vznik precipitátů je děj postupný!!! • Imunodifúze • •- rozdělení imunodifúzních metod: •* jednoduchá imunodifúze – gelem difunduje pouze jedna složka –Ag nebo Ab •* dvojitá imunodifúze – gelem difundují obě složky– Ag i Ab •· jednorozměrná – složka putuje v gelu jedním směrem •· dvojrozměrná /radiální/– složka putuje více směry •Ag a Ab si neodpovídají – nevytvoří se precipitační linie •Směs více typů Ag a Ab – počet linií odpovídá počtu sobě si odpovídajících párů Ab a Ag • Imunodifúze •jednoduchá imunodifúze- migruje 1 složka: •1. složka se smíchá s gelem už při jeho přípravě (nemigruje) •2. složka se aplikuje následně do vyřezaných jamek – MIGRUJE – v místě vyrovnání koncentrací vzniká precipitační linie •Jednoduchá jednorozměrná imunodifúze ~ dle OUDINA •- ve spodní části zkumavky agarózový gel s Ab, převrstveno roztokem s Ag - zalito parafínovým olejem – zábrana odpařování •- čím je Ag koncentrovanější, tím dále od roztoku s Ag vznikají precipitační linie /odečitatelnější/ •- využití: · detekce počtu Ag párů •roztok s Ag •gel s Ab •olej Imunodifúze •Jednoduchá radiální /dvojrozměrná/ imunodifúze dle MANCINIOVÉ •- na skleněnou destičku se nalije gel, který obsahuje Ab ® nemigruje • inkubace ve vlhké komůrce ve vodorovné poloze → difúze všemi směry (radiální) • po obarvení - modré precipitační prstence •® čím je vzorek koncentrovanější – větší průměr prstence •→ změření druhé mocniny průměrů prstenců – vynesení kalibrační křivky a odečet koncentrace neznámého vzorku- •využití: •· ke kvantitativnímu stanovení Ag •· klinická praxe: stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze • •jamky - vzorky: -gel s Ab •* fyziologický roztok –blank •* vzorky o neznámé koncentraci •* vzorky o známé koncentraci (kalibrační) •dvojitá imunodifúze •- gelem difundují obě složky •- koncentrace Ag a Ab musí být vzájemně ekvivalentní – proti překrývání linií •Dvojitá jednorozměrná imunodifúze •- ve zkumavce agarózový gel s Ab a agarózový gel s Ag •- mezi nimi čistý gel – v místě vyrovnání koncentrací se vytvoří precipitační linie- •využití: · kvalitativní důkaz Ag •· určení imunochemické příbuznosti či odlišnosti Ag • • •Imunodifúze •Dvojitá radiální imunodifúze ~dle OUCHTERLONYHO •na skleněné desky nanesen čistý gel •menší jamky – různé Ag či různé koncentrace jednoho Ag •větší prostřední jamka – Ab •koncentrovanější Ag → precipitační obloučky blíže jamky s Ab •inkubace ve vlhké komůrce •počet precipitačních linií odpovídá počtu odpovídajících si párů Ag a Ab •Využití – průkaz Ab při alergických alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii •Imunodifúze Imunodifúze • • •- využití: •· titrace Ag – koncentrace Ag určuje umístění precipitační linie •· důkaz přítomnosti Ab •· porovnávání identity a neidentity Ag směsí ® umístění precipitační linie •Ag • •porovnání Mr (Ag) a Mr (Ab) ® určuje tvar precipitační linie • • - menší molekula se dostane dále do gelu Souhrn využití ID •Kvalitativní i kvantitativní stanovení Ag, a Ab, porovnání Ag směsí •stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, složek komplementu a proteinů akutní fáze •průkaz Ab při alergických alveolitidách, průkaz Ab proti některým patogenům, např. Toxoplazma gondii •Nefelometrie, turbidimetrie Imunoelektroforetické metody -kombinace metod elektroforetických a imunodifúzních -Bílkoviny se dělí v závislosti na molekulové váze a elektrické náboji jednotlivých molekul. Při běžné elfo se sérum dělí na zónu albuminu, α – 1, α – 2, β, γ globulinů. Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít význam při hodnocení stádia zánětlivého procesu. Při akutních zánětech stoupá zastoupení α – 1, později i α – 2, při chronickcých zánětech dochází ke zvýšení zastoupení γ globulinů a poklesu albuminu. •imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA •RAKETOVÁ imunoelektroforéza •PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza •DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza •Př. imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: •- 1953 Williams a Grabar •- 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) • vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně •po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici ® dochází k DIFUZI •® v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky • • • WG2 WG1 WG3 Aglutinační metody •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát - -princip : KORPUSKULÁRNÍ / částicový / Ag, -solubilní je vázán částice •při reakci dochází ke shlukování Ag a Ab na základě vytváření můstků - Ab mezi buňkami za vzniku shluků •přímá – použití bakterií, buněk •nepřímá, pasivní – na jejich povrch je Ag uměle navázán, př.latex-fixační test, HIT •Předpoklady ke vzniku vazeb: 1.dostatek Ab, 2.přítomnost Ab proti různým epitopům 3.vzdálenost mezi částicemi co největší 4. Ab funkčně jednovazebné nevytváří aglutinaci (IgAmono, IgE, IgG) – inkompletní Ab viz hemaglutinace • • •Hodnocení aglutinace: •kvalitativně - odečtení okem •kvantitativně : •a) zjištěním množství aglutinátu •b) zjištěním množství Ag v aglutinátu či supernatantu •Rozdíl mezi aglutinací a precipitací Aglutinace •využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1.K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2.K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu (Salmonella typhi), paratyfu (Salmonella paratyphi )A,B,C, Weil-Felixova – skvrnitého tyfu (Rickettsia prowazekii) Proteus vulgaris, Ab proti Francisella tularensis, •3. K průkazu Treponema p., EBV – mononukleóza, brucelózy, listeriózy •4. Nepřímá - k průkazu auto Ab proti štítné žláze, Ab proti autoAg • • • • • •Latexová aglutinace, latex-fixační test •rychlé kvalitativní stanovení •Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách •Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor •Průkaz patogenních Antigenů (Helicobacter pylori, Adeno a Rotavirus) • Latexová aglutinace, latex-fixační test •Tyfus - Salmonella typhi •Paratyfus - Salmonella paratyphi A,B,C podobné příznaky jako tyfus •Skvrnitý tyfus, blechy, veš šatní, klíště - Rickettsia prowazekii -Proteus vulgaris, horečka, třesavka, vyrážka •Adenovirus, Rotavirus gastrointestinální infekce • Hemaglutinační •Ag + Ab ® Ag-Ab •hemaglutinogen hemaglutin hemaglutinát •- savčí krvinky (i části) •- dochází ke shlukování krvinek, vlivem komplementu či virové částice pak dochází k LYZI. • •Ke zviditelnění aglutinačních reakcí při použití •inkompletních Ab je možno použít • a) aglutinaci v bílkovinném prostředí b) v prostředí s proteolytickými enzymy c) použitím antiglobulinového Coombsova séra - králičí ab proti lidským Ig • Hemaglutinace -využití: K zjišťování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům. Přímý Coombsův test – k průkazu navázaných antierytrocytárních Ab, reakce pacientových ery s Coombsovým antisérem, přítomnost navázaných Ab se projeví hemaglutinátem -Nepřímý Coombsův test – k průkazu cirkulujících antierytrocytárních Ab -1. fáze, pacinetovo sérum s ery od dárce, navázání Ab pokud jsou přítomny, vymytí, přidání Coomsova séra, které způsobí aglutinaci •při 2 reakcích: •* KFR – komlement fixační reakce •* HIT – hemaglutinačně inhibiční test : • • HIT • •Patří také mezi metody serologické, založené na inhibici biologických účinků antigenů • HIT – pasivní hemaglutinace •Vycházíme ze skutečnosti, že viry (některé bakterie atd) mají schopnost se spontánně absorbovat na červené krvinky (rozpustný Ag). •Ery pak aglutinují – shlukují se jen v přítomnosti specifické Ab •· odpovídá-li protilátka Ag, po přidání obalených ERY Ag se Ag vyváže a vznikne HEMAGLUTINÁT •Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát, proběhne hemaglutinace • •· • • • • • • • • • HIT •neodpovídá-li protilátka virovému Ag, nedojde k hemaglutinaci •situace, kdy přidáme stejný Ag do reakce • Ab + Ag - Ery ® hemaglutinát + stejný Ag ® Ag -Ab + Ag - Ery ® inhibice hemaglutinace •Metodou inhibice pasivní hemaglutinace lze dokázat velmi malé mn. rozpustného Ag nebo H (metoda je velmi citlivá) •pro vyhodnocení můžeme použít i optické metody •Využití: Průkaz Ab proti patogen. Ag jako Candida Albicans, Aspergillus fumigatus, Treponema pallidum • Komplementové metody metody využívající faktu aktivace komplementového systému komplexem – antigen-protilátka, KFR • • •složky reakce: Ab, Ag, C, ERY, hemolyzin •· Ab- vyšetřované sérum •- chceme v něm prokázat protilátku / komplement v séru je tepelně inaktivován / •· známý specifický Ag •- jsou-li v séru Ab, vytvoří se imunokomplex IK •· KOMPLEMENT - zdrojem nejčastěji sérum morčete (váže se na IK a aktivuje protilátku) •hemolytický komplex: komplex Ag /beraní ERY/ a protilátky ~ AMBOCEPTORu /hemolyzinu/, získaného imunizací králičího séra beraními erytrocyty •® aby došlo k hemolýze je nutná spoluúčast KOMPLEMENTU a inkubace 30 minut při 30 °C KFR •průběh reakce: •* POZITIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru je Ab •protilátka v séru vytvoří komplex s Ag – na něj se naváže komplement. Po přidání hemolytického systému nezbývá již komplement do 2. části reakce •® k hemolýze NEDOJDE: •* NEGATIVNÍ ~ ve vyšetřovaném séru není Ab •- v 1. fázi reakce se nevytvoří IK – komplement se nevyváže a zbývá do 2. fáze reakce, kdy aktivuje hemolyzin •® DOJDE k hemolýze: •- velmi záleží na množství komplementu – každý vzorek se musí titrovat, aby bylo množství komplementu konstantní • KFR - využití •použití: •· diagnostika nemocí příjice /syfilis/, Stanovení Ab proti patogenním Ag bakterie (Bordetella, Brucella, Borrelie, Campilobacter,…), viry (Adenov. Cytomegalov., EBV…), prvoci (Toxoplazma…) •· ve virologii průkaz protilátek téměř všech virových nákaz •· typizace neznámých Ag nově izolovaných virů •· průkaz protiorgánových Ab • Vyšetření komplementového systému •Stanovují se a)hladiny jednotlivých složek K v séru – •za pomoci antisér, většinou proti C3, C4, C1q •b) celková aktivita komplementové kaskády- •Se provádí testem CH50 – (50% hemolýza způsobená komplementem), stupeň hemolýzy závisí na množství přidaného K, nepřímá úměra •Využití: K detekci poruch nedostatečnéh mn. Nebo defektů složek K systému •Reakční směs: •2%nálev krvinek, Ab(hemolyzin), C komerční (vyšetřované sérum) •Výsledek: lýze buněk, vyčeření • • Vyšetření cirkulujících a deponovaných IK •Principy metodik •Ag+Ag=IK, CIK, DIK •1. Využívající fyz – chem vlastností – CIK- největší makromolekuly séra mohou být preciptovány pomocí PEG (polyetylénglykol). Precipitát je úměrný mn. cirkulujících CIK • Vyšetření CIK •2. CIK na sebe váží C1 – C3 složky K. V první fázi se odstraní nenavázaný C1q. V druhé fázi se stanoví koncentrace C1q, jež odráží i hladinu CIK (totéž pro C3,C4) •3. průkaz vazbou na buňky, které exprimují receptor pro Fc gragment IgG. Lze využít trombocyty, žírné, fagocyty •Využití: Pro monitoring jakýchkoliv zánětlivých procesů. Pro diagnostiku imunokomplexových chorob je důležitější průkaz IK deponovaných v tkáních. To se provádí po bioptickém odběru vzorku z tkáně (kůže, svaly, ledviny) pomocí přímé fluorescence se prokazuje uložení IgG Zákalové reakce metoda probíhající v roztoku •Princip: při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množstvím mn. Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag F4k46-o494 *NEFELOMETRIE – rozptyl monochrom. světla měřeného pod úhlem, měří se intenzita záblesků světla odraženého od IK (Tyndal. efekt), výbojka nebo laser • •TURBIDIMETRIE – úbytek monochrom. světla o 320nm při průchodu vzorkem v kyvetě měřeného ve stejné rovině •Výhoda: možnost automatizace, rychlost provedení, přesnost, ale vyšší cena, dioda, méně přesná •Využití: Stanovení c Ig, hlavních sérových proteinů, stanovení sérových bílk.(složky C, proteiny akut. fáze (CRP – stand. 2mg/l, transferin, alfa2 – makroglobulin) •Úskalí: V prec. křivce je třeba vymezit oblasti: •a)zóna využitelná pro měření, tj oblast nadbytku Ab •b)Kritický bod, oblast ekvivalence, zde leží nejvyšší konc. Ag, kterou lze ještě měřit •c)oblast za krit. bodem, zde nelze měřit •Dva režimy stanovení a)End point – měří se v prostředí polyetylénglykolu b)Rate kynetický systém – měří se kineticky , v krátkých časových intervalech