Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 •Karel Souček, Ph.D. •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •Emission Spectra–Spectral Overlap EmissionSpectra Co je problém při vícebarevné detekci? •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu n Factors that Effect Compensation nReagent Lot-to-Lot Variation nFluorochrome Stability nSample-to-Sample Variation nAssay Staining Conditions n Many factors can effect compensation, including reagent lot-to-lot variation (especially in tandem dyes, which we will talk about in the next few slides), fluorochrome stability (degradation caused by light, temperature, and time), sample to sample variation (if you get a specimen that is much brighter than your usual samples), and assay staining conditions (fixative) [USEMAP] Antibodies [USEMAP] Flow Cytometry Panel Design & Antibody Search nŘešení? –#1 http://cdn2.knowyourmobile.com/sites/knowyourmobilecom/files/styles/article_main_wide_image/public/ 3/11/marty_cooper.jpg?itok=oUn2v_AM https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/e/e0/Simplicissimus_Karl_Arnold_Mobile_Telephony.jpg Idea (1931) "Simplicissimus Karl Arnold Mobile Telephony" by Source (WP:NFCC#4). Licensed under Fair use via Wikipedia Invention (1973) Martin Cooper, Motorola Innovation (2007) Steve Jobs, Apple http://i.ytimg.com/vi/e7EfxMOElBE/maxresdefault.jpg Spectral flow cytometry J.P. Robinson, Purdue University J.Paul Robinson Spectral flow cytometry SP6800 Optical Bench Flowcell Chip with Laser Spots Conventional vs. spectral analysis Standard Comp vs SP6800 Spectral Comp > http://www.sonybiotechnology.com/images/sp6800/Fluorescent_Proteins_and_Fluorochromes.jpg http://www.sonybiotechnology.com/images/sp6800/Fluorescent_Proteins_and_Fluorochromes.jpg nŘešení? –#2 Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_1.stream •Cells were covalently labeled with a bifunctional compound, maleimido-mono-amide-DOTA (mDOTA). This compound can be loaded with a lanthanide(III) isotope ion, and reacts covalently with cellular thiol groups through the maleimide moiety. Single Cell Mass Cytometry http://reports.cytobank.org/105/v2/images/image_2.stream •Seven unique lanthanide isotopes were used to generate 128 combinations, enough to barcode each sample in a 96-well plate. The seven lanthanide isotopes, their masses and their locations on the 96-well plate are shown. Single Cell Mass Cytometry Single Cell Mass Cytometry [USEMAP] Vizualizace dat a intepretace dat Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol 7: 681-685 Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol 7: 681-685 Gating a kontrola kvality Figure_7 1)Singlets 2)Time 3)viabilita http://expertcytometry.com/3-flow-cytometry-gates-that-will-improve-the-accuracy-of-your-facs-data- analysis/ http://expertcytometry.com/6-flow-cytometry-gating-tips-that-most-scientists-forget/ Screen Shot 2014-06-06 at 5.43.45 PM Screen Shot 2014-06-06 at 5.45.11 PM Gating a kontrola kvality Screen Shot 2014-06-06 at 5.46.07 PM http://expertcytometry.com/6-flow-cytometry-gating-tips-that-most-scientists-forget/ Gating a kontrola nastavení FMO ~ Fluorescence Mines One Fluorescence Minus One | Expert Cytometry | Fluorescence Assisted Cell Sorting Figure_1 Gating – příklad hodnocení Vitální analýza buněčných funkcí nPrůtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou vitální analýzu buněk –intracelulární koncentrace iontů, –pH, –produkce reaktivních skupin, –životnost n Detekce viability njedna z nejjednodušších analýz nfunguje na principu: –detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – –detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM – nethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat nPomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci nLIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits n Detekce viability •Přenos signálu pomocí Ca2+ •Cytosol (koncentrace - „klidová“ 100 nM vs. 1-10 mM aktivovaná) •[Ca2+]c aktivuje proteinkinázu C •interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ •Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •Ca 2+ influx •- Fura-2 •- Fluo-3 •- Indo-1 •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •ionophor •ionophor •Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]i •standardizace barvení a kalibrace •- zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic ® -127) •- inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) •- pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie • •Burns, J. M. et.al. (1997). • "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. •http://www.cytekdev.com •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie • •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie •Kalibrace •(pro jednu vlnovou délku) • Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) Fmin = 1.25 x FMnCl2 - 0.25 x Fmax •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie - pro ziska Fmax - přidání ionoforu = A23187-Br, ionomycin - Fmin - 2mM MgCl2, Fluo-3 vytváří fluorescenční komplex i s Mg2+ (ale 5x méně intenzinví fluo nez s Ca2+ Detekce intracelulárního pH nFluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH nSNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH nNutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce reaktivních kyslíkových skupin nReaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů –posttranslační modifikace proteinů –regulace transkripce –regulace struktury chromatinu –přenos signálu –funkce imunitního systému –fyzický a metabolický stres –neurodegenerace, stárnutí • n n •O2• – •O2 •H2O2 •• OH •H2O •4 e– reduction to water •e– •e– •e– •e– •Not so terribly reactive with most biomolecules •Maintained at very low concentration •Catalases, peroxidases, GSH, etc… •Actually a chemical reductant •Not so terribly reactive with most biomolecules •Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen •Maintained at very low concentration •Superoxide dismutases •Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates •The molecule that makes ionizing radiation toxic •Unreactive at STP, but a great electron acceptor •Biological activation via radicals, transition metals •Generally, radical intermediates are enzyme-bound •© Simon Melov Potential sites of intervention •Oxidative •Stress •Neurodegeneration •Cancer •Vascular Tone •Cardiac Output •Sensory Acuity •Skin Thickness •Bone Density •Endocrine Function •Immune Function •DNA •Damage •Oncogenesis •Mitochondrial •Damage •Energy •Crisis •Cell Death •© Simon Melov Hydroethidine •HE EB •N •CH2CH3 •NH2 •H2N •H •Br- •N •CH2CH3 •NH2 •H2N •+ •O2- • •Phagocytic Vacuole •SOD •H2O2 •NADPH •NADP •O2 • •NADPH Oxidase •OH- •O2- DCF •HE • • • • • O2- H2O2 DCF •Example: Neutrophil Oxidative Burst •© J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH DCF • • • • • • •COOH •H •Cl •O •O-C-CH3 •O •CH3-C-O •Cl •O • • • • •COOH •H •Cl •OH •HO •Cl •O •COOH •H •Cl •O •HO •Cl •O •Fluorescent •Hydrolysis •Oxidation •2’,7’-dichlorofluorescin •2’,7’-dichlorofluorescin diacetate •2’,7’-dichlorofluorescein •Cellular Esterases •H2O2 •DCFH-DA DCFH-DA DCFH •DCF H O 2 2 • •Lymphocytes •Monocytes •Neutrophils •log FITC Fluorescence •.1 • 1000 • 100 • 10 • 1 •0 •20 •40 •60 •PMA-stimulated PMN •Control •80 •© J. P. Robinson, Purdue University •- DCFH-DA •- DHR-123 •- HE •Oxidative Burst •K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny nbioluminescence resonance energy transfer (BRET) –Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. –je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. –modré světlo excituje green fluorescent protein. –Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. –luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. –modré světlo excituje green fluorescent protein. – – •Renilla reniformis "Sea Pansy" •http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 •Aequorea victoria “Crystal jelly “ •http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny •http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm CONTROL SCH900776 MU380 Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions npHyPer-cyto vector npHyPer-dMito vector –Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995]. npHyPer-nuc vector –Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] n n n Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů nsynchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) nizolace chromozómů nznačení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin n= celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti n NCBI PubChem logo http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů e-bang „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ •♂ •♀ •Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Cover image expansion Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nekologie npotravinářství http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nviabilita nmetabolické funkce nsortrování nanalýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) n Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii nSortrování –EPICS + Autoclone® modul n Průtoková cytometrie kvasinek nbuněčné dělení nviabilita nmembránový potenciál nrespirace nprodukce H2O2 ncitlivost k antibiotikům nseparace n Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii nstudium pico- a nano-fytoplanktonu (< 20 mM) nanalýza metabolických funkcí planktonu nstudium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii nanalýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ [USEMAP] Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm Absorption Spectrum Emission Spectrum http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chlorophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých nlze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky n nPříklady aplikací: –buněčný cyklus –cytotoxicita –apoptóza Long Tongue Tachinid Fly 240px-Miesmuscheln_Mytilus_2 Invertebrate Survival Journal [USEMAP] http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html nFigure 5. Representative flow-cytometry scatter plot of hemocytes from 25 oysters. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 nFigure 6. Proposed model for hemocyte maturation, as seen by flow cytometry. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 „High Throughput Flow Cytometry“ nautomatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) nvyužití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků •Automatický karusel (autosampler) •Adaptér pro nasávání vzorků z •mikrotitrační desky logo_becton%20dickinson Automatizovaný „microsampler“ systém cytek K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Universal Loader - Lab Image https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSG6MDDEyKW2lrEy-4pYcbhalq94g7mws3iCujkWC8szVo IZvRtvw The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis [USEMAP] http://www.stanford.edu/group/nolan/ •Garry Nolan • • Peter Krutzik • • •„Fluorescent cell barcoding“ Fig 1 full size •Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie > Fig 3 full size •Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Get the best out of your model FACS-based surface screen: •validated antibodies in 96w plates •several comercially available possibilities, we have gone for… - LEGENDScreen HUMAN 332 PE conjugated antibodies + ISOs - LEGENDScreen MOUSE 252 PE conjugated antibodies + ISOs • • -there are XY vials in LN -price of kit ≈ 1000 € (27k Kc) How to get the best of it all? Fluorescent barcode possibility 1 – fluorescent proteins - which, how many, isn’t it too laborous w/out lentiviral TXF? - possibility 2 – amino-reactive probes, lipophilic dyes… - how to choose the right one? Final workflow The optimal concentation issue nHOW TO TEST IT: n10x serial dilution n n nREQUIREMENTS: n noptimal resolution ncompatibility w/ PE n n Sample results I nEpCAM n- marker of epithelial cells n- commonly lost during EMT Sample result Cytometric bead array (CBA) nMultiplexed Bead-Based Immunoassays nflow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results •ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 Microspheres can be immobilized with capture molecules and immunoassays can be performed. (A) Coupling reactions for microspheres: Microspheres with functional groups (carboxyl‐, thiol‐) can be used for immobilizing peptides, proteins, or amino group‐functionalized molecules; alternatively, streptavidin‐functionalized microspheres can be applied for biotin‐labeled capture molecules. (B) Standard capture sandwich assay: An individual assay involving an optically encoded microsphere immobilized with a specific capture molecule (antibody) is being carried out on the particle. After sample incubation, another analyte‐specific antibody (a so‐called detection antibody, which is biotinylated and usually recognizes epitopes that are different from that of the capture antibodies) is then applied to the reaction. The presence and quantity of the reporter tag (e.g. strepavidin‐phycoerythrin) allows the precise quantification of the reactions that occur. © This slide is made available for non-commercial use only. Please note that permission may be required for re-use of images in which the copyright is owned by a third party. CBA CBA nmultiplexing capabilities nspeed nincorporation of multiple assay formats nrapid assay development and reasonable cost nautomation ex vivo flow cytometrie - limitace nOvlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků); nneumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí; ndalší: –nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); –časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); –diskontinuita odebíraných vzorků. •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – základní principy nZobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti. nVizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery. nDetekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. n •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – bez značení nNahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu. nPříklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM) nLimity: hloubka tkáně. nTDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. n n •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging nThe photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů nDetekce fotoakustických a fototermálních jevů •Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky n„High-throughput“ průtoková cytometrie … n … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array n sortrování chromozómů n aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých nin vivo průtoková cytometrie •Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. 1.vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie • …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 2.znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 3.mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 4.rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie