Metody detekce buněčné smrti (apoptózy) s využitím průtokové cytometrie RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. Analytická cytometrie 2018 Apoptóza - geneticky kontrolovaný komplexní proces, cílená sebedestrukce buňky - obrovský význam ve vývoji a udržení homeostáza mnohobuněčného organismu -charakteristické biochemické a morfologické znaky Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Morfologie – nekróza vs. apoptóza • ztráta integrity plazmatické membrány • bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky • rozbití jádra • desintegrace buněčných organel • kompletní lyze buňky • bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena • zmenšení velikosti buňky • kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu • udržení integrity intracelulárních organel • formace tzv. apoptotických bodies Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Biochemie – nekróza vs. apoptóza • Většinou bez účasti specifických molekul • Pasívní proces bez dodání energie z ATP • Neregulovaná destrukce jaderné DNA • Není specifická role mitochondrií • Ztráta regulace iontových rovnováh • Aktivace specifických molekul – kaspázy, nukleázy • Nutné dodání energie ve formě ATP • Specifická fragmentace jaderné DNA • Aktivace mitochondrií a volnění specifických regulátorů do cytoplazmy • Změny symetrie membrán Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce buněčné smrti – asymetrie/permeabilita plazmatické membrány Translokace fosfatidylserinu Průtoková cytometrie Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Annexin-V assay Detekce asymetrie Plazmatické membrány • Phosphatidylserin (PS) – fosfolipid v plazmatické membráně, důležitý v regulaci řady strukturních a funkčních změn v membráně, zapojený v lipidových signálních drahách • v „normální“ buňce je lokalizován na vnitřní straně plazmatické membrány, kde mj. kotví cytoskeletární proteiny k lipidovým membránám • Během apoptózy dochází k translokaci PS z vnitřní strany plazmatické membrány na stranu vnější, což je důsledkem změny morfologie a modulace cytoskeletu během apoptózy • PS translokovaný na povrch buňky je signálem pro fagocyty, tzv.”eat me signal” PS Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 annexin V – protein, který má schopnost vázat fosfolipidy, s vysokou afinitou pro PS, vazba závislá na vápníku • citlivá próba pro detekci PS • conjugace s fluorescenčními próbami (FITC, PE atd.) – vizualizace vazby/přítomnosti PS Annexin V staining – detekce PS Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Annexin V se váže na PS u apoptotických i nekrotických buněk! - je to díky tomu, že u nekrotických buněk je porušená integrita plazmatické membrány,a proto značený annexin V proniká do buněk a váže se k PS na vnitřní straně plazmatické membrány Je proto klíčové: rozlišit mezi apoptotickými a nekrotickými buňkami, které jsou obojí pozitivní pro vazbu značeného annexinu V Test integrity plazmatické membrány - barví se nekrotické buňky, ne však buňky apoptotické - např. využití propidium jodidu Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 extracellular cytoplasmic extracellular cytoplasmic phosphatidyl- serine Annexin V- conjugate normal cell apoptotic cell extracellular cytoplasmic necrotic cell PIPIPI annexin V propidium iodide staining - - + - + + Annexin V staining: phosphatidylserine exposure Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Annexin V/PI assay www-abdserotec.com Důležitost správného načasování analýzy (apoptóza, nekróza, sekundarní nekróza) control Apoptosis inductor Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce translokace PS • Výhody: – specifický znak apoptózy, relativně časný – možnost kombinace s detekcí povrchových CD antigenů nebo dalších parametrů apoptózy • Limitace: – je nutné během analýzy odlišit mrtvé buňky – optimalizace koncentrace PI pro daný typ buněk (současné vs. následné přidání PI) – po nabarvení nutná rychlá detekce – není možné analyzovat fixované vzorky – adherentní buňky opatrně trypsinizovat Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce buněčné smrti – změny na úrovni aktivace kaspáz Průtoková cytometrie Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Kaspázy - Cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazmě, štěpení – aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty“ a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy - struktura: - Prodoména - Katalytické podjednotky – velká a malá (heterotetramer) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 (Vaculova et al., 2008) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 www.rsc.org/ej/NP/2001/A909080K/ Activace pro-kaspáz Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Methods in Enzymology, 2008;442:157-81. Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 • Využití specifických protilátek, které: – rozpoznávají nově vzniklá místa (neoepitopy) v proteinových fragmentech vzniklých při aktivaci (štěpení) kaspázy – nereagují s nenaštěpenými prokaspázami, pouze selektivně s aktivní formou enzymu – jsou buď přímo konjugované s fluorochromy, nebo nekonjugované (nutnost následně použít fluorescenčně značené sekundární protilátky) Před přidáním protilátky k buňkám je nutné je permeabilizovat, po skončení inkubace je potřeba odmýt nenavázané protilátky Detekce štěpení kaspáz Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Jurkat cells, anti-Fas antibody (Vaculova, Zhivotovsky, 2007) www.cellsignal.com Detekce aktivní formy kaspáz Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 • Poly(ADP)ribose polymerase (PARP) • Jaderný protein (113 kDa), opravy DNA - inaktivace PARP blokuje opravu DNA, posílení fragmentace DNA • Během apoptózy specificky štěpený na fragmenty 89 a 24 kDa, citlivý marker pro detekci apoptózy – substrát kaspázy -3, -6, -7 – rutinní detekce fragmentů pomocí Western blotu / IHC – analýza na průtokovém cytometru pomocí protilátek proti štěpeným fragmentům • PARP (p25; p89) Detekce endogenních kaspázových substrátů - PARP Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Jurkat cells, etoposide, ctrl, iso ctrl 113 89 PARP 40b-actin http://www.epitomics.com/technology/parp1_intro (Bao J et al. , 2002) Detection of PARP cleavage Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce endogenních kaspázových substrátů – cytokeratin 18 (CK18) • Cytokeratin 18 – Složka cytoskeletu, intermembránová filamenta epitheliálních buněk • pozor! – použití metody omezeno pouze na buňky epitheliálního původu – normální i nádorové; ne však např. krevní, nervové; ale – výhoda - využití při monitorování buněk karcinomu v krvi pacientů po terapii – Štěpení během apoptózy - kaspázy-3, -6, -7, -9 – detekce specifického fragmentu (nový epitop) pomocí M30 Cytodeath™ protilátky (konjugovaná s fluorochromy, nekonjugovaná – nutnost značené sekundární protilátky) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 http://www.peviva.se/prod/prod.php?key=M30%20CytoDEATH%20antibody HeLa cells treated with TRAIL + CHX, M30 cytodeath (www.enzolifesciences.com) HCT116 cells treated with TRAIL M30 cytodeath (Vaculova, Zhivotovsky, 2007) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce štěpení CK18 • Výhody: – jednoduchý protokol - standardní intracelulární imunodetekce – možnost kombinace s detekcí dalších intracelulárních antigenů • Limitace: – buněčná specifita (CK18 – epitheliálni buňky) – obtížná kombinace analýzy s detekcí povrchových antigenů – nemožná kombinace s analýzou vitálních funkcí Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce buněčné smrti – změny na úrovni DNA/jádra Analýza fragmentace DNA – sub G0/G1 populace – TUNEL Průtoková cytometrie Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza subdiploidní populace (barvení DNA) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2 M DNA Analysis DNA content C o u n t 2N 4N Cell Cycle and cell death Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD subG0 G1 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza subG0/G1 populace + popis protokolu Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza subG0/G1 populace - extrakce nízkomolekulárních fragmentů pomocí citrátového pufru Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza subG0/G1 populace Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza subG0/G1 populace • Výhody: – rychlá a levná analýza – analýza možná zároveň s detekcí buněčného cyklu – lze použít jakoukoliv značku vázající se na DNA • Limitace: – omezená specificita – subG0 populace je detekovatelná i u mechanicky poškozených buněk – extrakce nízkomolekulárních fragmentů DNA závisí na protokolu zpracování buněk – buňky umírající apoptózou z G2 fáze je obtížné detekovat – nelze považovat za specifickou metodu detekce apoptózy Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analýza zlomů DNA (modifikované dNTPs) TUNEL Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Apoptóza a štěpení DNA – TUNEL assay - apoptóza – aktivace endonukleáz – charakteristické štěpení DNA - Přítomnost zlomů DNA, vznik fragmentů různé velikosti, volné 3´-OH konce DNA - detekce specifických zlomů – významný marker apoptózy TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) (modified deoxyuridine triphosphate nucleotides) - 3´-OH konec jedno- nebo dvouřetězcových zlomů DNA je označen modifikovaným analogem báze pomocí TdT - vizualizace přímá – dUTP přímo značený fluorescenčně (FITC-dUTP) nepřímá – inkorporace modifikovaných dUTPs, ty jsou specificky rozpoznávány fluorescenčně značenou Ab (např. anti-BrdU Ab) •deoxynucleotidyl transferase (TdT), katalyzuje kovalentní připojení modifikovaných nukleotidů k 3´-OH konci DNA, nezávisle na templátu Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Fluorescein-12-dUTP FITC-dUTP Terminal transferase CoCl2 In situ end labeling (TUNEL) DNA damages TUNEL: DNA fragmentation Značené nukleotidy – přímá konjugace dUTP s fluorochromy s různými spektrálními vlastnostmi -Fluorescein -Texas red -Cyanine -BODIPY etc. Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Addition of the deoxythymidine analog 5-bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate (BrdUTP) to the TdT reaction serves to label the break sites. Once incorporated into the DNA, BrdU can be detected by an anti-BrdU antibody using standard immunohistochemical techniques (Darzynkiewicz et al., 2008) BrdUTP-based detection of DNA fargmentation Citlivější než přímé značení dUTP Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 TUNEL Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 0 200 400 600 800 1000 Propidium Iodide (FL2-Area) HL60_etoposide 0 200 400 600 800 1000 Propidium Iodide (FL2-Area) HL60_etoposide Průtokový cytometrFluorescein(FL-1H) Fluorescenční mikroskop TUNEL Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 TUNEL • Výhody: – vysoká citlivost, specificita – současná analýza detekcí buněčného cyklu, určení, ze které fáze buňky přednostně umírají • Limitace: – relativně náročný protokol (finančně a časově) – spotřeba relativně velkého množství buněk – některé druhy fixace mohou u určitých buněk vést k artefaktům – nevhodné pro buňky, u nichž během apoptózy nedochází k nízkomolekulární fragmentaci DNA Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Detekce buněčné smrti – změny na úrovni mitochondrií Mitochondriální membranový potenciál Detekce exprese/aktivace proteinů rodiny Bcl-2 Vylití cytochromu c z mitochondrií Průtoková cytometrie Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Mitochondrie a apoptóza • Důležitá úloha mitochondrií v regulaci apoptózy • Klíčové regulátory v mitochondriích proteiny rodiny Bcl-2 • Změny na úrovni mitochondriální membrány – membránový potenciál, tvorba pórů • Uvolnění proapoptotických proteinů z mitochondrií – cytochrom c, AIF, endoG, Smac/DIABLO, Omi Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Mitochondriální membranový potenciál • Mitochondrie – centra buněčné respirace, elektrontransportní řetězec ve vnitřní mitochondriální membráně, redoxní potenciál, translokace protonů (H+) z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru mitochondrií – Elektrochemický protonový gradient napříč vnitřní mitochondriální membránou (nutný pro tvorbu ATP) – Rozdíl napětí, elektrického potenciálu mezi vnitřní a vnější stranou vnitřní mitochondriální membrány (150-180 mV) • nerovnoměrné rozdělení volných kationtů a aniontů na obou stranách membrány DYm e- H+ Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Mitochondrie, DYm a apoptóza Depolarizace mitochondriální membrány a ztráta DYm je důsledek otevření „permeability transition pores“ (PTP) nebo narušení integrity vnější mitochondriální membrány Depolarizace mitochondrií je spojena s: • ischemií/reperfúzí • oxidativním stresem • buněčnou smrtí Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Měření MMP • Přímé měření – elektrody • Nepřímé měření – Neinvazívní lipofilní kationické próby • radioaktivně značené • fluorescenční - neinvazívní – netoxické pro živé buňky - lipofilní – snadný transport přes lipidovou membránu - kationické – akumulace v místě s negativním nábojem Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate (TMRE) Akumulace TMRE v mitochondriích závisí na MMP cellnumber TMRE staining Mitochondrial membrane potential low high DYm Control Anti-Fas 2 hours Jurkat cells ex./em. = 551/576 nm Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Jurkat - ctrl Jurkat leukemia cells, anti-Fas antibody (2 h) TMRE TMRE Jurkat - ctrl 2.40.8% 16.51.1% * Jurkat - ctrl Jurkat – anti-Fas Jurkat – anti-Fas TMRETMRE HT-29 colon cancer cells, TRAIL (4 h) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 JC-1 • 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide JC-1 Monomer Em.: 527 nm green J-aggregate Em.: 590 nm red REVERZIBILNÍ nižší MMP vyšší MMP Cossarizza, A. (1998), Purdue Cytometry CD-ROM Volume 3 Ex.: 488 nm Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Apoptotická buňka má snížený MMP ve srovnání s buňkou normální JC-1 Monomer Em.: 527 nm green J-aggregate Em.: 590 nm rednižší MMP vyšší MMP Ex.: 488 nm www.invitrogen.com Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Měření MMP • Výhody: – rychlá a nenáročná metoda, relativně levná – snadné odlišení buněčných populací – možné kombinovat s detekcí řady dalších vitálních funkcí • Limitace: – specificitu nutno potvrdit další metodou – nelze považovat za specifickou metodu detekce apoptózy – vhodná koncentrace próby, pH Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Proteiny rodiny Bcl-2 • Klíčové regulátory apoptózy na úrovni mitochondrií • Proapoptotické a antiapoptotické, tvorba homo- a heterodimerů, důležitost rovnováh • Stanovení množství celkového nebo aktivního proteinu – s využitím specifických protilátek pomocí průtokové cytometrie • např. Bax protein Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Bax protein activation control apoptosis inductor Bax activation Bax activation Specific anti-active Bax antibody mouse anti-Bax (BD556467, clone 6A7, Becton Dickinson) - healthy cells - Bax as a soluble monomeric protein, diffusely distributed in the cytoplasm - apoptotic cells - Bax undergoes conformational changes (dissociation of its termini, exposing previously occluded epitopes) allowing recognition of the active form by conformation-specific antibodies Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Release of apoptogenic proteins from mitochondria Cytochrome c release • Detection by antibodies specifically recognizing cytochrom c (mitochondrial and/or cytoplasmic) – Flow cytometry • Quantification of cells with released cyt c – Western bloting • Cellular fractionation, and immunodetection – Fluorescence microscopy • Visualisation of cytochrome c in the cytoplasm Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 (Waterhouse, Trapani, 2003) Cytochrom c release Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 (Waterhouse, Trapani, 2003) Cytochrom c release Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Vylití cytochromu c z mitochondrií SW620 cells, actinomycin D (30 ug/ml, 24 h) Skender, Vaculova (unpublished data) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Jakou metodu detekce apoptózy použít? • více než jednu; nikdy nedělat celkové závěry postavené pouze na detekci jednoho parametru apoptózy • principielně odlišnou (např. aktivita kaspázy + jaderná morfologie) • v závislosti na buněčném typu (např. detekce CK18 atd.) • a experimentálním zásahu (koncentrace a doba působení studovaného induktoru apoptózy) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 • Absolutní počty (%) apoptotických buněk se mohou lišit v závislosti na typu metody/parametru; je vždy nutné uvést, jaká metoda byla použita, nemluvit pouze obecně o % apoptotických buněk • Správné načasování detekce – brát ohled na kinetiku buněčné smrti, homogenitu/(a)synchronizaci buněčné populace, stádia buněčné smrti atd. – doba trvání „časového okna“, kdy je možné zachytit určitý znak se liší (!) • u jednotlivých buněčných populací • v závislosti na induktoru buněčné smrti • v závislosti na konkrétním znaku který detekujeme (metodě) • různé buňky ze stejné populace mohou umírat různým způsobem smrti • in vitro vs. in vivo Čemu dále věnovat pozornst při detekci apoptózy? Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 1.8 0.5% 17.1 0.4% * 2.40.8% 16.51.1% * 1.70.4 % 25.72.5% * Štěpení CK18MMP Apo2.7 TUNEL Apoptóza indukovaná TRAILem u buněk HT-29 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 cytoskeleton and plasma membrane mitochondria nucleus Cells (%) CK 18 PS Apo2.7 MMP TUNEL DAPI control 1.7 4.0 1.8 2.4 0.2 2.8 TRAIL 25.7 26.3 17.1 16.5 0.3 15.0 Modelový experiment: Srovnání vybraných metod detekce apoptózy na zvoleném modelu nádorových buněk tlustého střeva HT-29 po treatmentu s TRAILem 100 ng/ml, 4h Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Vícebarevné analýzy průtokové cytometrie - Současná detekce několika parametrů apoptózy - Ideální přístup pro komplexní studium buněčné smrti Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Live Dead Fixable dead cell stain kits (Invitrogen) - react with cellular proteins (amines) - cannot penetrate the intact cell membrane - live cells – stain only surface amines – dim staining - dead cells – stain both surface and intracellular amines – bright staining (>50-fold) - covalent binding, well preserved, stable, resistant to following fixation and washing steps… - multiple color available for major lasers, excellent for multicolor staining - does nor interfere with surface antibody binding - do not use with BSA… live dead Thermo Fisher Scientific Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Shrnutí přednášky Z dnešní přednášky byste měli vědět: • jaké jsou hlavní charakteristiky procesu apoptózy a jak je lze využít při detekci specifických parametrů apoptózy • jakým způsobem detekovat apoptózu na průtokovém cytometru na různých úrovních v buňce: změny na úrovni kaspáz, membrány, jádra, mitochondrií • principy, výhody a limitace jednotlivých metod • jakými kritérii se řídit při výběru metod detekce apoptózy a interpretaci získaných výsledků • konkrétní příklady vícebarevných analýz – současná detekce několika parametrů apoptózy na průtokovém cytometru (+ jejich výhody) Analytická cytometrie, Hyršlová Vaculová 2018 Děkuji za pozornost! Vaše případné dotazy směřujte na adresu: vaculova@ibp.cz RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno