INTERPRETACE
HMOTNOSTNÍCH SPEKTER
Lubomír Prokeš
Hmotnostní spektrometrie
Rozlišovací schopnost (rozlišení, R)
= schopnost rozlišit hmotnostním spektru dva píky s velmi blízkými (ΔM) hodnotami
m/z.
A/ definice založená na šířce jednoho píku (univerzální) - poměr hmotnosti iontu m a
šířky tohoto iontu Δm v polovině jeho výšky (Full Width at Half Maximum, FWHM).
B/ definice založená na překryvu dvou píků - poměr hmotnosti iontu m1 a rozdílu iontů
m1 a m2 s jednotkovým nábojem, přičemž oba píky musí být stejně vysoké, údolí mezi
píky je 10% (tj. překrývají se z 10%) a mají jednotkový náboj. Používané zejm. u
magnetických analyzátorů.
Hmotnostní spektrum (nízké rozlišení)
= sloupcový diagram intenzita vs. m/z, nomalizovaný na maximální intenzitu (100 %)
Pro jednotlivé analyty jsou definovány:
Molekulový pík: reprezentuje molekulový ion-radikál M+·
M + e- = 2e- + M+··
Fragmentové píky: reprezentují ionty vznikající fragmentací molekulového ion-radikálu
(M – X)+
Základní (base) pík: nejintenzivnější pík ve spektru (100 %)
Izotopové píky: důsledek přítomnosti stabilních izotopů přírodě, zejm. (M+1)+· a/nebo
(M+2)+·
= graf intenzita vs. m/z, absolutní intenzity nebo intenzity nomalizované na maximální
intenzitu (100 %)
Hmotnostní spektrum (metody s vysokým rozlišením)
Fullerenes >100 ppm
LDI - TOF MS
Exaktní hmotnost (exact mass ): lze ji získat součtem hmotností jednotlivých izotopů
molekuly. Např. exaktní hmotnost vody obsahující dva 1H a jeden 16O je 1.0078 + 1.0078
+ 15.9949 = 18.0105. Pokud nejsou specifikovány izotopy, vztahuje se k nejrozšířenějším
z nich. Též monoizotopická hmotnost (monoisotopic mass).
Nominální hmotnost (nominal mass): pro prvek hmotnost stabilního isotopu
převažujícího v přírodě, pro molekulu je nominální hmotnost sumou nominálních
hmotností jednotlivých atomů. Např. uhlík má 2 stabilní isotopy 12C zastoupený v přírodě
98.9% a 13C zastoupený 1.1%. Nominální hmotnost uhlíku je 12.
Pro jednotlivé analyty jsou definovány:
Průměrná hmotnost (average
mass): získává se součtem
průměrných atomových hmotností
jednotlivých prvků. Např. průměrná
hmotnost vody H2O je 1.00794 +
1.00794 + 15.9994 = 18.01528.
Nejvíce zastoupená hmotnost
(most abundant mass): hmotnost
molekuly s nejvíc v přírodě
zastoupenou distribucí izotopů.
Spojení se separačními
metodami
Spojení se separačními
metodami
GC-MS
Knihovny spekter
EI: pro energii 70 eV
Pouze po EI
GC-MS
Ne všechny sloučeniny jsou přítomny
v databázi
Vliv pozadi u malých píků
MSn fragmentace
Tandemová hmotnostní spektrometrie
Fragmentační
stromy
Izotopový pattern
Izotopy v přírodě
Izotopový pattern
A prvky: pouze jeden izotop (H, F, P, I, As).
A+1 prvky: následující těžší izotop vzdálen o 1 m/z (C, N).
A+2 prvky: : následující těžší izotop vzdálen o 2 m/z (O, Si, Cl, Br, S).
kokain
M = 303.35 g/mol
d3 kokain
M = 306.38 g/mol
Deuterované molekuly
= používají se ke studiu metabolismu.
ABr = 79.9 g/mol
ACl = 35.45 g/mol
View original version
Kontaminace vzorků a “ghost” píky
“krvácení” kolony (bleeding)
(5MS Methylpolysiloxan)
Silyl deriváty
Pokud je 100 . (M+2)/M < 3% pík M nemůže obsahovat nejčastější izotopy Si, S, Cl a Br.
K vizualizaci lze využít poměy resp. grafy M vs. M+2, M+1 vs. M+2, M+2 vs. M+3, apod.
Cmax = 100 . (IM+1)/(1.1 . IM)
Toluen, C7H8
M = 92.14 g/mol
Cmax = 100 . (6.1)/(1.1 . 76.3) = 7.27
Salicylaldehyd, C7H6O2
M = 122.12 g/mol
Cmax = 100 . (7.9)/(1.1 . 100) = 7.18
p-nitro acetofenon, C8H7NO3
M = 165.15 g/mol
Cmax = 100 . (1.6)/(1.1 . 18) = 8.08
Kyselina tereftalová, C8H6O4
M = 166.13 g/mol
Cmax = 100 . (7.9)/(1.1 . 86) = 8.35
methyljodid, CH3I
M = 141.94 g/mol
Cmax = 100 . (1.1)/(1.1 . 100) = 1
A+2 píky
A+1 píky
Maximální počet atomů uhlíku
Molekulový pík
Stabilita molekulového píku
styren M = 104 g/mol
4-methyl undekan M = 170 g/mol
Ionty jsou stabilizovány zejm.
konjugací násobných vazeb a
aromatickým systémem vazeb.
Stabilita molekulového
píku
Tropyliový ion
Metoda nízké voltáže
Ethylacetát
M = 88 g/mol
1,1-dimethyl-2-(trimethylsilyl)hydrazin
M = 182 g/mol
= postupné snižování energie ionizujících elektronů až
na hodnotu ionizačních energií přítomných látek.
Intenzity fragmentových iontů se budou postupně
snižovat až ve spektru zůstanou pouze molekulové píky.
Derivatizace
Zvýšení těkavosti (GC)
Snadnější identifikace látek
(kyseliny vs. estery)
Silylace
Alkylace
Určení polohy dvojné vazby
Adice dimethyldisulfidu
Molekulový ion-radikál M+·má ve spektru nejvyšší hmotnost, pokud nepočítáme izotopové
ionty. Neplatí to pro některé ionizační techniky, kdy vznikají ionty aduktů –
pseudomolekulání ionty.
A. EI s chemickou ionizaci
B. měké ionizační techniky ESI, MALDI, APCI, aj.:
adukty s H+, Na+, K+, H2O, CH3OH, …
C. EI pokud je v iontovém zdroji vysoká koncentrace
molekul, dochází k rekombinacím.
Pseudomolekulární píky
Relativní důležitost píků
Molekuly obsahující běžné prvky kromě dusíku (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I) mají sudou
hodnotu m/z molekulového píku. Pro molekuly obsahující dusík platí tzv. „dusíkové pravidlo“.
2-propanol,
M = 60 g/mol
Nedostatek významných sudých iontů, především pro nízká m/z, indikuje sudou molekulovou
hmotnost.
Dichlorvos
C4H7Cl2O4P
M = 220.98 g/mol
X
Molekulový pík je sudý !!!
Toluen, M = 92.14 g/mol
Molekulový pík
Číselný rozdíl mezi
předpokládaným molekulovým
píkem a nejbližším píkem
fragmentového iontu nesmí být
5 až 13 m/z. Pokud není tato
podmínka splněna,
1. uvažovaný pík není píkem
molekulovým
nebo
2. jde o spektrum směsi
různých látek
Fragmentové píky
McLaffertyho přesmyk
Stabilita aromatických iontů
Stevensonovo pravidlo
Dochází-li k fragmentaci, zůstává
kladný náboj na fragmentu s
nejnižší ionizační energií.
Harison A. G. et al., Org. Mass
Spectrom. 5, 1971, 1313-1320.
2,6-Dimethyl-2-hepten
M = 126.24 g/mol
Pravidlo sudého elektronu (even-electron rule)
Ionty se sudým počtem elektronů (kationty, ale ne ion-radikály, closed-shell ions) se
rozpadají na ionty se sudým počtem elektronů ztrátou neutrální molekuly (ne radikálu).
Ionty s lichým počtem elektronů (ion-radikály, open-shell ions) ions se rozpadají ztrátou
radikálu za vzniku iontu se sudým počtem elektronů (kationtu) nebo neutrálního fragmentu za
vzniku iontu s lichým počtem elektronů (ion-radikálu).
Karni M., Mandelbaum A. Org. Mass Spectrom. 15, 1980, 53-64
Výjimky v důsledku aromatické stabilizace.
Fragmentové ionty
Ztráty neutrálních molekul a radikálů
Určení sumárního vzorce
Určení sumárního vzorce
http://mzmine.github.io/
http://www.mmass.org/
Molecular Weight Calculator, by Matthew Monroe
https://omics.pnl.gov/software/molecular-weight-calculator
https://www.bioconductor.org/
https://cran.r-project.org/
https://www.bioconductor.org/
NOPS all > 1 N< 10, O < 20, P < 4, S < 3
NOP all > 3 N < 11, O < 22, P < 6
OPS all > 1 O < 14, P < 3, S < 3
PSN all > 1 P < 3, S < 3, N < 4
NOS all > 6 N < 19 O < 14 S < 8
Heuristické metody
Multiple element count restriction for compounds < 2000 Da, based on the examination of the Beilstein database
and the Dictionary of Natural Products
Heuristika = zkusmé řešení problémů, pro něž neznáme algoritmus nebo
přesnější metodu. Heuristické řešení je často jen přibližné, založené na
poučeném odhadu, intuici, zkušenosti nebo prostě na zdravém rozumu.
1 < nC < N
0 ≤ nH ≤ 2nC + 2
0 ≤ nO ≤ 2nC
nH ≤ 2nC + 2nN + 2
nO ≤ 2nC + 2nN + 2
nH + nN + nx = sudé číslo
nN < N
nH < 2nC + 2nN + 2 - nx
nO < 2nC + nN
Kind T., Fiehn O. : BMC Bioinformatics 8, 2007, 105.
Hydrogen/Carbon ratio (H/C) for 42,000 diverse molecules (containing C, H, N, S, O, P, F, Cl, Br, I, Si) taken from the Wiley
mass spectral library.
Element ratios Common range (covering 99.7%) Extended range (covering 99.99%) Extreme range (beyond 99.99%)
H/C 0.2–3.1 0.1–6 < 0.1 and 6–9
F/C 0–1.5 0–6 > 1.5
Cl/C 0–0.8 0–2 > 0.8
Br/C 0–0.8 0–2 > 0.8
N/C 0–1.3 0–4 > 1.3
O/C 0–1.2 0–3 > 1.2
P/C 0–0.3 0–2 > 0.3
S/C 0–0.8 0–3 > 0.8
Si/C 0–0.5 0–1 > 0.5
Heuristické metody
Heuristické metody
Mass Range [Da] Library C max H max N max O max P max
< 500 DNP 29 72 10 18 4
Wiley 39 72 20 20 9
< 1000 DNP 66 126 25 27 6
Wiley 78 126 20 27 9
< 2000 DNP 115 236 32 63 6
Wiley 156 180 20 40 9
< 3000 DNP 162 208 48 78 6
Restrictions for number of elements during formula generation for small molecules based on examination of the
DNP and Wiley mass spectral databases. For each element, the higher count was taken for denominating the
element restriction rule #1
Mass Range [Da] Library S max F max Cl max Br max Si max
< 500 DNP 7 15 8 5
Wiley 10 16 10 4 8
< 1000 DNP 8 16 11 8
Wiley 14 34 12 8 14
< 2000 DNP 8 16 11 8
Wiley 14 48 12 10 15
< 3000 DNP 9 16 11 8
Nízké rozlišení
experiment 280.082 ± 0.003 13.15
C10H16O9 280.07944 11.77
C11H12N4O5 280.08077 14.14
C16H12N2O3 280.08480 18.94
C11H12N4O5
experiment 94 13
C3H2N4 94 43.8
C5H6N2 94 13.1
Vysoké rozlišení
C5H6N2
100 (M+1)/M
100 (M+1)/M
M
M
A+1 píky: srovnání s modelem
Cangrelor, M = 774.94831 Da, chyba měření ± 5% (red box). Molar mass: 776,36 g/mol
Pravidlo 13-ti
M/13 = n + r/13
CnHn+r
u = (n – r + 2)/2
u = stupeň nenasycenosti
(cykly + dvojné vazby)
82/13 = 6.3077 = 6 + 0.3077
n = 6
r = 0.3077 x 13 = 4
u = (6 – 4 + 2)/2 = 2
cyklohexen
C6H10
M = 82.143 g/mol
Bright J.W., Chen E.C.M. : J. Chem. Educ. 60, 1983, 557-558.
pyren
C16H10
M = 202.25 g/mol
202/13 = 15.5385 = 15 + 0.5385
n = 15
r = 0.5385 x 13 = 7
u = (15 – 7 + 2)/2 = 5
202/13 = 15.5385 = 16 - 0.4615
n = 16
r = - 0.4615 x 13 = -6
u = (16 + 6 + 2)/2 = 12
Pravidlo 13-ti
M/13 = n + r/13
furan
C4H4O
M = 68.07 g/mol
68/13 = 5.231 = 5 + 0.231
n = 5
r = 0.231 . 13 = 3
ue = (5 – 3 + 2)/2 = 2
u = ue + du = ue + 1 = 3
U derivátů uhlovodíků se heteroatomy
nahrazují uhlovodíkovými ekvivalenty:
O CH4 du = 1
N CH2 du = ½
N2 C2H4 du = 1
Cl C2H11 du = 3
C4H4OC5H8
Bright J.W., Chen E.C.M. : J. Chem. Educ. 60, 1983, 557-558.
Kyselina močová
C5H4N4O3
M = 168.11 g/mol
168/13 = 12.923 = 12 + 0.923
n = 12
r = 0.923 . 13 = 12
ue = (12 – 12 + 2)/2 = 1
u = ue + du = ue + (3 .1 + 4 . 0.5) = 6
C5H4N4O3C12H24
CnHn+ru = (n – r + 2)/2
Cykly a násobné vazby
DBE = C - H/2 + N/2 + 1
DBE = C + Si - 1/2(H + F + Cl + Br + I) + 1/2(N + P) + 1
(pouze pro N, S, P v minimálním oxidačním stavu N (-III), S(-II), P(-III))
DBE = 0.5(∑ni.(vi - 2)) + 1
DBE = - a/2 + c/2 + d + 3e/2 + 2f +1
(kde a, c, d, e, f = počet 1, 3, 4, 5 a 6 valentních atomů)
ρ = 0.5 V – N + 1
2ρ = množství atomů H potřebných k nasycení molekuly, N = počet atomů, V = suma valencí
atomů
1. Výpočet z Eulerova vzorce
2. Výpočet z valencí
Badertscher M. et al. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41, 2001, 889-893
Lobodin V. et al. Anal. Chem. 84, 2012, 3410-3416
Pellegrin V. : J. Chem. Educ. 60, 1983, 626-633
Eulerův vzorec
v − e + f = 1
v = počet vrcholů (vertices)
e = počet hran (edges)
f = počet ploch (faces)
V = počet vrcholů (vertices)
E = počet hran (edges)
F = počet ploch (faces)
V - E + F = 2
Transformace do planárního grafu
(Schlegelův diagram)
Lederberg J.: PNAS 53, 1965, 134-139
Eckroth D.R.: J. Org. Chem. 32, 1967, 3362-3365
v − e + f = 1
v = počet vrcholů (vertices)
e = počet hran (edges)
f = počet ploch (faces)
f = e − v + 1
f = tzv. cyklomatické číslo (počet cyklů a násobných vazeb v molekule; jedna trojná vazba
je ekvivalentní dvěma dvojným vazbám)
Cyklické a nenasycené uhlovodíky
Anantha Reddy P. : J. Chem. Educ. 64, 1987, 400.
Rouvray D.H.: J. Chem. Educ. 52, 1975, 768-773.
naftalen
v = 10
e = 16
f = 7
v − e + 0 = 1
v = počet vrcholů (verices)
e = počet hran (edges)
f = počet ploch (faces) = 0
v = e - 1
Stupeň vrcholu grafu (valence vrcholu) = počet hran
zasahujících do daného vrcholu
deg(v1) + deg(v2) + …+ deg(vp) = 2(v – 1)
deg(C) = 4
deg(H) = 1
1 + 1 + 1 + 1 + 4 = 2(4 + 1 – 1)
h + 4c = 2(c + h -1)
h = 2c + 2
Alifatické alkany
Gutman I. : Teach. Math. 11, 2008, 53-61.
„Lewisovo“ oktetové pravidlo (pravidlo 6N + 2)
počet ne-vodíkových atomů = N
počet elektronů v sigma vazbách = 2(N – 1)
počet valenčních elektronů = V = Σ číslo skupiny atomu – náboj
počet valenčních elektronů v jednoduchých vazbách necyklické
Lewisovy oktetové struktury = A = 8N – 2(N – 1) = 6N + 2
A = 6 x 5 + 2 = 32
V = 4 x 4 + 6 x 1 + 1 x 4 – 0 = 26
EB = (A – V)/2 = (32 – 26)/2 = 3
(počet cyklů a dvojných vazeb)
furan
C4H4O
M = 68.07 g/mol
strychnin
C21H22N2O2
M = 334.41 g/mol
A = 6 x 25 + 2 = 152
V = 4 x 21 + 6 x 2 + 5 x 2 + 1 x 22 – 0 =
128
EB = (A – V)/2 = (152 – 128)/2 = 12
(počet cyklů a dvojných vazeb)
Zandler M. E., Talaty E. R. : J. Chem. Educ. 61, 1984, 124-127.
r = t/2 + q + 1
t = počet terciárních atomů kruhu (CH, N, O+)
e = počet kvartérních atomů (C, N+)
r = počet cyklů
t = 4
q = 0
r = 3
v = 10
e = 12
f = 3
fluoranthen
v = 16
e = 27
f = 12
t = 10
q = 6
r = 12
=
Cyklické a nenasycené uhlovodíky
v = 11
e = 16
f = 6
t = 2
q = 4
r = 6
kofein
Shirikrishna A. : J. Chem. Educ. 73, 1996, 428.
Fragmentové píky
Identifikace nepravděpodobných vzorců
C11H21Cl2O2S
Vzorec molekuly obsahuje lichý počet atomů s valencí 1 (H a
Cl), ale neobsahuje žádný atom s valencí 3 (např. N).
=> “dusíkové pravidlo”
DBE = 11 – 6.5 + 1 = 5.5
Pellegrin V. : J. Chem. Educ. 60, 1983, 626-633
DBE = 4 DBE = 4.5
Odštěpením H radikálu se DBE
fragmentového iontu zvýší o 0.5 ,
adicí protonu se DBE o 0.5 sníží.
Patulin
C7H6O4
M = 154.12 g/mol
DBE (M) = 5 DBE (M+H+) = 4.5
Seniorova pravidla
Vychází ze Seniorova teorému z teorie grafů. Podmínky existence molekuly jsou:
1. Suma valencí nebo celkový počet atomů s lichou valencí jsou sudé.
2. Suma valencí je větší nebo rovna dvojnásobku maximální valence.
3. Suma valencí je větší nebo rovna dvojnásobku (Ntot - 1)
Senior J. K.: J. Chem. Phys. 19, 1951, 865-873.
Morikawa T., Newbold B.T. : Chimija 12, 2003, 445-450.
V = 4 x 6 + 5 x 1 + 1 x 15 – 0
= 44
44 > 2 x 5
44 ≥ 2(22 - 1)
Tris(2-chlorethyl)amin
C6H12Cl3N
M = 204,53 g/mol
strychnin
C21H22N2O2
M = 334.41 g/mol
V = 4 x 21 + 6 x 2 + 5 x 2 + 1 x 22
– 0 = 128
128 > 2 x 6
128 ≥ 2(47 - 1)
V = 4 x 1 + 1 x 2 – 0 = 6
6 > 2 x 4
6 ≥ 2(3 - 1)
CH2
Odhad počtu vodíků ze vzorce
nH = počet atomů vodíku
nC = počet atomů uhlíku
nN,P = počet atomů dusíku/fosforu
Nhal = počet atomů halogenů
R = počet cyklů
Db = počet dvojných vazeb
nH = 2 + 2nC + nN,P – nhal – 2(R + Db)
2-(3-pyridyl)-benzimidazol
nH = 9
nC = 12
nN,P = 3
R = 3
Db = 7
succinylsulfathiazol
nH = 13
nC = 16
nN,P = 3
R = 2
Db = 7
S=O se nepočítává
do Db
Feldman A. : Science 133, 1961, 576.
morphin
nH = 19
nC = 17
nN,P = 1
R = 5
Db = 4
Dusíkové pravidlo
Dusík je jediný prvek se sudým M a lichou valencí (P a As mají lichou valenci a lichou M).
Lichý počet atomů s lichou valencí také implikuje lichou hodnotu součtu atomů vodíku a
halogenů.
∑(vi.ni) = 2.konst
Dusíkové pravidlo platí pouze pro neutrální molekuly a ion-radikály, neplatí pro ionty a radikály
= nelze je použít pro fragmentové ionty (po ionty a radikály platí opačná parita.
Pellegrin V. : J. Chem. Educ. 60, 1983, 626-633
Morikawa T., Newbold B.T. : Chimija 12, 2003, 445-450
lichý počet dusíků v molekule => lichá molekulová hmotnost
Vhodné pouze pro spektrometry s nízkým rozlišením.
Nevhodné pro M > 500 Da v důsledku akumulace nenominálních
příspěvků
Platí pro molekuly běžných prvků (C, H, N, O, F,
Si, P, S, Cl, Br, I). Dusík je jediný z těchto prvků
který má sudé atomové číslo a lichou vaznost.
Dusíkové pravidlo
N-methyldiethylamin
M = 87 g/mol
N-isopropyl-N-methylbutan-
1-amin
M = 129.24 g/mol
Compositional
boundaries
Lobodin V. et al. Anal. Chem. 84, 2012,
3410-3416
DBE = C+Si – 0.5(H+F+Cl+Br+I) + 0.5(N+P)+1
nC = 0.07M – 6.9
nC = 0.07M – 14
Heuerding S., Clerc J.
T. : Chemom. Intell.
Lab. Syst. 20, 1993,
57-69
Heuerding S., Clerc J.
T. : Chemom. Intell.
Lab. Syst. 20, 1993,
57-69
HeuerdingS.,ClercJ.T.:Chemom.Intell.Lab.Syst.20,
1993,57-69
Index aromaticity
DBEAI = 1 + nC – nO –nS –0.5nH
CAI = nC – nO – nN –nS –nP
AI = DBEAI / CAI
Kondenzované aromatické látky: AI > 0.67
Aromatické látky: AI > 0.5
kyselina kyanurová
AI = -0.5/-3 = 0.16
acetylen
AI = 2/2 = 1
beta karoten, AI = 13/40 = 0.325
floroglucinol
AI = 1/3 = 0.333
naftalen
AI = 7/10 = 0.70
koronen
AI = 19/24 = 0.79
pyren
AI = 12/16 = 0.75
Koch B. P., Dittmar T: Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 2006, 926-932
Míra oxidace (methylenový ekvivalent)
NORM = „počet dvojelektronových oxidací potřebných syntéze sloučeniny z methylenu“
NORM = počet heteroatomů + počet π-vazeb + počet cyklů - 1
NORM = 9
počet heteroatomů = 4
počet π-vazeb = 5
počet cyklů = 1
NORM = 6
počet heteroatomů = 2
počet π-vazeb = 4
počet cyklů = 1
NORM = 3
počet heteroatomů = 0
počet π-vazeb = 3
počet cyklů = 1
NORM = 3
počet heteroatomů = 2
počet π-vazeb = 2
počet cyklů = 0
Kjonaas R.A. : J. Chem. Educ. 63, 1986, 311-314.
Shibley I. A. et al.: J. Chem. Educ. 87, 2010, 1351-1354.
Van Krevelenův
diagram
Van Krevelenův
diagram
Kendrickův hmotnostní deficit
Kendrick mass = IUPAC mass × (14.00000/14.01565) ~ CH2
Kendrick mass defect = (Kendrick nominal mass - Kendrick exact mass)
= pouze pro MS s vysokým rozlišením
Kendrickův graf
Kendrickův graf
Heatmapa
(vizualizace výsledků
shlukové analýzy)
Metoda hlavních komponent (PCA) a metoda nezávislých komponent (ICA)
Umělé neuronové sítě (ANN)
Literatura
Děkuji za pozornost !!