Luděk Bláha, PřF MU, RECETOX
www.recetox.cz
Správná laboratorní praxe
- poznámky biologické/toxikologické SLP
– Spousta Listů Papíru
GLP - Give me a Lot of Papers
• Průmyslové látky,
produkty
• Kosmetická chemie
•Potraviny / krmiva
+ kontakt s potravinami
•POR (pesticidy)
•Biocidy
•Léčiva humánní
•Léčiva veterinární
Chemické látky („bulk“)
nanonanonanonano
REACH
(ECHA)
PPP
(EFSA)
MPs
(EMA)
§§
§§
WFD – povrch.voda
GWD – podzemní v.
WWTP – odpadní v.
Sedimenty
Půda (SD)
Ovzduší
Odpady
SOIL
AIR
WATER
Negativní vlivy
 vliv na zdraví člověka
 vliv na prostředí
Stresory
- Chemické
- Biologické (patogeny, GMO)
- Fyzikální (záření, hluk...)
Dva mechanismy “řízení” (§§)
1. před uvolněním – registrace
2. v prostředí
Přehled - vybrané otázky v této přednášce
• Zaměření kurzu na dvě hlavní oblasti
– bezpečnost chemických látek (hlavní pozornost)
– GMO (stručný přehled)
• Část 1
– Principy posuzování a řízení kvality prostředí (potravin…)
• tj. retrospektivně (např. kvalita vody)
– Principy řízení vybraných skupin látek
• Průmyslové látky (REACH)
• Pesticidy (Přípravky na ochranu rostlin)
• Léčiva
(nejsou detailně diskutovány další velké skupiny ch. látek – biocidy, kosmetika, potraviny)
• Část 2
• Principy zjišťování bezpečnosti chemických látek
– tj. prospektivně („registrace“)
– Toxicita (zdraví lidí) vs Ekotoxicita (zdraví ekosystémů)
– Biologické modely (in vivo, alternativy)
http://www.mvcr.cz/
Kdo vlastně vyžaduje SLP ? … zákony
Zdraví člověka
principy kontroly a regulace
• Zdraví ovlivňuje řada faktorů, jejichž KVALITA musí být kontrolována
(státem) a důležité je zajistit také “kvalitu” analýz (GLP):
- potraviny, pitná voda, rekreační voda, vnější ovzduší, pracovní ovzduší,
hlučnost, léčiva
- zdravotní péče (vyšetření, analýzy … správná klinická praxe)
• Autority dohlížející na kvalitu = Ministerstva (MZe, MZd, MŽP) a
zřizované ústavy (jejich kompetence a přesahy jsou předmětem diskuze)
– Dozorující a výkonná funkce
• Hygienické stanice
• Státní zemědělská a potravinářská inspekce
• Státní veterinární správa
• SÚKL a ÚSKVBL (viz dále – léčiva)
– Další funkce (např. poradní, analýzy …)
• Státní zdravotní ústav
• Zdravotní ústavy (zpr. krajské)
• Státní veterinární ústav
GLP a zdraví člověka
• Pro každou sledovanou kategorii, tj.:
– Potraviny, Pitná voda, Rekreační voda, Ovzduší
– Zdravotní péče
jsou definovány různé a specifické požadavky na kvalitu
– Chemické rozbory - limity pro vybrané toxické látky (různé
druhy potravin, různé limity): toxické kovy – př. Hg, toxiny plísní,
persistentní látky (polychlorované bifenyly, dioxiny), pesticidy,
nepovolené náhražky
– Mikrobiologická bezpečnost - kultivace nebo jiný průkaz
patogenů (např. metody molekulární biologie – Listerie v
potravinách; sterilita léčiv podávaných intravenózně atd.)
– Další specifické požadavky (prašnost – např. limity pro PM10 =
particulate matter >10mikrometrů; limity pro hlučnost …)
– Lékařská vyšetření a analýzy - např. průkaz rakovinných
biomarkerů, biomarkery v těhotenství, přítomnost HIV …
GLP a zdraví člověka
• Kdo sleduje (odpovídá za) kvalitu ?
– výrobci (voda, potraviny…) + prodejci
– zdroje znečištění (průmysl, čistírny odp. vod …)
• Odpověné osoby musí objednávat zkoušky/rozbory:
• Zajištění rozborů (pokud jde o požadavek zákona)
= akreditované laboratoře
– Vlastní laboratoře přímo u výrobce
– Soukromé laboratoře
– Státní zdravotní ústav, Zdravotní ústavy, Veterinární ústavy …
• Občan, NGO atd může také požadovat/objednat (a následně nejspíš
i zaplatit) rozbory kvality
GLP a zdraví člověka
www.mzcr.cz
Krajské hygienické stanice (www.khsbrno.cz)
www.szpi.gov.cz
www.szu.cz
Zdravotní ústavy (příspěvkové organizace) – např. www.zubrno.cz
Státní veterinární správa
 krajské veterinární správy (dozorující orgány jako KHS)
Státní veterinární ústav (příspěvková organizace MZe)
LIMITY
Jak se odvodí „bezpečné“ limity, které jsou pak
uplatňovány v legislativě?
1 - zdraví člověka
Limity pro (toxické) látky
• Odvození limitů využívá data z konkrétních toxikologických studií
– Využívají se dávky odvozené z toxikologických prací, nejčastěji
• LD50 – odhadnutá (modelovaná) dávka, která je (po určité době expozice ve
standardním – GLP – testu) letální pro 50% organismů (akutní, chronická)
• NOEL (NOAEL) – no observed (adverse) effect level – hladina/dávka látky, která v
konkrétních experimentech nevykazovala žádné (negativní) účinky
• Limity = doporučení zpravidla na nadnárodní úrovni (komise JECFA
FAO/WHO)
• Základní „expoziční limity“
– TDI nebo ADI (tolerovatelný / přijatelný denní příjem),
– PTWI (provizorní tolerovatelný týdenní příjem),
– PMTDI (provizorní maximální tolerovatelný denní přívod)
• (Ekvivalent v USA RfD – referenční dávka)
• Jednotky vyjadřování – µg/kg b.w./day (week)
• Interpretace:
– Denní expozice (odhadnutá v rozpětí až jednoho řádu), která při
celoživotní expozici pravděpodobně nezpůsobí poškození zdraví.
Důležité zkratky - limity
• Potraviny
– TDI / ADI – tolerable / acceptable daily intake
– Léčiva v potravinách – MRL (maximum residual level)
• Pitná voda
– Kromě běžných limitů se uplatňuje také „hazard-based“ přístup pro
koncentrace pesticidů
– Žádný pesticid nesmí být v koncentraci vyšší než 0,01 ug/L
– Arbitrárně (dohodu) stanovený „Threshold of toxicological concern“ (TTC)
• Vnější ovzduší
– Maximální denní limity (např. prachové částice PM10)
• Pracovní prostředí
– Threshold limit value (TLV)
– Permissible exposure limit (PEL)
– Short-term exposure limit (STEL)
– Timeweighted averages (TWA)
– Immediately dangerous to life or health value (IDLH)-
Maximální množství reziduí, které může být denně
přijímáno v potravě člověka bez zdravého rizika.
ADI = NOEL (mg/kg ž.hm.) ∗ standardní váha člověka (kg)
safety factor
No observed effect level z chronické studie toxicity
Př.: Na základě výsledků toxicity po opakované dávce látky valnemulinu je NOEL 8
mg/kg/den; průměrná váha člověka 60 kg:
ADI = 8 ∗ 60 = 4,8 mg/den
100
mikrobiologický NOEL: ADI = 2,7 mg/den
Acceptable Daily Intake (ADI)
Hodnota, která snižuje riziko reziduí pro člověka při extrapolaci výsledků toxicity
ze zvířat na člověka.
Snižuje hodnotu NOEL 10 – 1 000x dle těchto kritérií:
• látky s teratogenním účinkem hodnota 1 000,
• nejsou-li výsledky chronické toxicity SF > 100 nebo 200,
• jsou-li známy údaje z chronické toxicity, pak
SF = 100,
• jsou-li známy výsledky humánních testů SF =10.
Bezpečnostní (safety) faktory / Faktory nejistoty
Uvažují se následující průměrné denní dávky živočišných potravin:
• 500 g masa (300 g svaloviny, 100 g jater, 50 g ledvin, 50 g tuku),
• 1 500 g mléka,
• 100 g vajec,
• 20 g medu.
bezpečná koncentrace (ppm) =
ADI
gramy spotřebované/den
Bezpečná koncentrace (SC – safe concentration)
LIMITY
Jak se odvodí „bezpečné“ limity, které jsou pak
uplatňovány v legislativě?
2 – kvalita prostředí: příklad VODA
EU WFD - rámcová směrnice o vodách
• Cíl EU WFD = dobrý stav vody
– 2 komponenty hodnocení kvality:
„ekologická“ a „chemická“
– Chemická komponenta: 3 seznamy látek
• Seznam prioritních látek
– Dobrá kvalita = koncentrace < NEK
(Normy environmentální kvality, anglicky EQS)
RP-NEK – roční průměrná koncentrace
NPK –NEK – nejvyšší přípustná koncentrace
• Seznam sledovaných látek („watch list“)
• Seznam specifických polutantů
– Dle plánů povodí („river basin specific pollutants)
Seznam prioritních látek EU WFD (výběr, příklady)
Aktuálně (2015) seznam 44 prioritních látek (viz dole)
+ seznam „sledovaných látek“ (watch list)
Odvození limitů
1) Experimentální ekotoxikologie  EC50 a/nebo NOEC z biotestů
2) Extrapolace  odvození PNEC (Predicted No Effect Concentration)
3) Přijetí do legislativy (politické)EQS (Normy environmentální kvality)
Faktory nejistoty pro odvození PNEC hodnot
(Guidance Document EU CIS-WFD No. 27)
Faktory nejistoty - příklady
Dostupná data Assessment
factor
L(E)C50 short-term toxicity tests
NOEC for 1 long-term toxicity test
NOEC for additional long-term
toxicity tests of 2 trophic levels
NOEC for additional long-term
toxicity tests of 3 species of 3
trophic levels
1000
100
50
10 Protection level: 95%
Hodnoty ekotox. EC50 / NOEC
Species sensitivity distribution (SSD)
statistická metoda – zohlední dostupná data
= EC50 více druhů
C. riparius
S. fontanilis
O. kisuth
O. reinhardtii
P. fluviatilis
P. partenog.
P. notatus
H. azteca
N. barablutus
P. promelas
D. pulex
C. dubia
I. punctatus
D. magna
O. mykiss
G. pulex
C. magnifica
C. decisum
0
20
40
60
80
100
1 10 100 1000
dissolved copper (µg/l)
cumulativedistributionfunction
Hazen plotting
Loglogistic fitting
HC5 = 95% protection level
[C]
PNEC (limity, EQS)
Extrapolace pomocí faktorů (příklady)
 odvození PNEC = bezpečná koncentrace
 nastavení „limitů“ (EQS – environmental quality standards)
Bezpečnost průmyslových
chemických látek
Jsou nebezpečné/toxické látky regulovány ?
• Do nedávna – povinnost průmyslu prokazovat
bezpečnost chemikálií velmi nepřehledná
• Řada různých (protichůdných) regulací
• Současnost
– EU = sjednocení – nová legislativa REACH
– USA, Japonsko, Canada atd. – podobný vývoj
• Kromě toho existují direktivy pro specifické skupiny
chemických látek
– Léčiva
– Pesticidy
– Biocidy
– Kosmetické látky
• REACH = Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals
REACH - REGULACE chem. látek v EU
• Evropská unie - ECHA (European Chemical Agency)
http://echa.europa.eu/
REACH - REGULACE chem. látek v EU
INNITIAL ESTIMATED NUMBER OF
PHASE-IN SUBSTANCES: 30,000
REGISTERED SUBSTANCES IN ECHA
(data from 31st March 2011)1 : 2,452
[1 ECHA, Information on registred substances: http://apps.echa.europa.eu/registered/registered-sub.aspx
REACH - REGULACE chem. látek v EU
• Všechny chemikálie vyráběné nebo dovážené do EU musí
být registrovány, zhodnoceny (testovány) a autorizovány
(náklady nese průmysl)
• Zhodnocení rizik – cca 30000 chemikálií
– harmonogram dle důležitosti (nejdříve HVP - High Volume Production
chemicals > 1000 t/rok, postupně ostatní
• Hodnocené parametry (požadovány “kvalitní” výsledky –
zajištění dle GLP apod.)
– Fyz.chem. vlastnosti + degradabilita, persistence
– Toxicita pro člověka
– Nebezpečnost pro prostředí = ekotoxicita
• Definování látek s velkým významem
REACH - REGULACE chem. látek v EU
• Látky s velkým významem (nebezpečnost) - Annex XIV
– SVHC = Substances of Very High Concern
• Toxický pro reprodukci
a/nebo Karcinogenní
a/nebo Mutagenní
a/nebo PBT (Persistentní Bioakumulativní Toxický)
a/nebo vPvB (velmi P velmi B)
 potenciální zákaz! Nesmí jít na trh a být užívány
1) Candidate list: 22 látek (2014) – musí být zhodnoceny
http://echa.europa.eu/chem_data/authorisation_process/candidate_list_table_en.asp
2) ECHA doporučuje („recommendiation“) Evropské komisi
zákaz vybraných látek
REACH - REGULACE chem. látek v EU
http://echa.europa.eu/addressing-chemicals-of-concern/authorisation/recommendation-for-inclusion-in-the-
authorisation-list
REACH - testování
REACH - testování
Přípravky na ochranu rostlin
(pesticidy)
Zákon o rostlinolékařské péči – Z. 326/2004 Sb
• Tento zákon upravuje práva a povinnosti fyzických a právnických
osob, týkající se
– ochrany rostlin a rostlinných produktů proti škodlivým
organismům a ochrany proti zavlékání organismů škodlivých
rostlinám nebo rostlinným produktům do České republiky
– registrace, uvádění na trh, používání a kontroly přípravků na
ochranu rostlin,
– omezování nepříznivého vlivu použití přípravků a dalších
prostředků na zdraví lidí, zvířat a na životní prostředí,
• POR – Přípravky na ochranu rostlin
– Lidově „pesticidy“, z hlediska zákona se odlišují „biocidy“ a také léčivé
přípravky („př. antiparazitika“)
– Podobně jako léčiva – bioaktivní látky s vysokým potenciálem vedlejších
účinků
• Prováděcí vyhláška: Vyhláška č. 32/2012 Sb., o přípravcích a
dalších prostředcích na ochranu rostlin
Označování POR
Fundazol 50 WP
Obchodní název
Obsah účinné složky (%)
Zbytek do 100% - přídatné látky
benomyl – obecný název
VINCLOZOLIN:
/S/-3-/3,5-dichlorfenyl- 5-metyl-5-vinyl-1,3-oxazolidin-2,4-dion
EC = emulgované koncentráty
WP = smáčitelné prášky
SL = rozpustné koncentráty
SC = suspenzní koncentráty
WG = ve vodě dispergovatelné granule
• Registrace
– Lze používat jen registrované přípravky
– Hodnocení přípravků
• Ověření vlastností, účinnosti, bezpečnosti …
• Kontrola životního cyklu
– Používání jen v souladu s doporučeními
– Nebezpečný odpad ..
• Autority
– EU – EFSA
– ČR – ÚKZÚS
• Odkazy:
– DG SANCO
• http://ec.europa.eu/food/plant/protection/index_en.htm
• http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/index_en.htm
• http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/database_act_subs_en.htm
– EFSA
• http://www.efsa.europa.eu/en/praper/praperscdocs.htm
• http://www.efsa.europa.eu/en/panels/praper.htm
POR – základní principy regulace
Registrace POR – rozsáhlá žádost
 Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský
• Toxikologické studie u přípravků na ochranu rostlin
(POR)
– akutní orální toxicita
– akutní dermální toxicita
– akutní inhalační toxicita
– studie kožní dráždivosti
– studie oční dráždivosti
– studie senzibilizace
• Hodnocení nebezpečnosti POR pro zdraví
– 1. Toxicita POR - předložené toxikologické studie - ve
většině případů
– 2. Další nebezpečné vlastnosti určují (počítají) se z
vlastností účinné látky a koformulantů - konvenční
výpočtová metoda (+ individuální koncentrační limity)
Přípravky na ochranu rostlin – požadavky při registraci
POR – od 2014 zajišťuje ÚKZÚZ (dříve SRS – Státní Rostlinolékařská Správa)
Na úrovni EU – hlavní agenda: EFSA a její databáze
Léčiva … a správná praxe
Léčiva – základní údaje
• V ČR registrováno
– více než 50 000 variant léků
a léčebných přípravků
– obsahujících více než 1000
aktivních látek
• V UK v roce 2000
registrováno více než 3
000 aktivních látek
• Graficky - příklad Norsko
(2010) 
Vývoj nových léčiv
Internet Pfizer
Vývoj nových léčiv
Léčiva – základní údaje
• „Nebezpečné“ faktory užívání léčiv
– Léky dále obsahují i pomocné látky, plniva, pigmenty, vosky,
tmelící látky
– kromě léčiv se ve zdravotnictví používají např. i diagnostické látky
(kontrastní látky NMR), dezinfekce
– látky přirozeně bioaktivní
• interakce látek ve směsích
• dlouhodobé účinky v nízkých koncentracích ?
Jednotlivá léčiva mají různý profil
bezpečnosti/účinnosti:
účinná látka
léčebná
hladina/dávka
toxická
hladina/dávka
aminofylin 44 - 111 μmol/l > 110 μmol/l
digoxin 1 – 1.9 nmol/l > 3.2 nmol/l
gentamicin 2 – 8 μmol/l 4 – 8 μmol/l
fenbendazol 5 – 50 mg/kg
100x vyšší
(10gm/kg – lab.)
Farmaka pro humánní
medicínu
Farmaka pro
veterinární medicínu
Exkrece (odpadní
vody z nemocnic)
Exkrece (odpadní
vody z domácností)
Komunální odpad
(nevyužité léky)
Exkrece
Čistírna odpadních
vod
Popelnice Hnůj, kompost
Zpracování kalů
Povrchová voda
Skládka
Upravený kal
Půda
Podzemní voda
Pitná voda
Výroba farmak
Vodní mikroflóra
Upraveno podle: T.Heberer, Toxicology Letters 131, 5 – 17 (2002)
GLP a Léčiva
• GLP & přesná dokumentace vyžadována u humánních i
veterinárních léčiv:
• Registrace před použitím
– průkaz a dokumentace farmakokinetiky, cílové aktivity ve
srovnání s existujícími postupy, bezpečnost pro lidi + nově
i pro životní prostředí …
• Dokumentace celého životního cyklu
– výroba, přípravy v lékárnách, kontrola kvality, aplikace,
reporting vedlejších účinků, likvidace (nebezpečný odpad)
• Autority:
– ČR
• SÚKL (Státní úřad pro kontrolu léčiv)
• ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a
léčiv)
– EU: Evropská léková agentura (EMA)
– USA: Food and Drug Administration (FDA)
http://www.ema.europa.eu/
www.sukl.cz
www.uskvbl.cz
• Základní zákonný dokument:
• Zákon o léčivech č. 378/2007 v platném
znění (časté aktualizace)
• a příslušné prováděcí vyhlášky
(viz příklad ve studijních materiálech)
• Pro informaci: další zákony v kompetenci SÚKL
– Zákon č. 167/1998 Sb., o návykových látkách a o změně
některých dalších zákonů, ve znění pozdějších předpisů
– Zákon č. 160/1992 Sb., o zdravotní péči v nestátních
zdravotnických zařízeních
GLP a Léčiva
Prováděcí předpisy k zák. 378/2007 (výběr - příklady)
• vyhláška č. 229/2008 Sb., o výrobě a distribuci léčiv, ve znění pozdějších předpisů
• vyhláška č. 228/2008 Sb., o registraci léčivých přípravků, ve znění pozdějších předpisů
• vyhláška č. 106/2008 Sb., o správné praxi prodejců vyhrazených léčivých přípravků
a o odborném kurzu prodejců vyhrazených léčivých přípravků
• vyhláška č. 226/2008 Sb., o správné klinické praxi a bližších podmínkách klinického
hodnocení léčivých přípravků, ve znění pozdějších předpisů
• vyhláška č. 54/2008 Sb., o způsobu předepisování léčivých přípravků, údajích
uváděných na lékařském předpisu a o pravidlech používání lékařských předpisů, ve
znění pozdějších předpisů
• vyhláška č. 84/2008 Sb., o správné lékárenské praxi, bližších podmínkách zacházení s
léčivy v lékárnách, zdravotnických zařízeních a u dalších provozovatelů a zařízení
vydávajících léčivé přípravky, ve znění pozdějších předpisů
• (viz příklad – studijní materiály) vyhláška č. 85/2008 Sb., o stanovení seznamu léčivých
látek a pomocných látek, které lze použít pro přípravu léčivých přípravků, ve znění
pozdějších předpisů
• (viz příklad – studijní materiály) vyhláška č. 86/2008 Sb., o stanovení zásad správné
laboratorní praxe v oblasti léčiv, ve znění pozdějších předpisů
• vyhláška č. 143/ 2008 Sb., o stanovení bližších požadavků pro zajištění jakosti a
bezpečnosti lidské krve a jejích složek (vyhláška o lidské krvi), ve znění pozdějších
předpisů