NMR Osnova • Úvod, základní princip • Instrumentace - magnety, měřící sondy, elektronika • Chemický posun, spin-spinová interakce, decoupling • Základní 1D experimenty • Interpretace 1D NMR spekter • Více-dimenzionální NMR spektroskopie • NMR v pevné fázi • NMR experimenty ve slabém magnetickém poli 2 Historie NMR • 1943 - Nobelova cena za objev magnetického momentu protonu -Otto Stern. • 1944 - Nobelova cena za rezonanční metodu pro zjištění magnetických vlastností atomových jader - Isidor Isaac Rabi. • 1945 - první 1H NMR spektrum vody. • 1952 - Nobelova cena za rozvoj metod pro přesná měření jaderného magnetismu a první NMR signál - Felix Bloch a Edward Mills Purcell. • 1965 - širokopásmový 1H decoupling. • 1991 - Nobelova cena za HR-NMR, vývoj nových pulsních technik, rozvoj FT-NMR a zavedení 2D NMR technik - Richard R. Ernst. • 2002 - Nobelova cena za vývoj NMR technik umožňujících určení 3D struktury biomolekul - Kurt Wútthrich. 3 Nukleární Magnetická Rezonance • Sledujeme absorpci radiofrekvečního záření vzorkem, který je umístěn v magnetickém poli. • Vzorek může být v plynném, kapalném i pevném stavu. • Důležitá metoda pro strukturní analýzu. • Vyžaduje silné magnetické pole, nejčastěji se využívá supravodivých magnetů. 4 Schéma NMR spektrometru schema NMR spektrometru cívka prídavné masnetizace zkumavka se vzorkem / cívka prídavné magnetizace magnet osa z. B c zesilovač počítač záznamové zařízení NMR magnety Permanentní - do 100 MHz Cryogen-free - levný provoz, 100 - 300 MHz. Supravodivé magnety - nejčastěji využívané v NMR - Chlazené kapalným heliem (4 - 2,2 K) - Magnetické pole až 23,5 T (1000 MHz) Rezonanční frekvence 1H a 13C jader v závislosti na sile magnetického pole 1H [M Hz] 13C [M Hz] 1,41 60 15,1 2,35 100 25,15 ^^^^^^^ 11,74 500 125,7 16,44 700 176,05 22,32 950 238,94 8 NMR sondy • Hlavní funkcí je excitace spinového systému a snímání odezvy. • Lockovací kanál. • Udržuje stabilní teplotu vzorku. • Často obsahuje také gradientovou cívku (cívky) pro experimenty využívající pulsní gradienty magnetického pole. • Podle konstrukce se dělí - Teplé sondy - Kryosondy - zvýšená citlivost, náročná údržba - Průtočné sondy - Nanosondy - pro extrémně malé množství vzorku 9 NMR sondy • Sondy se dále dělí podle počtu cívek. Citlivost cívek klesá se vzdáleností od vzorku. - Dvoukanálové - dvě cívky - Tříkanálové (triple resonance) • BB sondy mají vnitřní cívku určenou pro měření jader X a vnější pro měření 1H nebo pro 1H decoupling. Inverzní sondy mají uspořádání opačné a jsou vhodné pro snímání 1H jader, např. 2D experimenty -1H-13C HSQC. • Dále rozlišujeme sondy podle velikosti NMR kyvety, pro kterou jsou konstruovány - 5 a 10 mm. 10 NMR sondy Vzorek pro NMR spektroskopii • Využívají se tenkostenné skleněné kyvety, které se umisťují do plastových nebo keramických rotorků. Průměr kyvet je nejčastěji 3, 5 nebo 10 mm. • Pro měření je nutné připravit roztok měřené látky v deuterovaném rozpouštědle. Signál 2H (D) se používá k lockování vzorku. • Vzorky reakčních směsí se často měří v koaxiálním uspořádání, kdy se kyveta se vzorkem vloží do kyvety s deuterovaným rozpouštědlem. • Signál deuterovaného rozpouštědla lze využít i jako standard ke kalibraci spektra. 12 Rozpouštědla pro NMR Rozpouštědlo 5(1H) CeDe 7,16 128,4 CDCI3 7,24 77,23 ^^^^^^^^^^^^ D20 4,8 - ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^ CD30D 3,31; 4,78 49,2 Toluen-d 8 2,09; 6,98; 7,00; 7,09 20,4; 125,5; 128,3; 129,4; 137,9 CD3CN 1,94 1,4; 118,7 13 Jaderný spin • Atomové jádro se skládá z protonů a neutronů. • Obě částice mají spin ±14. • Jaderný spin je dán součtem spinu všech nukleonů. • V NMR jsou aktivní pouze jádra, která mají spin různý od nuly. • Nejčastěji se měří jádra se spinem 14, např. 1H, 13C, 19F a 31P. • Za normálních podmínek mají obě orientace spinu stejnou energii. • Pokud ale vložíme jádro do magnetického pole, získáme dvě rozdílné energetické hladiny. • Pokud na tento systém působíme radiofrekvenčním zářením, může dojít k absorpci a přeskoku spinu na vyšší energetickou hladinu. • Poté pozorujeme návrat spinu na původní hladinu a vyzáření absorbované energie, kterou snímáme. 14 9,40 T 400 MHz mm 64 spinu 21.14T 900 MHz umu 135 spinu Radiofrekvenční pulsy • FT-NMR využívá k excitaci jaderných spinu radiofrekvenční pulsy. • Ty excitují všechna měřená jádra, např. protony, najednou. • Pulsy sklápí vektor magnetizace a způsobují jeho precesi. • Délka pulsů se pohybuje v řádu jlls. • Čím je puls delší, tím je větší i sklápěcí úhel. Chemický posun • Izolovaná jádra stejného izotopu budou v magnetickém poli rezonovat při stejné frekvenci. • Pokud uvažujeme molekuly, je každé jádro ovlivněno také lokálními magnetickými poli, které jsou generovány vazebnými elektrony. Tím dochází ke změně rezonanční frekvence daného jádra. • Změna je dána tzv chemickým okolím pozorovaného jádra a nazývá se chemický posun. Označuje se ô a je dán vztahem: • vTMS je rezonanční frekvence standardu, v je rezonanční frekvence signálu • chemický posun je bezrozměrný, jelikož se jedná o velmi malé hodnoty, udává se v • Chemický posun je, na rozdíl od rezonanční frekvence, nezávislý na hodnotě vnějšího magnetického pole. ppm. 17 NMR chemické posuny T>'P H *" _PfiMižnf [w&unv'H-NMR RCHj - RíC=CHä RjC=CHR RE=CH — AlCH, — Ar-H RCCH, L KOCH-R' RCHjC] KCH2OH ■ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 987654321 06 CIIĽMK'KÝ POSUN tppml 18 Interakční konstanta Pokud je v molekule více NMR aktivních jader, může docházet k jejich vzájemné interakci. Síla této interakce je dána hlavně počtem vazeb, které jádra oddělují. H H Velikost interakční konstanty je nezávislá h— na intenzitě magnetického pole. Ol H H r J CH, OH i 1 A__Jl CH, 5.0 4.0 3.0 -I— 2 0 1.0 TMS 0.0 19 ppm Interakční konstanta • Způsob štěpení je dán počtem interagujících spinu. • Pro jádra se spinem Ví je velikost multipletu, tzn. počet signálů po štepení a jejich vzájemná intenzita dán Pascalovým trojúhelníkem. 1 1 1 1 2 1 13 3 1 1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1 1 6 15 20 15 6 1 20 Interakční konstanta Velikost interakce se vyjadřuje pomocí interakční konstanty, která se označuje písmenem J. Pro přesnější popis interakce se využívá indexů, např. interakci mezi atomy vodíku v ethanolu (přes tři vazby H-C-C-H) vyjádříme 3JHh- Její velikost se udává v Hz. Hb Ha Cl-C-C-H, x *—► Decoupling (dekaplink) Štěpením signálů spektra je důležitou informací pro strukturní analýzu, zároveň ale zhoršuje poměr signál/šum. Pro potlačení štěpení se používá tzv. decoupling, kdy kontinuálně ozařujeme dekaplovaná jádra. Tím dojde k potlačení štěpení. Ztratíme ale informaci o kvantitativním složení vzorku, protože intenzita signálu v dekaplovaném spektru není úměrná koncentraci Gated decoupling - neozařujeme během akvizice, nedojde k potlačení NOE. Inverse-gated decoupling - ozařujeme pouze během akvizice, vhodné pro jádra se záporným gyromagnetickým poměrem - 15N, 2^SÍ. x _|yV\/V~-----— IM J Proton Decoupling Inverse Gated Proton Decoupling * - Gated Proton H [ I Decoupling X ^^^^^^M Inverse Gated X iH _|yVv-^~—■ Decoupling 22 1H NMR • 1H je velmi citlivé jádro s přírodním zastoupením téměř 100 %. • Běžný rozsah chemických posunů 14 až -4 ppm. • Používá se jednopulsní experiment (zg) s 90° pulsem, příp. 30° pulsem (zg30). • Lze využít i homonukleární nebo heteronukleární decoupling. • Složitější molekuly poskytují komplikovaná spektra, obsahující multiplety vyssich radu. • Pro větší molekuly je výhodné měřit 2D NMR experimenty - COSY, NOESY. • Ve spektru lze pozorovat tzv. uhlíkové satelity vzniklé interakcí 1H-13C. • http://users.wfu.edu/ylwong/chem/nmr/h1/ • http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/nmr-h/hdata.htm 23 13C NMR • V přírodě je obsah izotopu 13C pouze 0,01 %, zbytek tvoří NMR neaktivní izotop 12C. • 13C NMR nejčastěji měříme s 1H decouplingem. • Rozsah chemických posunů je od 220 do -20 ppm. • Často se využívají složitější experimenty - APT, DEPT, INEPT, ... • Příp. 2D experimenty - HSQC, HMBC. • Stanovení interakční konstanty 13C-13C vyžaduje velmi koncentrované vzorky a dlouhý měřící čas - INADEQUATE. • http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/nmr-c13/cdata.htm • http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/nmr-c13/c-coupling.htm 24 DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer • Poskytuje informaci o počtu protonů vázaných k uhlíku, tzn. Umožňuje rozlišit skupiny CH, CH2, CH3 a kvartérní uhlíky. • DEPT45 - signály od všech uhlíku s vazbou C-H ve stejné fázi • DEPT90 - pouze signály skupin CH, ostatní jsou potlačeny • DEPT135 - signály CH a CH3 ve fázi, CH2 v antifázi 200 150 100 SO PPřrf APT - Attached Proton Test Podobně jako DEPT umožňuje určit počet protonů vázaných na atom uhlíku. Kvartérní uhlíky a skupiny CH2 poskytují pozitivní píky. Skupiny CH a CH3 poskytují negativní píky. Nižší citlivost než DEPT, ale místo tří spekter stačí naměřit jedno. decoupling I||inr||ii||iii||qrii|q|i||i|ii|iiii|piii|i||i^pqii|i4ii||iir|lllipilll|iriipi|i||iiiqpiiri|ii|i|i9ii^ri|i|ii|i||ine|ipii|iiqi|iri||ii 140 130 120 110 100 90 80 70 SO 50 40 30 20 10 Chemical Shift (ppm) 26 INEPT - Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer • Důležitý prvek mnoha pulsních sekvencí, využívajících přenos polarizace. • Využívá se pro zvýšení citlivosti jader s nízkým gyromagnetickým poměrem. • Zvýšení citlivosti je úměrné poměru gyromagnetických konstant 1H a měřeného jádra - pro 13C je to asi 4x, pro 15N cca 10x. 180° 90° 2D ... XD NMR experimenty Pro složitější molekuly není 1D NMR spektrum čitelné. Rozlišení se dá zvýšit silnějším magnetickým polem. Lepší cestou je přechod na NMR experimenty ve více dimenzích V dnešní době se rutinně využívají 2D a 3D experimenty. Rozlišení je podstatně vyšší než u 1D spekter protože dochází k rozprostření signálů v ploše spektra. □ CQSYCyci jsporin ...................... .n........au. □ Ä * @ ě 0 F2 [ppm] 2D ... XD NMR experimenty • 2D experimenty se skládají ze čtyř kroků: - Příprava (preparation) - excitace spinového systému. - Vývoj (evolution) - necháme systém volně vyvíjet. - Mixing time - dochází k přenosu magnetizace mezi spiny. - Detekce - akvizice dat. • 2D spektra se nejčastěji znázorňují jako plošné řezy, lze je ale zobrazit i jako 3D mapy. • Rozlišená 2D NMR spektra (resolved) - rozlišená podle interakčních konstant. Na jedné oseje chemický posun, na druhé interakční konstanta. • Korelovaná 2D NMR spektra (correlated) - na obou osách jsou chemické posuny. • U vícedimensionálních experimentů se opakuje vývoj a mixing time v příslušných dimensích. 29 Homonukleární 2D experimenty Přenos magnetizace mezi stejnými jádry, nejčastěji 1H-1H, ale muže být i sip-sip, 19F-19F, atd. U koncentrovaných vzorků lze i 13C-13C (INADEQUATE). Pokud mezi jádry dochází k přenosu magnetizace, pozorujeme tzv. cross-peaky. V opačném případě získáme diagonální peaky. □ CQSYCyci jsporin ...................... .n........au. □ Ä * @ ě 0 E - a. 30 F2 [ppm] COSY • COrrelated SpectroscopY • Jeden z nejběžnějších 2D experimentů. • Umožňuje zjistit interakce mezi jádry a odečíst interakční konstanty. • Protony, které jsou dál než tři vazby neposkytují cross-peaky, protože hodnota 4Jm je blízká nule. • V současnosti se používá DQF-COSY - (Double Quantum Filtered COSY) - která poskytuje stejné informace, ale spektra jsou čistější. 31 TOCSY • TOtal Correlated SpectroscopY • HOHAHA - HOmonuclear HArtmann HAhn • Umožňuje rozdělit protony do skupin podle vzájemných interakcí. • Lze např. rozlišit protony jednotlivých cyklů v disacharidech. NOESY • Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY • Velmi důležitá metoda pro určování terciární struktury biomolekul. • Přenos magnetizace probíhá mezí jádry, mezi kterými je skalární interakce. • Maximální vzdálenost jader 5-6 A. • Pro větší vzdálenosti - ROESY - Rotating frame Overhauser Enhancement SpectroscopY 33 Heteronukleární 2D experimenty • Dochází k přenosu magnetizace mezi různými jádry, např. 1H-13C, 1H-15N, atd. • Díky přenosu magnetizace lze pohodlně měřit i málo citlivá jádra. • Na osách jsou chemické posuny jednotlivých jader. • Pokud mezi jádry dojde k přenosu magnetizace, pozorujeme peak průsečíků chemických posunů obou jader. • Pokud k přenosu magnetizace nedojde, nezískáme žádný peak. HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Patří mezi tzv. inverzní experimenty - snímáme 1H. Signály ve spektru patří 1H jádrům vázaným přímo na 13C nebo Spektrum není symetrické podle diagonály. ---------— —-----------118 --------------------120 ---------------------122 --------------------124 -------------«J-------126 --------------------128 ------------------- --------------------132 --------------------134 --------------------136 --------------------138 ---------„----------140 8.5 &4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 ppm HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Pozorujeme signály protonů, které interagují s jádrem X přes více než jednu vazbu. Metoda umožňuje pozorování kvartérních uhlíků. HMBC spektra jsou náchylná naflvznik artefaktů, zvláště od 1J .A - JUL. 'XH- ppm ■120 ■125 ■130 ■135 ■140 ■145 ■150 ■155 ■160 ■165 ■170 36 3.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 ppm Solid-state NMR • MAS NMR - Magie Angle Spinning • Anizotropie chemického posunu. • Vzorek je napěchován do keramického rotoru a rotuje pod ú 54,7° (magický úhel). • Rotace při rychlostech 0-50 kHz. • Pro měření málo citlivých jader se využívá cross-polarizace. NMR ve slabém magnetickém poli • Earth's-Field NMR - využívá magnetické pole Země - lze měřit velké vzorky - pro zlepšení S/N se využívá pre-polarizace v elektromagnetu • Low-Field NMR • Systémy využívající permanentní magnety nebo elektromagnety -PicoSpin, ... 38 Odkazy • http://nmrlab.chemi.muni.cz/ • http://qa.nmrwiki.org/ • http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/index.html • http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi 39