KLINICKÁ BIOCHEMIE Imunochemické metody stanovení bílkovin Mgr. Petra Bořilová Linhartová, Ph.D. plinhart@med.muni.cz Obsah přednášky Imunochemické metody stanovení bílkovin • Plazmatické bílkoviny, proteiny akutní fáze • Kvalitativní a kvantitativní stanovení bílkovin - elektroforéza bílkovin, spektrofotometrické a chromogenní stanovení, bílkoviny v moči • Imunochemické metody stanovení bílkovin • Imunoanalýza: RIA, EIA a další • Imunochromatografie, imunochromatografické proužky Bílkoviny • složeny z 20 různých AA vzájemně vázaných peptidovými vazbami, přesné pořadí aminokyselin určuje primární strukturu bílkovin • další uspořádání bílkovin je dáno vodíkovými můstky (sekundární struktura), elektrostatickými silami, hydrofobními interakcemi a disulfidovými můstky (terciární struktura) • oligomery identických nebo podobných podjednotek bílkovin se mohou někdy navzájem vázat nekovalentními vazbami a vytvářet tak kvartérní strukturu • obsahují v řetězci více než 100 AA, jedná se velké polymery o molekulové hmotnosti 10 – 1000 kDa ale i více Plazmatické bílkoviny • Krevní plazma a intersticiální tekutina Biosyntéza • Játra – většina • Lym – Ig • Enterocyty – apoprotein B-48 Odbourávání • Hepatocyty • Mononukleární fagocytární systém – degradace komplexů (haptoglobin-hemoglobin, antigen-protilátka) Plazmatické bílkoviny Regulace syntézy ↑ ↓ Zánět Poškození jater – parenchymální tkáň Hypertyreoizmus Nutriční deficit Hyperkortikalizmus hypotyreodizmus ↑ c STH DM Fe deficience Alkoholizmus Ztráta proteinů Klonální produkce Ig Plazmatické bílkoviny • pre-proteiny • posttranslační modifikace v drsném ER a GA (proteolýza, glykosylace, fosforylace) - většinou glykoproteiny (kromě Alb a CRP) o N-glykoproteiny: Asn o O-glykoproteiny: Ser a Thr (muciny a proteoglykany) • polymorfïzmus – Ig, ceruroplasmin, transferin • charakteristický poločas setrvání v oběhu: Alb - 20 dnů Plazmatické bílkoviny • celkový protein = více než 300 proteinů (některé enzymy a proteohormony jsou klasifikovány zvlášť) • Sérum: 62-82 g/l (35-50 g/l Alb a 20-35 g/l sérové globuliny = transportní proteiny, reaktanty akutní fáze, globuliny) Plazmatické bílkoviny Plazmatické bílkoviny • málo stavů ovlivňuje c všech bílkovin • Hypoproteinémie o hromadění tekutiny v extravaskulárním tkáňovém prostoru → edém o malnutrice (albumin, transferin, C3) o děti a gravidní • Hyperproteinémie o dehydratace o plazma > sérum (fibrinogen) o odběr ve stoje (10-15%) o svalová aktivita (12%) • většinou změny c jednotlivých složek Plazmatické bílkoviny Fce • Udržování onkotického (koloidně osmotického) tlaku o brání nadměrnému pronikání intervaskulární tekutiny do extravaskulárního prostoru • Transport minerálů, hormonů, lipidů, katabolitů o Prealbumin o Albumin – MK, bilirubuin, Ca, léky, vitamíny o Ceruroplasmin - Cu o Transferin - Fe o Apoproteiny – lipidy o Haptoglobin – volný hemoglobin o Transkortin – CO? (kortizol…) o TBG – thyroxin o RBG - retinol Plazmatické bílkoviny Fce • Hemokoagulace a fibrinolýza o koagulační faktory – IX, VIII, trombin, fibrinogen o antikoagulační faktory (faktory rozpouštějící tromby) – plazmin • Enzymy a inhibitory enzymů o tvorba komplexů s enzymy a jejich odstranění o cholinesteráza, ceruroplazmin o inhibitory proteáz – bránící napadení poškozených a zanícených tkání proteolytickými enzymy (α1-antitrypsin, α1-antichymotrypsin, α2-makroglobulin) Plazmatické bílkoviny Fce • Obranné reakce organizmu • Specifická a nespecifická imunita o Ig – odstranění antigenů o Komplementový systém – odstranění buněčných antigenů • Akutní fáze zánětu o α1-antitrypsin, α1-kyselý glykoprotein, haptoglobin, α2- makroglobulin Plazmatické bílkoviny Klinické využití • Kardiomarkery • Tumormarkery • Reaktanty akutní fáze • Buněčné enzymy • Hormony • Cytokiny Proteiny akutní fáze • Zánětlivé a stresové markery • Zánět, trauma, nádorové bujení • Destrukce buněk, reverzibilní poškození b. a reparace, metabolická aktivizace (IS) • Změny c proteinů během zánětu či nekróz • Syntéza v játrech Proteiny akutní fáze Pozitivní Negativní C-reaktivní protein Albumin, prealbumin Složky komplementu (C3, C4) Transferin α1-antitrypsin, α1antichymotrypsin, α2- makroglobulin Antitrombin Haptoglobin, hemopexin, ferritin, ceruroplasmin Transkortin Sérový amyloid A (SAA) RBP Prokalcitonin Fibrinogen TNF-α, IL-1, IL-6 Význam – • Kritérium syntézy bílkovin v játrech a ukazatel malnutrice Proteiny akutní fáze Význam + • Složky imunitní reakce o likvidace noxy, úloha při odstraňování poškozených b., modulace imunitní odpovědi (CRP, C3, C4, cytokiny) • Ochrana před kolaterálním poškozením tkáně o z fagocytů atd. - proteolytické enzymy a reaktivní formy kyslíku o Inhibitory proteáz (α1-antitrypsin, α1-antichymotrypsin, α2- makroglobulin) o Haptoglobin, hemopexin, ferritin, ceruroplasmin • Transport odpadních látek o Hemoglobin, hemopexin, SAA • Koagulace a bílkoviny podílející se na regeneraci o Fibrinogen, prokalcitonin, protrombin, von W f, plazminogen Proteiny akutní fáze Rychlost změn plazmatických c • Časně (6-10 h) o CRP, SAA, prokalcitonin • Se střední dobou odpovědi (12-36 h) • α1- kyselý glykoprotein, α1-antitrypsin, haptoglobin, fibrinogen • Pozdní (48-72 h) • C3, C4, ceruroplasmin Plazmatické bílkoviny Albumin • 55-65% celkové plazmatické bílkoviny • 40% v plazmě, 60% v extracelulárním prostoru • játra produkují cca 12 g za den (dle příjmu AA) • biol. poločas 20 dní Fce • onkotický tlak • proteinová rezerva organizmu • transport – steroidní hormony, žluč. k., MK, bilirubin, léky (sulfonamidy a salicyláty), ionty Ca, Mg, Zn, Cu Plazmatické bílkoviny Albumin • Odběr: ráno, nalačno (10 – 12 hodin před odběrem nejíst, být v klidu, vypít 2 – 3 dl vody). Před odběrem 15 minut sedět. • Vyhodnocení výsledků: do 24 hodin, při urgentním požadavku do 2 hodin • Fyziologické hodnoty v séru: o Novorozenci 0 - 6 týdnů: 27 - 33 g/l o Kojenci 6 týdnů - 1 rok: 30 - 43 g/l o Muži, Ženy 1 - 110 let: 35 - 53 g/l Plazmatické bílkoviny Albumin ↓ c • sníženou tvorbu albuminu v játrech, při: o těžkém poškození jater - cirhóza jater (↑ ALG/GLB ratio) o podvýživě s nedostatečným přívodem bílkovin ve stravě (kwashiorkor) • zvýšené ztráty albuminu z organizmu, při: o nefrotickém syndromu – onemocnění ledvin s výraznými ztrátami bílkovin močí o popáleninách o onemocnění střev, žaludku s výraznými ztrátami bílkovin stolicí o Otoky, tekutina v tělních dutinách • zánětlivá onemocnění, zvýšený katabolizmus: o zánětem nebo nádorem vyvolaná ↓ c bílkovin krvi (neg protein akutní fáze) Plazmatické bílkoviny Albumin ↓ c • onemocnění s nadprodukcí protilátek (např. chronický zánět, MM) • jiné stavy se sníženou hladinou albuminu v krvi: o sepse (systémový infekční zánět s rozsevem choroboplodných zárodků z původního místa infekce do jiných orgánů s jejich poškozením) o šok (těžký život ohrožující stav, kdy dochází k selhání krevního oběhu s těžkou poruchou prokrvení tkání a orgánů) o převodnění organizmu o analbuminemie - velice vzácná vrozená porucha tvorby ALB, onkotický tlak bývá poloviční než u normálních c ALB, vznikají pouze mírné otoky - kompenzačně se zvyšuje tvorba jiných bílkovin ↑ c • dehydratace, ketodieta Proteiny akutní fáze CRP • β2 – globulin • Precipituje C-polysacharid pneumokoků • Aktivuje komplemetový systém, hraje úlohu opsoninu (vazba na fosfocholin odumřelých b. a některých bakt) • ↑ c po 4 hod po navození reakce akutní fáze (první dny ↑ c více než 100x) • rozdíl mezi bakt a vir horečnatými onem. • monitorování léčby ATB • ↑ c u akutních onemocnění (infarkt myokardu, hluboká žilní trombóza, bakt infekce..) a u chronických (malignita, revmatická choroba, nekróza tkáně, zánětlivé střevní onem) Proteiny akutní fáze Prokalcitonin • sekrece stimulována bakt endotoxiny • ↑ c po 2 hod po navození reakce akutní fáze, max 6-8, až 72 hod • regulace zánětu a analgetické úč • ↑ c indikátor časné sepse, orgánová selhání bakt původu, šokové stavy Haptoglobin • váže volný hemoglobin (jinak prochází glomeruly a precipituje v tubulech → poškození ledvin), zamezení ztráty Hb a Fe • ↑ c – akutní záněty, maligní nádory, poranění • ↓ c – hemolytické anemie Proteiny akutní fáze SAA • vazba na HDL • Syntéza – hepatocyty, aktivované makrofágy a fibroblasty • ↑ c po 8 hod po navození reakce akutní fáze • ↑ c i u méně závažných infekcí (i virových) • ↑ c - infekce, marker rejekce štěpu, prognostický marker chorob KVS, chronicky u revmatoidní artritidy, TBC a lepry Proteiny akutní fáze α1-antitrypsin • inhibitor serinových proteáz • ↑ c – akutní záněty, nádory, akutní i chronická hepatopatie, cirhózy • ↓ c – glomerulonefritidy, RA, genetické příčiny α2-makroglobulin • inhibitor proteáz a transport cytokinů a růstových faktorů • ↑ c – akutní záněty, nefrotický sy, RA, parodontitida (GCF), Crohnova choroba a ulcerózní kolitida • ↓ c – progrese rakoviny prostaty Proteiny akutní fáze Ceruroplazmin • transport plazmatické Cu • ↓ c – onem jater, Wilsonova, Menkesova choroba, malnutrice Fibrinogen • koagulační faktor I • ↑ c – akutní záněty, poškození tkání, rizikový faktor aterosklerózy • ↓ c – hepatopatie, DIC Transferin • transport Fe • ↑ c – anemie z nedostatku Fe • ↓ c - popáleniny, infekce, malignity, onem jater a ledvin Proteiny akutní fáze Imunoglobuliny • protilátky produkované B-lym po stimulaci antigenem • reagují specificky s antigenními determinanty (epitop) • tetramer – 2 H (izotypy – G, M, A, E, D) a 2 L (λ a κ, C a V oblast) řetězce – disulfidické můstky Stanovení bílkovin Kvalitativní stanovení • oddělení jednotlivých frakcí bílkovin ve směsi (např. krevní sérum) je možné na základě jejich odlišné velikosti, resp. molekulové hmotnosti pomocí elekroforézy Kvantitativní stanovení • samotná koncentrace bílkovin nevypovídá o jejich biologické aktivitě, tu je třeba stanovit zvlášť jako např. enzymovou nebo imunologickou aktivitu • Proteiny: celková bílkovina, ALB, TnI, IgA… • Hormony: TSH, fT4, testosteron, hCG… • Problém odhadu obsahu a charakteru proteinů je v tom, že jako standard používáme čistý protein, ale analyzujeme obvykle směs, nebo protein o neznámém aminokyselinovém složení. Plazmatické bílkoviny ELFO plazmatických bílkovin • diagnostika onemocnění, která se projevují změnami v zastoupení jednotlivých frakcí bílkovin krevního séra či patologickou přítomností bílkovin (sérum, moč, likvor) • ELFO séra probíhá v pufru o alkalickém pH • rozdělené frakce na nosiči lze obarvit a jejich poměr stanovit fotometricky po eluci bílkovin s navázaným barvivem, nebo také denzitometricky, tzn. měřením odraženého, nebo prošlého světla, pokud je použitý nosič transparentní • při znalosti hmotnostní koncentrace celkové bílkoviny a poměrů mezi absorbancemi jednotlivých frakcí lze tyto frakce kvantifikovat Plazmatické bílkoviny Typy plazmatických bílkovin • dle ELFO pohyblivosti (agaróza, acetátcelulóza) • 5-6 frakcí Stanovení bílkovin Kvantitativní stanovení • chromogenní stanovení - indukováním tvorby barevného produktu přidáním vhodného činidla a následnou spektrofotometrickou kvantifikací o Biuretova metoda o Lowryho metoda (Folin-Ciocalteuovo činidlo) o BCA metoda o Metoda dle Bradfordové (Coomassie Blue) Všechny tyto metody jsou destruktivní, vzorek je pro další analýzu nepoužitelný! • přímé spektrofotometrické stanovení - absorbance ultrafialového světla (při 280 nm) Stanovení bílkovin Biuretova metoda • v alkalickém prostředí • tvorba komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb (fialové zbarvení) • fotometrickému stanovení - komplex silně absorbuje světlo v oblasti 540-560 nm • látky obsahující v molekule alespoň dvě peptidové vazby (-CO-NH-) nebo dvě amidové -CO-NH2 (není specifická pouze pro bílkoviny) • biuretovo činidlo: síran měďnatý, alkalizující složka (převede peptidovou vazbu na enolformu), vinan draselno-sodný (zabraňuje jako komplexotvorná látka srážení Cu2+ na Cu(OH)2), jodid draselný (chrání Cu2+ před autoredukcí) • citlivost malá kolem 10–100 mg bílkoviny/ml • standard (BSA, ovalbumin), nezávisí na AA složení, rušena např. NH4 +, Tris Stanovení bílkovin Biuretova metoda • intenzita zbarvení komplexu přímo úměrná c bílkovin • peptidy se 2 čtyřmi a více zbytky AA vytvářejí komplex červený, tripeptidy fialový, dipeptidy nereagují • „biuret„ - triviální název sloučeniny, která vzniká ze dvou molekul močoviny při jejím zahřívání Stanovení bílkovin Lowryho metoda • biuretova reakce s následnou redukcí Folin-Ciocalteuovým fenolovým činidlem • charakteristické modrofialové zbarvení (v čase nestabilní) • velmi citlivá 2-100 mg/ml, ale na druhé straně je dvoustupňová a vyžaduje minimální dobu inkubace 40 min • měření absorbance při 750 nm • standard (BSA, OVA), rušena např. NH4 + • více závisí na složení proteinu (redukce fosfomolybdenanů a fosfowolframanů Tyr, Trp, Cys) BCA metoda • podobná s Lowryho, ale činidlem je BCA (kyselina bicinchoninová) • fialově zbarvený komplex • citlivost 0,5 mg/ml • měření absorbance při 562 nm Stanovení bílkovin Metoda dle Bradfordové • principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu, činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, ethanol a H3PO4 • barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá • velmi citlivá 1 mg/ml, výsledek již za 5 minut • závisí na obsahu bazických (zvl. Arg), ale i aromatických AA • negativní interference: detergenty (SDS, Triton)… • lineární kalibrace max. po 20 mg proteinu • měření absorbance při 595 nm Stanovení bílkovin Přímé spektrofotometrické stanovení • chromofory v molekulách proteinů, které absorbují v UV oblasti spektra • nedestruktivní metoda • křemenné kyvety • v blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost – 50 mg/ml • v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné interferenci • velká závislost na AA složení proteinu • UV absorpce je dána aromatickými AA (hlavně Trp a Tyr), je nutná jejich přítomnost • interference širokého absorpčního pásu NA (λmax = 260 nm) se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a početní korekcí • v daleké UV oblasti se využívá vlnová délka 205 nm (maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm) Stanovení bílkovin Edelhochova metoda • při znalosti AA složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280 • podmínkou je přítomnost Trp nebo Tyr v molekule Fluorescenční stanovení • reakce primárních AA v proteinu (Lys, N-koncová aminoskupina) s o-ftalaldehydem • citlivost metody může být zvýšena hydrolýzou proteinů před měřením • ruší Tris, nejlépe použít borátový pufr, pH 10.4 • měří se po přídavku NaOH, excitační vlnová délka 340 nm, emise mezi 440 a 455 nm CHO CHO Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči pomocí diagnostických proužků • Bromkresolový purpur (BCP) – specifický pro albumin, Bromkresolová zeleň (BCG) • acidobazický indikátor při určitém pH mění svou barvu (chovají se jako slabé kyseliny, přičemž protonovaná forma má jiné zbarvení než disociovaná forma): při pH nižším než 3,5 jsou žluté, při vyšším pH jsou zelené až modré Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči pomocí diagnostických proužků • v reakční zóně testovacího proužku je kromě indikátoru i pufr, který udržuje pH v rozmezí 3,0 až 3,5, indikátor tedy má žlutou barvu • AA bílkovin se vážou na indikátor → změní jeho vlastnosti → přechodová oblast se posune směrem ke kyselejšímu pH. • indikátor s navázanou bílkovinou má zelenou barvu, jako kdyby byl v alkaličtějším prostředí (proto bílkovinná chyba indikátoru) • intenzita zbarvení závisí na c bílkoviny, kolísá od zelené až po modrou a hodnotí se vizuálně nebo instrumentálně Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči pomocí diagnostických proužků • FP: u výrazně alkalických močí (pH nad 8), je-li moč velmi koncentrovaná (dojde k vyčerpání pufru v reakční zóně), vysoké koncentrace některých látek s aminoskupinami (kontaminace odběrové nádoby některými dezinfekčními prostředky), jež se na indikátory váží podobně jako bílkoviny • nevýhoda: rozdílná citlivost vůči jednotlivým bílkovinám • proužky reagují velmi dobře s ALB (od 0,1 až 0,5 g/l), nižší citlivost u globulinů, glykoproteinů a Bence-Jones bílkoviny • nelze prokázat tzv. mikroalbuminurii (c ALB 20 až 200 mg/l, resp. denní ztráty albuminu v rozmezí 30 až 300 mg/24 hodin) • průkaz glomerulární proteinurie Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči kyselinou sulfosalicylovou • zákal vzniká asi od 0,1 g/l (údaje se liší) a více než v případě detekčního proužku reagují i tubulární proteiny (glykoproteiny), globuliny a mikroproteiny • vyšetření je tedy více citlivé při malých tubulárních proteinuriích • při hodnotách nad 0,5 g/l zjištěných detekčním proužkem není tedy toto vyšetření nutné • hraniční hodnoty jsou kolem 0,3 g/l, jasně patologické nad 0,75 g/l (extrémní zvýšení nalezneme u manifestního nefrotického syndromu vždy nad 5 g/l) • glomerulopatie, tubulointersticiální nefropatie, gamapatie (jako paraproteinurie), mikroalbuminurie Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči Proteinurie • prerenální - (overflow proteinuria) při nadměrné tvorbě nízkomolekulárních proteinů a peptidů, překračující normální resorpční kapacitu tubulů. Nalezneme ji při zvýšené tvorbě poly nebo častěji monoklonálních lehkých řetězců jako Bence-Jonesovu bílkovinu, fibrin degradačních produktů (FDP) při hyperkoagulaci, alfa-1-kyselého glykoproteinu (orosomukoidu) při zánětech, při hemolýze a rhabdomyolýze (hemoglobin a myoglobin - ovšem ty nejsou detekčními papírky jako protein zachyceny), lysozymurie u nádorů. • glomerulární - při zvýšené propustnosti bazální membrány glomerulů. Nález v moči je dán selektivitou či neselektivitou proteinurie, dle přítomnosti a intenzity zánětu může být provázen i leukocyturií a erytrocyturií. Stanovení bílkovin Stanovení bílkovin v moči Proteinurie • tubulární - při poruše zpětné resorpce profiltrovaných hlavně nízkomolekulárních bílkovin, které jsou tak indikátory poškození tubulů. Jde o beta-1-mikroglobulin, alfa-1-kyselý glykoprotein, retinol vázající protein (RBP), alfa-1-mikroglobulin, N-acetyl-beta-D glukosaminidáza (NAG), při zvýšené sekreci tubulárních bílkovin a enzymů např. vyvolané zánětlivými intersticiálními procesy (Tamm - Horsfallův glykoprotein, enzymy kartáčového lemu - LDH, ALP) a opět lyzozomální NAG • postrenální - při zánětech, atrofii, nekrózách a nádorech vývodných močových cest, kdy se dostávají průnikem krve nebo exsudátu do moči vysokomolekulární komponenty (alfa-2makroglobulin, IgM, HDL-lipoprotein). Stanovení bílkovin Kazuistika • mladá žena s horečkou, bolestmi v podbřišku a dysurií Anamnéza • RA: matka zdravá, otec je po operaci pro ucpání močovodu kamenem, bratr zdráv • OA: dosud vážněji nestonala, běžné respirační infekty, 3x měla angínu, brala antibiotika. Mívá potíže s krční páteří. Operace 0, úrazy 0, léky trvale nebere, kromě antikoncepce. • GA: Menstruace od 12 let, pravidelná. • AA: 0 • SA: Studuje střední školu. Bydlí s rodiči. • EA: Týden pobyt v přírodě pod stanem, před 2 dny se vrátila. • NO: 2 dny teplota do 38 °C, bez třesavky, celková malátnost, pálení při močení, bolesti v podbřišku, močí často a malé porce, moč je tmavší. Stanovení bílkovin Laboratorní nálezy vyšetření výsledky FW (sedimentace) 28/45 (mírně zvýšená) Krevní obraz leukocyty 12 000/μl (↑) diferenciální rozpočet 70 % neutrofilů 5 % tyčí (↑) 20 % lymfocytů 35 % monocytů Biochemie urea, kreatinin, Na, K, Cl, jaterní testy v normě CRP 61 mg/l (↑) Moč chemicky bílkovina +++ krev ++ žlučová barviva 0 sediment leukocyty - plné pole erytrocyty - plné pole válce 0 Imunochemie • Základní pojmy o Antigen o Protilátka o Reakce antigen-protilátka • Imunoreakce • Imunochemické metody • Kazuistiky Imunochemie základní pojmy Antigen • polymer – protein, polypeptid, polysacharid, nukleoprotein • vlastnosti: imunogennost (navozují specifickou imunitní odpověď) a specifičnost (specificky reagují s produkty této odpovědi) → antigennost • faktory ovlivňující vyvolání imunitní odpovědi o chemická povaha o velikost (neúplný antigen = hapten) o komplexita o valence o konformace, přístupnost o cizorodost o genetická příbuznost Imunochemie základní pojmy Antigen • antigenní determinanta = epitop (konformační, sekvenční) • skupina molekul na povrchu antigenu - specifické, reakce s vazebným místem protilátky • počet = valence antigenu • hapten (nekompletní antigen) = nemůže navodit tvorbu protilátek, ale specificky reaguje s produkty imunitní odpovědi Imunochemie základní pojmy Protilátky (Ab) - imunoglobuliny • Produkce plazmatickými b. vyvíjejícími se z B-lym po stimulaci antigenem • Glykoproteiny (4 – 18 % sacharidy) • Paratop – vazebné místo pro antigen • v lidském těle cca 10 000 různých Ig (cca 20 % plazmat. bílkoviny) • IgG: 75% sérových Ig, monomer, prochází placentou • IgM: 10% sérových Ig, pentamer, inicializuje imunitní odpověď • IgA: 15% sérových Ig, mono a dimer, hl. imunoglobulin sekretů (proti lokálním infekcím) • IgE: nízké koncentrace, snadná vazba na buňky, alergie • IgD: stopová množství, monomer, fce ??? Imunochemie základní pojmy Reakce antigen-protilátka • vazebné síly: elektrostatické, vodíkové, van der Waalsovy, hydrofobní interakce • imunokomplex je stabilní v rozmezí pH 4-9 • možnosti disociace: vysoké nebo nízké pH (močovina, chaotropní látky) • afinita = míra vazebné síly mezi jednou antigenní determinantou a protilátkou • avidita = míra stability komplexu • specifita = mírou je procento zkřížené reakce s látkou, pro jejíž stanovení není určena • sekundární projev interakce ag-ab = precipitace Imunochemie základní pojmy Reakce antigen-protilátka • Monoklonální Ab o produkty jednoho klonu plazmatických buněk, připravených v laboratorních podmínkách hybridomovou technologií (buněčná fúze myelomových b s lymfocyty sleziny imunizovaných myší) o namířené proti jednomu epitopu určitého antigenu, identické kopie molekul Ig, které mají stejnou primární strukturu a stejnou specifitu vazebných míst o vyznačují se výraznou specifitou, ale špatně precipitují Imunochemie základní pojmy • Polyklonální protilátky (konvenční protilátky) o připravují imunizací zvířat (obvykle králíci, kozy, ovce) antigenem o krevní sérum imunizovaného zvířete, které obsahuje protilátky proti antigenu použitému k imunizaci, se označuje jako antisérum o Pokud byl k imunizaci použit jeden antigen (např. jedna bílkovina), vytvářejí se monospecifické protilátky (antisérum) o každý epitop v molekule antigenu stimuluje na tvorbu protilátek jeden klon B-lym o protože kompletní antigeny mají více epitopů, aktivují několik klonů B-buněk → směs monoklonálních protilátek, lišících se tím, že jejich vazebná místa mají různou afinitu, a tím i specifitu k jednotlivým epitopům určitého antigenu o imunizace zvířat směsí antigenů navozuje produkci polyspecifických protilátek, obsahující Ig proti většímu počtu antigenů (např. antisérum proti bílkovinám lidského séra používané při imunoelektroforéze) Imunochemie základní pojmy Reakce antigen-protilátka – imunoprecipitační křivka • 1935 – Heidelberger a Kendall • základem pro různé imunochemické metody, které mohou být prováděny v gelu nebo v roztoku Imunochemie základní pojmy Reakce antigen-protilátka – imunoprecipitační křivka • Oblast nadbytku Ab o se zvyšujícím se množstvím Ag vzrůstá precipitát o na všechna vazebná místa Ag jsou Ab → malé rozpustné komplexy AbAg, které se vzájemně nepropojují – úměrné ke c Ag o v supernatantu neprokazujeme žádný Ag, ale může se vyskytnout volná Ab o Imunoturbidimetrie, imunonefelometrie a nekompetitivních imunoanalýz • Oblast ekvivalence o dochází k vzájemnému propojování molekul Ag a Ab velké nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou strukturou, které agregují a vytvářejí imunoprecipitát o v supernatantu neprokazujeme volný Ag ani volnou Ab. o imunodifúzní metody Imunochemie základní pojmy Reakce antigen-protilátka – imunoprecipitační křivka • Oblast nadbytku antigenu o množství precipitátu klesá v důsledku vysoké c Ag o velké vzájemně propojené imunokomplexy se rozpadají o všechna vazebná místa protilátek jsou vysycena Ag a některé molekuly Ag zůstávají bez navázané Ab → malé rozpustné imunokomplexy o v supernatantu nejsou přítomny volné Ab, ale vzestupné množství volného Ag o podmínka nadbytku Ag musí být splněna u kompetitivních imunoanalýz Imunochemie základní pojmy Křížová reaktivita • antiserum proti Ag • přítomnost identických nebo velmi podobných epitopů (antigenních determinant) • Př. očkování proti černým neštovicím: Edward Jenner dosáhl ochrany proti černým neštovicím vakcinací odlišným, ale podobným virem kravských neštovic. Imunochemie základní pojmy Typy imunoreakcí Imunoreakce Typy imunoreakcí • Imunoprecipitační metody o Imunodifúzní metody – v gelu o Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie – v roztoku o Aglutinace o Imunoelektroforéza • Imunofixace • Imunoanalýza – EIA, RIA, FIA • Imunofluorescence • Imunoblotting • Microarray, imunosenzory…. Imunochemické metody • Klasické (precipitace, difúze, ELFO) o v klinických laboratořích využívají převážně pro kvalitativní nebo semikvantitativní účely o limitovány svou citlivostí a vzhledem k manuální náročnosti rozsah jejich nasazení v praxi postupně klesá • Moderní (imunoanalýza) o kvantitativní - na Ag nebo Ab je navázána určitá látka (značka, indikátor), což spolu s odpovídajícím způsobem detekce významně zvyšuje analytickou sensitivitu o automatizované Imunoprecipitační metody Imunodifúzní metody – v gelu (agar, agaróza) • jednoduchá – pohybuje se pouze jedna složka (tj. Ag nebo Ab) a druhá složka je rovnoměrně rozptýlena v gelu • dvojitá – pohyb obou složek • kvalitativní i kvantitativní Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie – v roztoku • výsledkem smísení roztoku Ag s odpovídající Ab je vznik malých agregátů → zákal • světlo, které prochází zakaleným roztokem, je rozptylováno na rozdíl od roztoku, kde neproběhla žádná imunochemická reakce • stupeň zákalu je v oblasti nadbytku Ab úměrný c Ag • turbidimetrie - spektrofotometr • nefelometrie - měření intenzity rozptýleného světla, které vychází z roztoku všemi směry, přístroj – nefelometr, využívající jako světelný zdroj obvykle laser Aglutinační metody • Využití o identifikace MO, živočišných b. a ery o stanovení krevních skupin, infekce Salmonella … • Přímá – s Ab reagují aglutinogeny na povrchu částic • Nepřímá - reagují rozpustné antigeny nebo hapteny, které předtím pasivně adsorbovaly na povrch b. nebo inertní částice (latex, ery) • Inhibice aglutinace – detekce a kvantifikace Ag Aglutinační metody Coombsův test = zjištění přítomnosti lidských Ig na ery membráně pomocí protilátek • Přímé – značená primární Ab nebo Ag • Nepřímé – využití sekundární Ab pro detekci Imunodifúzní metody • Jednoduchá imunodifúze (Oudin 1946) • Jednoduchá radiální imunodifúze (Manciniová) o 48 – 72 h : [Ag] ~ d o 6 – 24 h : [Ag] ~ log d o citlivost 0.02 mg/ml o kvantifikace IgG, IgM, IgA, IgD, albumin, … • Dvojitá radiální imunodifúze (Ouchterlony 1949) o pouze kvalitativní důkaz přítomnosti Ag o reakce identity = linie vytvořené Ag umístěnými vedle sebe plně splývají o Mr – zakřivení precipitačního obloučku o Koncentrace - vzdálenost od jamky Imunoelektroforéza • kombinace elektroforézy s imunodifúzí • v první fázi se směs Ag rozdělí podle své elektroforetické pohyblivosti na jednotlivé složky • ve druhém kroku se naplní kanálek podél elektroforeogramu požadovaným antisérem – monospecifickým nebo polyspecifickým • rozdělené Ag a Ab proti sobě difundují a v místě reakce antigenu a odpovídající protilátky se vytvoří precipitační oblouček • Klasická a protisměrná – kvalitativní • Raketová a dvourozměrná – kvantitativní Imunofixace • k identifikaci a typizaci monoklonálních Ig v séru, moči nebo mozkomíšním moku • v první fázi se směs bílkovin rozdělí podle elektroforetické pohyblivosti (agarózový nebo acetátcelulózový gel) – 6 startů • ve druhé fázi identifikujeme specifickou bílkovinu pomocí imunoprecipitační reakce • šablona na gel o první pruh s fixačním roztokem o do ostatních vyříznutých proužků se nanášejí specifické Ab (proti IgG, IgA, IgM a proti lehkým řetězcům κ nebo λ), které difundují do gelu a v místě, kde reagují s příslušným antigenem vytvářejí imunokomplexy ve formě precipitátu o promytím vhodným pufrem se odstraní jak Ag nereagující s aplikovanou Ab, tak i nadbytek Ab o ohraničné pruh se zvýrazňuje obarvením Imunofixace • kritickým bodem imunofixace je použití vhodného ředění vzorku (imunoprecipitační křivka) • Průkaz monoklonálních Ig • oproti imunoELFO – rycvhlost a asi 10krát vyšší citlivost • jen při podezření na přítomnost monoklonálního Ig (paraproteinu) – tzv. M-komponenty • Monoklonální Ig jsou celé molekuly Ig nebo jejich části (L nebo H řetězce), jejichž přítomnost je typická pro monoklonální gamapatii (b. necitlivé na regulační signály) • benigní x maligní formy (IgG, IgA: mnohočetný myelom = plazmocytom, IgM: Waldenströmova makroglobulinemie) • někdy jsou syntezovány společně s tzv. Bence-Jonesovou bílkovinou, jejíž molekula je tvořena monomerem či dimerem L řetězců (moč) • můžeme charakterizovat typ monoklonálního Ig, což umožňuje použití sady antisér (proti IgG, IgA a IgM a proti lehkým řetězcům κ a λ) Imunofixace • polyklonální Ig se projevují vznikem difúzně zbarvených precipitátů, prokazatelných při reakci s jedním nebo několika antiséry proti H nebo L řetězcům • monoklonální Ig se prokazují jako úzký silně obarvený proužek v difúzním precipitátu polyklonálních Ig při reakci s jedním z antisér proti H řetězcům a s jedním z antisér proti L řetězcům • Bence-Jonesova bílkovina vytváří úzký proužek pouze při reakci s jedním ze dvou antisér proti L řetězcům • Obr. IgG monoklonálního Ig (sérum – paraprotein IgG kappa, moč – volné L řetězce kappa) Kazuistika • mladá žena s bolestmi kloubů na rukách Anamnéza • RA: matka zdravá, otec zdráv, bratr zdráv • OA: dosud vážněji nestonala, pyelonefritida v těhotenství, Operace: apendektomie, úrazy 0, léky trvale nebere • GA: Menstruace od 13 let, pravidelná, 1 porod • AA: 0 • SA: vdaná, 4 měsíční dítě • EA: Kojí • NO: 2 dny teplota do 38 °C, s třesavkou Laboratoř • KO: normální nález Imunoanalýza • skupina imunochemických metod, které k detekci využívají dobře měřitelné značené látky – indikátoru a tím dosahuji vysoké citlivosti (detekční limity těchto metod dosahují hodnot 10-15 až 10-20 mol/l) Indikátor • radioaktivní izotop (radioizotopové metody) • nebo jiná látka: enzym, fluorescenční značka, DNA, koloidní částice a pod. • je obvykle navázaný na protilátku (imunometrická analýza), nebo na antigen • indukuje reakci Ag-Ab • levný, vysoce purifikovaný, specifická reaktivita, detekce µ-ng/ml Imunoanalýza Indikátor R: 125I, 3H, 14C E: peroxidasa, alkalická fosfatasa, glukosaoxidasa, G6PD, .. F: fluorescein-isothiokyanát (FITC) biotin-avidin koloidní zlato, kov + elektroluminiscence E + zesilovací systémy: chemiluminiscence, … Imunoanalýza • stanovení na základě využití přirozených vlastností Ab: 1/ schopnost Ab vázat se na široké množství přirozených i umělých sloučenin, buněk i virů, které se chovají jako Ag Ab jsou proteinového charakteru a jejich velké množství vazebných míst je odvozeno z obrovského počtu kombinací sekvencí AA. 2/ specificita protilátky pro reagující látku Tato vlastnost umožňuje stanovení velmi nízkých (až 10-12) koncentrací látek za přítomnosti dalších podobných sloučenin (např. stanovení stopových množství hormonů ve vzorku krve). 3/ síla vazby protilátky s antigenem Využití reakce Ab-Ag in vitro je základem imunochemických metod. Imunoanalýza Historie imunoanalýzy • 50. léta 20. století - fyzikové Rosalyn Yalowová (1977 NP) a Solomon Berson popsali princip kompetitivní RIA (radioimunoanalýzy), s jejíž pomocí změřili do té doby nedetekovatelná množství inzulinu v krvi (radioizotop I) • metody, založené na soutěži značeného a neznačeného antigenu o vazebná místa, bude možné vypracovat i pro další analyty • v roce 1971 se objevily metody, které místo radioizotopů využívaly enzymy = ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - Eva Engvallová s Peterem Perlmanem ze Švédska a Bauke van Veemen s Antonem Schuursem z Holandska. Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní http://pfyziollfup.upol.cz/castwiki2/wp-content/uploads/2012/04/Imuno.pdf Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní Imunoanalýza • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, více vzorků najednou • 2 typy: kompetitivní vs. nekompetitivní • Homogenní – detekce vzniku komplexu přímo ve vzorku • Heterogenní – nutná separace vzniklého komplexu pro závěrečná měření Imunoanalýza Enzymová imunoanalýza (EIA) • využívají enzymů (PO, ALP) ke značení Ag nebo Ab • enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) o heterogenní o jedna komponenta imunochemické reakce (Ag nebo Ab) nespecificky adsorbována na povrch pevné fáze (zkumavky, jamky mikrotitrační destičky, magnetické částice) Imunoanalýza Enzymová imunoanalýza (EIA) • homogenní EIA o nevyžaduje oddělení vázané (v imunokomplexu) a volné značené Ag nebo Ab • ke stanovení nízkomolekulárních látek (léků, hormonů steroidní a tyreoidální povahy a metabolitů), hapteny • vzorek obsahující stanovovaný Ag + známé množství téhož Ag s navázaným E (konjugát) a příslušnou Ab v omezeném množství (kompetitivní) • při vazbě Ab na E konjugátu se aktivní centrum může zablokovat nebo nastává konformační změna E molekuly spojená se ztrátou aktivity • čím je ve vzorku více neznačeného Ag, tím více molekul Ab s ním reaguje a tím zůstane zachováno více E aktivity v konjugátu • E aktivita je proporcionální c Ag v neznámém vzorku Imunoanalýza Kompetitivní enzymová imunoanalýza http://che1.lf1.cuni.cz/html/imuno.pdf Imunoanalýza Kompetitivní enzymová imunoanalýza Imunoanalýza ELISA – jednoduchá Přímá Nepřímá Imunoanalýza Nekompetitivní ELISA pro stanovení Ag • stanovení velkých Ag s několika vazebnými místy pro Ab (např. hCG, α1-fetoprotein, celkový IgE) • nezbytné dvě různé Ab namířené proti různým antigenním determinantám stanovovaného Ag • první Ab je v nadbytku navázaná na pevnou fázi • + vzorky nebo standardy obsahující Ag → první imunochemické reakce • po inkubaci → promytí a odstranění zbytku séra • v nadbytku je přidána druhá Ab značená E → reakce s další antigenní determinantou vyšetřovaného Ag • → vzniká sendvičový komplex – Ab-Ag-Ab-E • odstranění nezreagovaného konjugátu • přidá se S → enzymová reakce → měření absorbance produktu, která je přímo úměrná množství antigenu Nekompetitivní enzymová imunoanalýza pro stanovení Ag Imunoanalýza Imunoanalýza Nekompetitivní ELISA pro stanovení Ab • pro detekci specifických sérových Ab proti virům a parazitům, autoprotilátek a specifických protilátek IgE proti jednotlivým alergenům • na pevnou fázi navázán Ag (popř. alergen) v nadbytku • po přidání vyšetřovaného vzorku nebo standardů reagují všechny Ab přítomné ve vzorku s imobilizovaným Ag a vytvoří imunokomplex • vzniklé imunokomplexy prokazujeme pomocí druhé Ab proti lidským ig značené E • značené Ab mohou být namířeny proti jednotlivým Ig třídám (IgG, IgA, IgM či IgE)- význam např. pro určení fáze infekčního onemocnění (např. IgM v časné fázi a IgG v pozdější fázi) Nekompetitivní enzymová Imunoanalýza pro stanovení Ab Imunoanalýza Imunoanalýza ELISA – dvojitá sedvičová • pevnou fáze s navázanou Ab nebo Ag, které musí být v nadbytku vzhledem k analyzované látce Přímá Nepřímá Imunoanalýza ELISA – kompetitivní (nepřímá detekce Ag) Imunoblotting Western blotting • detekce proteinů po ELFO v PAA gelu – elektrotransfer proteinů z gelu na membránu a následná detekce pomocí série protilátek • první Ab s vysokou specifitou k proteinu a druhá Ab značená alkalickou fosfatázou, peroxidázou • využití – autoAb – antigangliosidové u neurologických autoimunitních onem. nebo u hepatopatií Imunochromatografie • Ag přítomný ve sledovaném vzorku s konjugátem za vzniku komplexu Ag-konjugát, který migruje směrem k specifickému proteinu imobilizovanému na porézní membráně (nitrocelulóza) • je-li ve vzorku přítomen Ag, vznikne v místě navázání komplexu Agkonjugát na imobilizovaný protein specifický band, signalizující pozitivní výsledek • nadbytek konjugátu přítomného v testu, migruje dále membránou a váže se na jiný imobilizovaný protein za vzniku druhého bandu, který signalizuje ukončení testu Imunochromatografie Imunochromatografická metoda v podobě kazetového testu (precipitace) • pro detekci protilátek proti HIV-1 a HIV-2 v lidském séru, plazmě nebo celé krvi • vzorek je aplikován na destičku → migruje přes konjugátovou destičku, rozředí se a smíchá s selenium-antigen koloidním konjugátem → tento roztok migruje přes pevnou fázi do pacientovy části (panelu), kde jsou imobilizované rekombinantní Ag a syntetické peptidy • jestliže jsou ve vzorku Ab, vážou se na antigen-selenový koloid a na Ag v pacientově okénku • jestliže Ab ve vzorku nejsou, antigen-selenový koloid projde pacientovým okénkem a nevytvoří se žádná červená linie • pro kontrolu kvality je zahrnut kontrolní panel Imunochromatografie Detekce genetického materiálu získaného ze vzorku • nejprve izolována DNA, která je použita pro duplex PCR- všechny primery jsou označeny (fluorescein, digoxigenin, biotin) → značené amplikony • amplikony aplikovány na imunostrip • je-li ve vzorku přítomna DNA z detekovaných buněk, uhlíkaté nanočástice se prostřednictvím interakce neutravidin-biotin váží na značené amplikony • při průchodu přes zónu obsahující Ab proti digoxigeninu jsou specificky zachytávány detekované amplikony Imunochromatografie Imunochromatografická detekce bakterií • imunochromatografické testy neboli LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay) se staly fenoménem poslední doby pro detekci rozličných analyt • velmi rychlé, jednoduché a nenáročné na přístrojové vybavení, což umožňuje jejich realizaci v provozních podmínkách • imunochromatografický test - nitrocelulózová membrána s imobilizovaným reaktantem (Ab) a vytváří tak testovací zónu • imunostrip tři různé podložky - pro aplikaci vzorku, podložka s konjugátem barevné částice a Ab, a absorpční podložka, která napomáhá vzlínání vzorku (v plastovém pouzdře) • vizuální hodnocení - pomocí barevných částic navázaných na jeden z imunoreaktantů, nejčastěji se používá zlato a uhlík. Imunochromatografie Imunochromatografická detekce • Toxiny A/B • Cl.difficile • Rota/Adeno viry • Str.pneumoniae • Leg.pneumophila serotyp 1 • Chřipka A/B • Chlamydia trachomatis Imunochemické analýzy v diagnostice • diagnostika v oblasti renálních, svalových, střevních a kožních biopsií či v průkazu extracelulárních substancí (např. kolagenu, amyloidu) a specifických infekčních agens (HPV, CMV apod.) • malignity - diagnóza, prognóza a/nebo predikce o slouží k diferenciální diagnostice nediferencovaných (anaplastických) nádorů o k subtypizaci epitelových a mezenchymových nádorů o ke klasifikaci hematologických malignit (leukémií a maligních lymfomů) o Ke klasifikaci ostatních nádorů či jejich odlišení od nenádorových reaktivních změn apod. o v poslední době stoupá prognostická a prediktivní role IHC u zhoubných nádorů, která spočívá v detekci proliferačních markerů, proteinů buněčného růstu, receptorů růstových faktorů a hormonálních receptorů aj. v závislosti na tom, jakou roli hraje prokazovaný antigen v patologické tkáni Imunochemické analýzy v diagnostice • testy určené k rychlé orientační diagnostice v terénu nebo u lůžka nemocného na principu tzv. suché chemie • reagencie jsou zakotveny v porézním materiálu, který je připevněn na podložce z plastu nebo je vložen do plastového rámečku s otvory pro nanášení vzorku a odečítání výsledků • stanovení hCG k průkazu těhotenství • troponin T v diagnostice infarktu myokardu • průkaz drog v biologickém materiálu Imunochemické analýzy v diagnostice Stanovení přítomnosti drog v moči nebo ve slinách • soutěž mezi drogou ve vyšetřovaném vzorku a konjugátem drogy, který je imobilizován v indikační zóně proužku, o omezené množství specifické Ab • reakční zónou obsahující specifické Ab navázané na barevné mikročástice, které se v průběhu reakce mobilizují • moč i rehydratované značené Ab postupují reakčním proužkem a v indikační zóně se setkají se zakotvenými konjugáty drog • pokud vyšetřovaný vzorek obsahuje drogu, vazebná místa barevně označených Ab jsou jimi saturována a nemohou se tedy navázat na imobilizované konjugáty drog • barva indikační zóny zůstane nezměněna a výsledek je odečítán jako pozitivní • v nepřítomnosti drogy ve vyšetřovaném vzorku jsou značené Ab zachyceny imobilizovaným konjugátem drogy - v indikační zóně se vytvoří barevný proužek, který znamená negativní výsledek Imunochemické analýzy v diagnostice Drogy v moči A – pozitivní B – negativní • Amfetamin • Metamfetamin • Barbituráty • Benzodiazepiny • Kannabinoidy • Kokain • Opiáty • Fencyklidin • Tricyklická antidepresiva