Protein-protein interakce • •Dobrovolná, Goišová, Siládiová, Svobodová, Kudláčková • • Protein-protein interakce •interakce mezi různými proteiny •funkci proteinu lze dobře zjistit, pokud se nám podaří odhalit jeho interakční partnery •Metody •metody, které umožňují interakci objevit •metody, které umožňují zjištěnou interakci ověřit/potvrdit a lépe charakterizovat •detekovat nové PPI umožňují zejména metody afinitní purifikace,imunoprecipitace, kvasinkový dvouhybridový systém, proteinové čipy a další Biacore system Biacore •Zařízení pro sledování biomolekulárních interakcí v reálném čase •Rezonance povrchových plazmonů umožňuje monitorovat vznik komplexu bez značení interagujících molekul • •Jedna část komplexu imobilizována na povrchu senzoru •Druhá interagující molekula je volně v roztoku pufru • •Použití: interakce proteinů, proteinových konjugátů, nukleových kyselin i celých buněk • Biacore - popis •Průtočný a optický systém •Ovládací software •Průtočné cely •Senzorový čip •Sada chemikálií navržených pro výzkum biomolekulárních interakcí • Průtočný systém •Dvě pumpy •nasávají pufr ze zásobní nádoby a pohánějí kapalinu systémem •Dvě nádoby •Automatický dávkovač • • Průtočné cely •Vzorky jsou ze zásobních nádobek přenášeny do katridže (dva módy) •Katridž •Důležité nízké rozmytí nanášeného vzorku (snížení mrtvých objemů a použití pneumatických ventilů) •Měřící cely (přitisknutím čipu na povrch kartidže) •Čtyři cely (jedna stěna cel je tvořena povrchem senzoru) Senzorový čip page23image3054441328 •Čip CM5 •CM4, CM3, C1, SA, NTA, HPA, L1, Au, SIA •Připevněn na plastovém nosiči •Plastový nosič je po vložení do přístroje oddělen vnitřním mechanismem a senzor je usazen na svoje místo •Proces usazení – indikován prostřednictvím zelené LED •50-100 opakovaných měření (v přístroji jeden týden) Optický systém •Skleněná strana čipu je v kontaktu se skleněným hranolem optické jednotky •Kontakt mezi hranolem a čipem zajišťuje silikonové optické rozhraní •Přes hranol dopadá na povrch čipu infračervené záření emitované LED •Odraz záření od povrchu čipu je monitorován pomocí pole fotodiod • •Detekční jednotka – optická jednotka obsahující světelný zdroj, detektor a optické rozhraní s čipem • Imobilizace ligandů •Kovalentní vazba – nejjednodušší – navážeme protein, NK,.. ligandem může být cokoliv •Afinitní vazba – př. avidin-biotin. Vazba je velmi silná. •Hydrofobní interakce – můžeme vytvořit lipidovou dvojvrstvu • Dextranová matrice •díky karboxyskupinám má záporný náboj •při správném pH do sebe natáhne bílkoviny s opačným nábojem •jde to použít i u nízkých koncentrací biomolekul • • Ph při imobilizaci – NH2 skupina přes EDC/NHS •pro bílkoviny jako ligandy obvykle pH 5 funguje dobře •používá se 10 mM acetátový pufr, prekoncentrace se vyzkouší 2 min při různých hodnotáchpH (5.5, 5.0, 4.5, 4.0) •prekoncentrace obecně lepší při nižším pH, ale kovalentní vazba probíhá lépe při vyšších pH •při nízkém pH také může nastat agregace bílkovin • Vazba přes aminoskupinu ligandu •V 80% se využívá tato metoda •Na dextranovou matrici naneseme směs EDC a NAS 1:1 •Po imobilizaci zbyde pár aktivních skupin. Přidáme 1M ethanolamin pH 8,5. •Ten vysytí zbytek NHS • Vazba přes thiol •2-(2-pyridinyldithio)ethanamin hydrochlorid - 80 mM ve 100 mM borátu pH 8.5 • Maleimidová metoda •vzniká stálá thioetherová vazba • Vazba přes aldehyd •aldehydová skupina se získá oxidací diolového uskupení pomocí jodistanum (1 mM, mírné podmínky) •alternativně lze koncový galaktosylový zbytek zkusit oxidovat pomocí galaktosaoxidasy •pro glykoprotein, oligosacharidy • Vazba přes thiol na ligandu •na povrch se vnese SH skupina •ligand derivatizován PDEA, vznikne SS vazba (reverz.!) • •průběh typického vazebného experimentu •signál v čase při vazbě biomolekuly na imobilizovaný ligand • Sensogram Stanovení koncentrace •1) přímé měření se zesílením odezvy •nejčastější způsob stanovení koncentrace analytu ve vzorku •vyhodnocovat lze buď rychlost vazby v počátku, nebo změnu signálu po ustálení •zvolený způsob měření ovlivní analytické parametry stanovení •rychlost, citlivost, limit detekce •vícevrstevný (sendvičový) komplex zlepší citlivost (např. nanočástice) • •2) inhibiční (kompetiční) stanovení •pro malé molekuly, jejichž přímá vazba by poskytla nízký signál •kalibrační závislosti v log závislosti pro osu x •signál vyvolá vazba pomocné detekční molekuly; její afinita a koncentrace ovlivní výrazně průběh stanovení • •3) přímé měření – bez kalibrace •pokud není k dispozici standard, lze za podmínek difúzní limitace určit koncentraci analytu z rychlosti vazby (lineární oblast) se znalostí (přibližnou) difúzního koeficientu analytu •je potřeba vysoká hustota ligandu, dostatečná velikost analytu (přes 5 kDa) a přiměřená afinita interakce •optimální je odezva 0.3–15 RU/s při 5 μl/min aspoň 30 s, to odpovídá asi 0.05–5 μg/ml • BiaControl •Pomocí Biacore systému lze získat: • informace o kinetice, affinitě, koncentraci, specifitě, selektivitě a termodynamice biomolekulárních interakcích •může být použita v různých oblastech od základního výzkumu po výzkum bioterapeutik a léčiv Imunoprecipitace Základné termíny •Antigen – látka s ktorou špecificky reaguje protilátka a dokáže vyvolať imunitnú odpoveď •Protilátka (imunoglobulín) – proteín, ktorý je súčasťou imunitného systému a je schopný identifikovať a zneškodniť cudzie objekty. Špecificky sa viažu na antigén. • Imunoprecipitace • je technika precipitácie proteínového antigénu z roztoku s použitím protilátky, ktorá sa špecificky viaže na tento konkrétny proteín. •Zdroje antigénu môžu byť neznačené bunky alebo tkanivá, metabolicky alebo vnútorne označené bunky, translatované proteíny in vitro. • Priebeh imunoprecipitácie •Cieľové antigény sú zvyčajne imunoprecipitované z komplexných roztokov, ako sú bunkové lyzáty s cieľom izolovať a nakoniec detegovať a merať špecifický proteín • Predimobilizovaná protilátka 1.Predimobilizácia protilátky proti špecifickému proteínu na nerozspustný nosič (agaróza, magnetické perličky). 2.Inkubácia s bunkovým lyzátom obsahujúcim cieľový proteín. Popri inkubácii sa lyzát mieša a to umožňuje naviazanie antigénu na imobilizovanú látku. 3.Imobilizované imunitné komplexy sa z lyzátu zozbierajú, elujú sa z nosiča a analyzujú sa. • Voľná protilátka 1.Voľná neviazaná protilátka sa nechá v lyzáte tvoriť komplexy s proteínom prítomným v lyzáte. 2.Oddelenie pomocou nerozpustného afinitného nosiča 3. •Použitie pri nízkej koncentrácii cieľového proteínu, pri nízkej vazebnej afinite k antigénu, alebo pomalej väzbe protilátky na antigén. • Použitie imunoprecipitácie •Identifikácia stavu aktivácie proteínov •Určenie posttranslačných modifikácii proteínov •Meranie molekulovej hmotnosti molekúl viažucich sa na proteín pri interakcii proteín-proteín •Purifikácia a detekcia antigénu • Imunoprecipitačné metódy •Imunoprecipitácia a aglutinácia v roztoku •Imunoprecipitácia v géle •Dvojitá imunodifúzia •Jednoduchá imunodifúzia • Imunoprecipitační metody ImunoprecipitaÄ�nà kÅ™ivka.png •IMUNOPRECIPITAČNÍ KŘIVKA •základní kvantitativní ukazatel stanovení analytů v tělesných tekutinách •1935 Heidelberger a Kendall • •1) Oblast nadbytku protilátky •se zvyšujícím se množstvím Ag vzrůstá precipitát •na všechna vazebná místa Ag jsou navázány Ab •malé rozpustné komplexy •množství komplexu antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného antigenu •imunoturbidimetrie a imunonefelometrie • ImunoprecipitaÄ�nà kÅ™ivka.png •2) Zóna ekvivalence •propojování molekul Aga Ab •velké nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou strukturou, které agregují a vytvářejí imunoprecipitát •imunodifúzní metody • •3) Oblast nadbytku Ag •množství precipitátu klesá v důsledku vysoké koncentrace antigenu •imunokomplexy se rozpadají •malé rozpustné imunokomplexy •kompetitivní imunoanalýzy Imunoprecipitační metody v gelu •agar nebo agaróza •nanášení protilátky a antigenu v různém uspořádání Ø Jednoduchá difúze – v agaróze se pohybuje pouze jedna složka (Ab nebo Ag), zatímco druhá je rovnoměrně rozptýlena Ø Dvojitá difúze – mohou se pohybovat obě složky volně • Jednoduchá radiální imunodifúze http://www.sbs.utexas.edu/sanders/Bio347/Images/Lectur41.jpg •kvantitativní, nenáročná na přístrojové vybavení 1)vzorek (obs. Ag) na jamku s monosp. Ab 2)inkubace desky při pokojové teplotě 48 – 72 hodin 3)Ag difunduje z jamek radiálně do agarosy; koncentrace protilátky konstantní; až do dosažení ekvivalence 4)komplexy – imunoprecipitát = ostrý bílý prstenec 5)Plocha precipitačního prstence nebo druhá mocnina průměru prstence je přímo úměrná koncentraci antigenu. •stanovení imunoglobulinů • Jednoduchá radiální imunodifúze Dvojitá imunodifúze Výsledek obrázku pro immunodiffusion types •často se používá úprava podle Ouchterlonyho •do gelu ve tvaru růžice jamky s Ag nebo Ab •difundují do okolí jamek radiálně •při setkání odpovídajících poměrech = precipitát (okolo Ab naneseme různé Ag -> precipitáty různých tvarů nebo více Ag ve vzorku -> více linií) •Podle tvaru linie usuzujeme identitu antigenů • Dvojitá imunodifúze •Ouchterlonyho dvojitá difúze je kvalitativní metoda vhodná k identifikaci Ag a určení jejich imunochemické příbuznosti, pokud jsou k dispozici příslušná antiséra, nebo opačně na důkaz přítomnosti protilátek pomocí čistých antigenů. • Imunoprecipitační metody v roztoku •Precipitát se může tvořit i v roztoku. Jeho množství se stanovuje kvantitativními metodami: imunoturbidimetrie a imunonefelometrie. • •Metody imunoprecipitace v roztoku jsou rychlejší, ale dražší než radiální imunodifúze • 1)smícháme roztok s Ag a roztok s Ab 2)vznikají malé agregáty a roztok se zakaluje 3)agregáty v roztoku rozptylují průchozí světlo a stupeň zákalu je v oblasti nadbytku protilátky úměrný koncentraci antigenu 4)a vzniklý zákal se měří turbidimetricky nebo nefelometricky • •Turbidimetrie využívá optických detekčních systémů, které měří intenzitu světla prošlého v přímém směru jako u klasické fotometrie. Proto je možno k detekci použít běžné spektrofotometry. •Nefelometrie je založena na měření intenzity rozptýleného světla, které vychází z roztoku všemi směry. Měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření, obvykle 45° nebo 90°. Vyžaduje speciální přístroj – nefelometr, využívající jako světelný zdroj obvykle laser. • Imunoelektroforéza •= kombinací elektroforézy a difúze 1)směs antigenů se rozdělí podle své elektroforetické pohyblivosti na jednotlivé složky 2)kanálek podél elektroforeogramu se naplní požadovaným antisérem – monospecifickým nebo polyspecifickým 3)rozdělené antigeny a protilátky proti sobě difundují a v místě reakce antigenu a odpovídající protilátky se vytvoří precipitační oblouček •časově náročná technika, ale umožňuje současnou detekci více antigenů • Imunofixace •identifikace a typizace monoklonálních imunoglobulinů v séru, moči nebo mozkomíšním moku •v gelu 1)směs antigenů se rozdělí podle své elektroforetické pohyblivosti na jednotlivé složky 2)identifikace specifické bílkovině pomocí imunoprecipitační reakce •použití vhodného ředění vzorku; k rozpadu imunokomplexu dochází při nadbytku jedné ze složek antigenu nebo protilátky; nízké koncentrace antigenu se nemusí prokázat, pokud vzorek příliš naředíme, a naopak při vysoké koncentraci se imunokomplexy rozpustí a nadbytek je vymyt • •v gelu 6 startů - vzorek téhož pacienta •po skončení elektroforézy se na povrch gelu přiloží šablona s vyříznutými proužky v zónách elektroforetických drah •do prvního proužku, který je určen pouze pro elektroforézu, se aplikuje fixační roztok, do ostatních vyříznutých proužků se nanášejí specifické protilátky, které difundují do gelu a v místě, kde reagují s příslušným antigenem vytvářejí imunokomplexy ve formě precipitátu •promytím vhodným pufrem se odstraní jak antigeny nereagující s aplikovanou protilátkou, tak i nadbytek protilátky •po promytí v gelu zůstanou pouze nerozpuštěné imunokomplexy, vytvářející ohraničný pruh, který se zvýrazňuje obarvením • Dvouhybridní kvasinkový systém (Yeast two-hybrid system, Y2H) Dvouhybridní kvasinkový systém •Použití in vivo – nedochází k ovlivnění umělými podmínkami • •Možnost testovat velké množství proteinů pomocí relativně jednoduchého experimentu • •Nemusíme znát přesný princip chování nebo umístění cílových proteinů • Transkripční faktor Ga14p •Obsahuje dvě části AD-schopná aktivovat expresi a DBD- DNA vazebná • •Zkoumaný protein fúzuje s DBD •Komplex DBDX- návnada (bait) • •Na doménu AD navážeme náhodné proteiny •Komplex ADY – kořist (prey) • Obrázek YH2.jpeg •Reportérové geny- exprese může být vizualizovaná a kvantitativně hodnocena • • např. GFP, luciferézy, chloramfenikol acetyl transferéza • Nevýhody •Poskytovala falešné pozitivní či negativní výsledky • •Interakce pouze solubilních proteinů • •Nutné ověření dalšími nezávislými metodami • např. bimolekulární fluorescenční komplementace • Eliminace falešných výsledků •Snížení úrovně exprese cílových proteinů použitím kvasinkových centromerických vektorů • •Využíváno většího počtu reportérských genů • Děkujeme za pozornost.