Metody sekvenování S. Meliorisová, M. Madrzyk, S. Sidorová, M. Šťastná, J. Polaček, A. Strunga Vysokokapacitní (high-throughput)analýzy •Nástroje pro souběžné zpracování a testování velkého množství vzorků nebo velkého množství analytů. 1.Amplifikace pomocí PCR (kvantitativní PCR arraye) 2.Hybridizace (mikroarraye = mikročipy) 3.Sekvenační metody •= určení sekvence nukleotidů dané molekuly DNA •V současné době nejrozšířenější způsob analyzování biologického materiálu •Vyvinuto více technik •Tradiční – Sangerova metoda, Maxam – Gilbertova metoda •Sekvenování tzv. druhé generace •Sekvenování tzv. třetí generace •Na začátku 70. let nepřímé sekvenování – RNA molekuly a proteiny •1975 – Frederick Sanger •1977 - Walter Gilbert, Alan Maxam •1995 – první zcela osekvenovaný genom bakterie Haemophilus influenzae •Od konce 70. let 20.století je možné rychlé a účinné sekvenování Cesta k sekvenácii ľudského genómu •1865 Gregor Mendel – otec genetiky – hybridizácia rastlín •1869 Friedrich Miescher – objav nukleínu (P, H, O) •1952 Rosalind Franklinová – X-Ray difrakcia DNA – helikálna štruktúra •1953 J. Watson, F. Crick - DNA jako dvojšroubovica •1961 Marshall Nirenberg – prelomil gen. kód v zmysle protesyntézy •1977 Frederick Sanger - rýchle DNA sekvenovanie •1983 Huntingtonova choroba – repetície CAG (izolácia o 10 rokov) •1989 PCR vyvinutá pre amplifikáciu DNA •1989 Identifikácia génovej mutácie pre cystickú fibrózu •1990 Prvý dôkaz o existencii BRCA1 génu •1990 „HUMAN GENOME PROJECT“ Sangerova metoda •„Dideoxy metoda“, •syntéza řetězce (až tisíc bp) •Použita v projektu sekvenace kompletního lidského genomu v roce 2001 •Vzorek DNA je rozdělen do čtyř paralelních reakcí •Směs obsahuje: DNA polymerázu, primer, deoxynukleotidy a jednotlivý dideoxynukleotid •dideoxynukleotidy se náhodně začlení do syntetizovaného řetězce místo příslušného dNTP a v tomto místě syntéza končí •Začlenění ddNTP se děje v náhodném místě ---> vznikají různě dlouhé fragmenty DNA, které se analyzují pomocí elektroforézy Maxam–Gilbertovo sekvenování •využívá chemického štěpení jednotlivých typů bází •pracuje s jednovláknovou DNA, která je na svém jednom konci (3’ nebo 5’) radioaktivně značená •Probíhá ve čtyřech paralelních reakcích, kdy se štěpí pouze určitý typ bází •Vznikají různě dlouhé fragmenty DNA končící v místě dané báze •Sekvenci analyzujeme za pomocí elektroforézy, kdy odečtením pozice jednotlivých bází ve všech čtyřech reakcích stanovíme sekvenci daného úseku. Sekvenování nové generace ●PCR se provádí paralelně pro všechny fragmenty DNA ●Paralelní sekvenování několika milionů sekvencí ●Délka získaných sekvencí cca 50 – 600 bp ●Sekvenační výtěžek jednoho běhu až několik tisíc Gb (až o 6 řádů vyšší než u kapilárního sekvenování) ●Cena sekvenace za bázi o řád až dva nižší než u kapilárního sekvenování ●Druhá generace: Ilumina, 454 sekvenování, Solid sekvenování, ●Třetí generace: SMRT, Nanopor, Microarray PROJEKT ĽUDSKÉHO GENÓMU METÓDY SEKVENÁCIE HGP (1990) •Medzinárodný výskumný program (13 r.) •Sponzori : National Institute of Health, U.S. Department of Energy •skepticizmus Ciele: •Medzinárodná spolupráca (IHGSC) •Vyvinúť technológie pre analýzu DNA, zmapovať a sekvenovať ľudský genóm •Všetky informácie verejne dostupné do 24 hod •2OO laboratórií v U.S., 18 krajín z celého sveta CELERA Genomics – Craig Venter •Craig Venter - zakladateľ Inštitútu genomického výskumu (Maryland) •Celera – 1998 •sekvenovať ľudský genóm za 3 roky •„preteky“ •Informácie dostupné iba pre platiacich zákazníkov •Predbežné patenty na 6000 génov •Plné patenty na približne 100 génov •(kontrola nad tým, kto získa prístup k informáciám) •HGP súčasne zvyšuje financovanie Sangerovho inštitútu (GB) Sekvenované genómy •Heamophilus influenzae (1995) - shotgun •Homo sapiens – chromozóm 22 (1999) •Drosophila melanogaster (2000) •Homo sapiens (2001) – súčasne Celera a HGP •Mus musculus (2002) HGP – hierarchiálne shotgun sekvenovanie (klon po klone) – DNA fragmenty Celera – shotgun celého genómu - rýchlejšie sekv. vďaka technike Konflikt – verejný a súkromný výzkum •2000 – tlak Bieleho Domu na urovnanie rozdielov •26 jún 2006 – vyhlásenie dvoch rôznych koceptov sekvenácie ľudského genómu •Preteky sú na konci, obe strany vyhrali •Craig Venter zostúpil z prezidentského kresla spoločnosti, keďže Celera začala smerovať viac k FARMÁCII Real-time PCR arraye •Přesný nástroj pro paralelní analýzu genové exprese a je využitelná pro ostatní aplikace kvantitativní PCR •Používají se reagenty jako v běžné PCR, detekce probíhá pomocí hybridizačních(TaqMan) nebo LNA sond, případně SYBR green I •Výhody: •Vysokokapacitní zpracování analýz •Přesnost, specificita kvantitativní PCR •Design arrayí je flexibilní, velké množství panelů DNA microarrays (čipy)- postup https://www.researchgate.net/profile/Yi-Wei_Tang/publication/26888549/figure/fig2/AS:27701689403392 5@1443057382645/Workflow-summary-of-printed-microarrays-Probes-are-PCR-amplified-or-oligonucleotide s.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c8/Microarray-schema.jpg DNA microarrays (čipy) •Hlavním principem: hybridizace komplementárních úseků DNA, z nichž jeden pochází z biologického vzorku, zatímco druhý je uměle připravený a funguje jako sonda (próba) , která je fixována na podložním sklíčku čipu, v přesně definované pozici •Nejvýznamnější výrobci Affymetrix a Agilent •DNA molekuly vzorku musí být před nanesením na čip označeny (fluorescenční značka) , aby mohla být identifikována jejich pozice a kvantita. •Hybridizační jednotka (spot) = plocha určená pro detekci jedné cílové sekvence •Každý spot obsahuje miliony kopií sondy Uspořádání čipu http://images.slideplayer.com/15/4665315/slides/slide_17.jpg http://images.slideplayer.com/15/4665315/slides/slide_17.jpg An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is 13062_2015_77_Fig1_HTML.jpg Image result for affymetrix Jednobarevný čipový experiment Image result for microarray Dvoubarevný čipový experiment (Agilent) •U cDNA čipů hybridizujeme na jednom čipu značenou ss-cDNA získanou z testovaného a referenčního vzorku. Proto je nutno každou ss-cDNA označit rozdílným fluorochromem. •Standardně: referenční ss-cDNA je Cy-3 – zeleně a testovaná ss-cDNA Cy5 – červeně •DNA z obou vzorků soutěží o sondy na jednom spotu a výsledný poměr nahybridizovaných molekul (=poměr intenzit signálů) bude odpovídat rozdílům exprese daného genu v obou vzorcích •Po hybridizaci následuje vymytí přebytečného materiálu a čtení (skenování) čipu pomocí fluorescenčního skeneru Aplikace mikročipových technologií •Exonové čipy •identifikace střihových variant transkriptů, kvantifikace jednotlivých střihových variant •SNP čipy •Genotypizace, forenzní analýza, predispozice k onemocněním •Chromatinová imunoprecipitace na čipu (ChIP on Chip) •Analýza interakcí proteinů s DNA in vivo na celogenomové úrovni •Využívá se kombinace imunoprecipitace chromatinu s vysokokapacitními mikročipy •Identifikuje vazebná místa pro studovaný protein v celém genomu současně •vs ChIP-seq •přesnější, větší citlivost, specificita, přímá identifikace získaných fragmentů, není limitován studovaným organismem •Nevýhodou je nemožnost analýzy pouze vybraných oblastí genomu, analýza dat je náročnější Výhody a nevýhody mikročipů •Výhody: využití v klinické diagnostice •ampliChip CYP450 - variantní alely genů pro cytochromy P450 •Nevýhody: •Čipové technologie jsou překonány sekvenováním nové generace Second-generation sequencing Metódy sekvenovania druhej generácie •Od roku 2005 vyvinuté nové metódy sekvenovania (rýchlejšie, lacnejšie) •Mnohonásobné paralelné sekvenovanie genómu v priebehu niekoľkých týždňov •Využívajú syntézu DNA podľa templátu •ILLUMINA, 454 sekvenovanie, Ion torrent a SOLiD sekvenovanie Výhody a nevýhody •Umožňujú sledovať tisícky ľudských genómov, vzniknuté mutácie, možné riziká ochorení •Detekujú pridávanie báz jednu po druhej •Sekvenujú tisíce až milióny DNA naraz •Nevýhodou je krátka maximálna dĺžka výsledných sekvencií (ca 100-500 báz) •Oproti Sangerovmu sekvenovaniu menšia presnosť a častejšie chyby pri čítaní DNA Postup pri sekvenovaní druhej generácie 1.DNA štiepená na kratšie reťazce 2.Naviazaný adaptér na konce týchto reťazcov (krátka DNA o presnej sekvencii) 3.Uchytenie DNA na pevný povrch (adaptér komplementárny ku reťazcom na sekvenačnom povrchu) 4.Amplifikácia uchytených reťazcov (vznik klastrov) 5.Zachytenie signálu kamerou ILLUMINA sekvenovanie •Nebulizace – vplyvom stlačeného vzduchu DNA rozdelená na menšie fragmenty (1-1000 bp), enzymatický upravené •Na konce sa naviažu dva adaptéry •Na pevnej doske DNA prichytená adaptérom, namnoží sa •Vzniká mozaika klastrov (zhlukov) identických DNA •Do rastúceho reťazca pridávané bázy s naviazanou fluorescenčnou farbou na 3‘ OH koniec (báza = špecifická farba) •Záznam vysoko citlivou kamerou, následne enzymatické odstránenie fluorescenčného značenia a blokujúcej časti molekuly •Podľa rozdielnej fluorescencie kamera rozozná typ pridanej bázy Obr. Bridge amplification ILLUMINA Analýza fluorescenčných signálov 454 sekvenovanie a Ion torrent •Dokáže analyzovať viac než 1 mil DNA naraz a dĺžka sekvencií je ca 700-1000 báz (1000 je max) •DNA prichytená na malú „guličku“ na ktorej sa amplifikuje, klony DNA pokryjú celý povrch •Guličky umiestnené do komôrky sekvenačnej doštičky, princíp pyrosekvenovania •Pri zachytení novej báze sa uvoľní pyrofosfát, enzymaticky spracovaný luciferázou => svetelný záblesk spracovaný citlivým detektorom (CCD kamera = charge-coupled device) •Do reakčnej zmesi je stále pridaný iba jeden typ báze •Pri pridaní rovnakých bází za sebou (pr. sekvencia DNA templátu je AAA) po pridaní troch T je vyžiarené 3x viac svetla •Kvalitatívna analýza – kde na doske sa uvoľnilo svetlo •Kvantitatívna analýza – koľko svetla sa uvoľnilo •Do zmesi pridávané všetky báze, medzi jednotlivými krokmi sú prebytočné báze premývané •Na podobnom princípe funguje Ion Torrent sekvenovanie, nemeria sa množstvo pyrofosfátu ale zmena pH Obr.: Amplifikačná doska SOLiD sekvenovanie (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) •Amplifikácia prebieha ako u pyrosekvenovania na mikroguličkách •Dochádza tu k sekvenácii ligáciou •K templátu sú pridávané sondy (krátke DNA tvorené dvojkombináciami nukleotidov = 16 rôznych sond) •Každá sonda nesie fluorescenčné značenie (4 rôzne) •Začiatok čítania sa vždy posúva o 1 nukleotid •Zo znalosti sekvencie adaptéru a výsledného signálu možno odvodiť výslednú DNA sekvenciu •Výstup podobný ako ILLUMINA •Problémom sú palindromické úseky Aktívne translatovaný transkriptom (RIBO-SEQ) Ribozómové profilovanie •Sekvenovanie mRNA translatovanej vo vnútri ribozómov •Ribozóm chráni tzv. ribozómový odtlačok Priebeh profilovanie I.Imobilizácia RNA-ribozómových komplexov II.Izolácia komplexov III.Naštiepenie nukleázou IV.Extrakcia mRNA fragmentov na gélovej elektroforéze V.Reverzná traskripcia na cDNA VI.Identifikácia sekvencií Využitie •Skúmanie počiatkov translácie •Zistiť rýchlosť syntézy proteínov •Vplyv vonkajších faktorov •Predikcia translačných produktov Výhody •Senzitivita a presnosť kvantifikácie •Presný popis translačných miest •Popis aktuálnej situácie v bunke Nevýhody •Riziko pomalej inhibície translácie •Kontaminácia rRNA •Vyžaduje väčšie množstvo materiálu ako mRNA-seq •Zložité vyhodnocovanie Sekvenovanie tretej generácie Nedostatky sekvenovania druhej generácie •Čítanie dlhých sekvencií •Sekvenovanie s dostatočnou presnosťou •Sekvenovanie z 1 molekuly DNA •1 nukleotid – slabý signál •Amplifikácia – chybovosť polymerázy Pacific BioSciences - SMRT •SMRT = single molecule real time sequencing •Syntéza komplementárneho vlákna DNA polymerázou •Hairpin adaptér – cirkulárna DNA – coverage •4 nukleotidy – 4 fluorofory •ZMW – Zero Mode Waveguids – svetlovody usmerňujúce svetelnú energiu do malého objemu → zeptoliter (10-21) Pacific BioSciences - SMRT A brief animated introduction to Pacific Biosciences' Single Molecule, Real-Time (SMRT) Sequencing, including the SMRT Cell and zero mode waveguide (ZMW). Note: NO AUDIO in this animation. Explanatory text is included. Learn more about PacBio at https://pacb.com/ Legal & Trademarks: Visit https://www.pacb.com/legal-and-trademarks/ Pacific BioSciences Sequel system PacBio RS II Oxford Nanopore Technology •Proteínová nanopórová membrána s vysokým elektrickým odporom •DNA •neznačená •Prechod vďaka vloženému napätiu •Meranie zmien elektrického prúdu •MinION, GridION, PromethION •DNA, RNA, proteíny Sekvenovanie tretej generácie •Nevyužíva amplifikáciu za účelom zvýšenia signálu (vyššia presnosť – accurancy) •Produkuje dlhé čítania •Dobrá presekvenovanosť GC bohatých oblastí •Epigenetika Ďakujeme za pozornosť