\\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png METODY KLONOVÁNÍ VYPRACOVALY: Jindřiška Fialová Michaela Jiříčková Lenka Jurasová Monika Kopečková Veronika Křešťáková Veronika Žajdlíková Výsledek obrázku pro homer cloning \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Vegetativní rozmnožování •Pokusy o dělení embryií •1981 - přenesli do oocytu jádra z myších embryonálních buněk a narodily se tři zdravé myši •1986 - Willadsen naklonoval ovci jádro z embryonální buňky tento vědec přenesl do vajíčka, které bylo právě v metafázi •V řadě případů klonování bylo pozorováno, že klony trpěly řadou poruch a snížením životaschopnosti a v některých případech měly zkrácené telomery •Genetické stáří jejich buněk tedy odpovídalo původnímu jedinci Později bylo zjištěno, že při klonování většiny buněčných typů dochází k obnovení délky telomer Trochu historie \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Klonování = vytváření nového jedince geneticky identického s předlohou. Tito dva jedinci se poté označují jako klony •Tento proces probíhá velice často v přírodě u rostlin i živočichů \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png = využívá schopnost bakterií přijímat a rozmnožovat kruhovité úseky DNA (plazmidy) 1) příprava rekombinantního vektoru •Vybrání vhodného úseku DNA •Není možné použít pouze sekvenci, kterou chceme namnožit. •Sekvence musí zahrnovat důležité enzymy pro replikaci, a zamezit, aby došlo k rozložení DNA pomocí nukleáz •vektor je DNA, která má tyto vlastnosti a je schopna proniknout do buňky •Plazmidy, bakteriofágní DNA, umělé bakteriální chromozomy (BACs) či kosmidy Klonování DNA \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png 2) přenos takto připravených vektorů do buněk •biologicky (pomocí adenovirů, retrovirů) •chemicky (pomocí látek které vyvolají endocytózu) •fyzikálně (tepelným šokem či elektropolací) •hostitelskou buňkou bývají bakterie (Escherichia coli), kvasinky, bakteriofágy 3) selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA a následně analýza klonované DNA. \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku text Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png PŘENOS DNA DO BUNĚK \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •transformace: přenos DNA do prokaryotických buněk • •transfekce: přenos DNA do eukaryotických buněk • •transfekuje/transformuje se buňka, nikoliv DNA Názvosloví \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Typy přenosu DNA •přenášená DNA se v buňce nachází pouze extrachromozomálním stavu, transgen se přepisuje po omezenou dobu •jedna buňka může obsahovat větší počet kopií přenesené DNA Transformace/transfekce přechodná Transformace/transfekce stabilní Kliknutím vložíte text. •přenášená DNA se začleňuje do chromozomu hostitelské buňky (tento děj nastává s nízkou frekvencí 10-5–10-6) •nízká pravděpodobnost výskytu dvou nebo více kopií transgenu v jedné buňce \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Metody přenosu - využití CaCl2 Navození stavu kompetence bakterií promytím buněk ledovým CaCl2 Obsah obrázku text Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Metody přenosu - využití CaCl2 •Transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým •DNA se smíchá s CaCl2 ve fosfátovém pufru dochází k precipitaci •Vznikne jemná sraženina DNA a fosforečnanu vápenatého •Endocytóza sraženiny Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Metody přenosu - elektroporace •Využitelné jak u bakterií, tak i u eukaryotických buněk •Vystavení krátkému elektrickému pulzu o vysokém napětí •V důsledku elektrického šoku dojde k otevření pórů v plazmatické membráně Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Další transfekční postupy 1.prostřednictvím DEAE-dextranu 2.lipofekce 3.využití genové pistole 4.využití mikroinjekce 5.využití virových a fágových postupů \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png SELEKČNÍ MARKERY \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Selekce buněk, které přijaly vektor Gen bla •Nachází se ve vektoru a poskytuje buňkám rezistenci k antibiotikům •Kóduje enzym β-laktamázu - hydrolýza β-laktamových antibiotik Využití bakteriálních enzymů fungujících u eukaryot •guanin-fosforibozyltransferáza (gpt) •aminoglykozid-fosfotransferáza (neo) •puromycin-N-acetyltransferáza Prokaryota Eukaryota \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Inzerční inaktivace - Modrobílý test Obsah obrázku snímek obrazovky Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti Obsah obrázku stůl, interiér, jídlo Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png KLONOVÁNÍ POMOCÍ VEKTORŮ \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Vektory •Replikace •Plazmidy nebo chromozomy bakteriofágů •10-15 kb •Fágomidy, kosmidy, YAC, BAC, PAC A close up of a sign Description generated with very high confidence \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Chemická mutageneze bisulfitem Hydrogensiřičitan \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Přímá syntéza požadovaného oligonuklidu •Vložení do plazmidu pomocí „sticky“ end – „lepkavé“ konce nebo „blunt“ •Až 100 nukleotidů Příprava ssDNA in vitro Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Dva komplementární oligonuklidy s přesahem •Náš vektor s restrikčními místy Oligo klonování \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png A close up of text on a black background Description generated with very high confidence PCR \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png A sign on the side of the water Description generated with high confidence \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •I. a III. – mimo X II. – uvnitř •Palindromy, lepivé konce (DNA-ligáza) •Rekombinantní DNA Vlastnosti RE \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Obsahuje gen a rekombinantní místo •Malá mobilní genetická jednotka •Rezistence na antibiotika, exotoxiny •Horizontální přenos •Genové inženýrství - RE Genová kazeta \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Mezi buňkami stejného druhu – nejčastěji bakterie •Pomocí fágů - transdukcí, transformací nebo bakteriální konjunkcí Horizontální přenos Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Obsahuje promotor, ORF, gen •Regulační oblasti •Různé přípony Expresní kazeta Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Klonování bez ligace •Produkt PCR s přesně navrženým koncem •Plazmid •https://go.takarabio.com/EU-In-Fusion-webinar-series.html?gclid=CjwKCAjwsfreBRB9EiwAikSUHSfqNhEQyL ERWZkSWP6VqbKsMRczR73B9LZUjkaDNgRkKOmnOh_hWhoCqEgQAvD_BwE LIC klonování \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku snímek obrazovky Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png •Mutace se ztrátou smyslu •Stop kodon •Mutace v antikodonu tRNA •Vnášení speciálních AMK Supresorová tRNA Obsah obrázku objekt, hodiny Popis vygenerovaný s vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png TA KLONOVÁNÍ \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku text Popis vygenerovaný s vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku snímek obrazovky Popis vygenerovaný s vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku snímek obrazovky Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png GATEWAY KLONOVÁNÍ \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku text, mapa Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Obsah obrázku snímek obrazovky Popis vygenerovaný s velmi vysokou mírou spolehlivosti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png VYUŽITÍ KLONOVÁNÍ \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Zabývá se vytvářením pozměněných či nových genů a jejich zaváděním do organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro Cílené změny v genetické informaci lze provádět také in vivo. SouvisejÃcà obrázek \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png DNA knihovny SouvisejÃcà obrázek SouvisejÃcà obrázek Do bakteriálních buněk je možno vložit fragmenty z celého buněčného genomu. à Genomová knihovna \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier Příprava lidského insulinu v bakteriálních buňkách Výsledek obrázku pro insulin \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících, nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. Příprava podjednotkové vakcíny viru hepatitidy B (HBV) ve kvasinkách SouvisejÃcà obrázek \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů Příprava mikroorganizmů pro biotechnologie Zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) Výsledek obrázku pro napadená kukuÅ™ice Výsledek obrázku pro kukuÅ™ice \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Potraviny a krmiva -Ovlivňování agronomických vlastností Rezistence k herbicidům Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.) Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd) -Modifikace posklizňových vlastností Prodloužení skladovatelnosti Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám -Rezistence k virům -Rezistence k hmyzím škůdcům -Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově chorobám Vylepšování nutriční hodnoty a chuti \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Živočichové - Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů - Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv) - Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky) - Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a farmakologii) -Ovce s vylepšenou srstí -Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace Vylepšování nutriční hodnoty a chuti Výsledek obrázku pro mouse ear \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Genové inženýrství Genová terapie léčba genetických chorob dědičných i nádorových Výsledek obrázku pro hemofilie https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/16/Phenylketonuria_testing.jpg/1024px-Phenyl ketonuria_testing.jpg Výsledek obrázku pro familiárnà hypercholesterolemie Výsledek obrázku pro cystická fibróza familiární hypercholesterolemie fenylketonurie hemofilie cystická fibróza Gaucherova choroba Výsledek obrázku pro gaucherova choroba \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png OTÁZKY K DISKUZI \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png Objev restrikčních endonukleáz umožnil spojovat ve zkumavce molekuly DNA jednoho druhu s molekulami DNA druhu jiného, a vytvářet tak rekombinantní molekuly DNA. Tyto molekuly lze vložit do živých buněk, kde se mohou exprimovat. Někteří lidé odmítají použití technologie rekombinantní DNA k modifikaci živých organismů, protože je to „nepřirozené“. Jiní tvrdí, že molekuly rekombinantní DNA se vytvářejí v nízké četnosti i v přírodě a že vědci pouze urychlují přirozené procesy. Jaký máte vy názor na tuto problematiku? A proč? \\DROBO-FS\QuickDrops\JB\PPTX NG\Droplets\LightingOverlay.png https://scontent-vie1-1.xx.fbcdn.net/v/t1.15752-9/45339969_1544992798979857_4079852390101024768_n.p ng?_nc_cat=102&_nc_ht=scontent-vie1-1.xx&oh=8285e8aa27037c2e6f869d30f2089531&oe=5C41E1E4