Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
Jméno a UČO:
Datum:
ÚLOHA E
Analýza polymorfismu pro ADH a stanovení její
aktivity v séru
TEORETICKÝ ÚVOD
Alkoholdehydrogenáza (ADH) je enzym oxidující primární a sekundární alkoholy a dioly. Zřejmě nejvýznamnějším z těchto alkoholů je ethanol, jehož metabolismus je lokalizován v gastrointestinálním traktu, především v játrech (až 98 %). Zde dochází účinkem ADH ve spolupráci s koenzymem NAD+ k oxidaci ethanolu na acetaldehyd. Vznikající acetaldehyd je pak dále oxidován aldehyddehydrogenázou (ALDH) na acetát, který ve svalové tkáni vstupuje do citrátového cyklu jako acetyl-CoA a je postupně přeměněn na CO2, H2O a energii v podobě 15 molekul ATP (obr. 1). Existuje několik typů ADH a ALDH enzymů, které jsou kódovány různými geny. Ukázalo se, že tyto různé varianty mohou u lidí ovlivňovat riziko vzniku závislosti na alkoholu. Přepokládá se, že mechanismus vzniku závislostí spojených s výskytem určitých forem ADH a ALDH je způsoben lokálním zvýšením obsahu acetaldehydu vyplývající buď z rychlé oxidace ethanolu, nebo pomalejší oxidace acetaldehydu.
Obr. 1: Metabolismus ethanolu
U lidí bylo identifikováno sedm různých genů pro ADH (ADH1A, ADH1B, ADH1C, ADH A, ADH5, ADH6, ADH7) nacházejících se na chromosomu 4. Jednotlivé formy ADH byly pak na základě podobného obsahu aminokyselin a kinetických parametrů rozděleny do pěti tříd. Třída I obsahuje geny pro ADH1A, ADHIBaADHIC, které mají hlavní podíl na oxidaci ethanolu v játrech. Do třídy II patří gen pro ADH4, který se uplatňuje při oxidaci ethanolu až při vyšších koncentracích. Gen pro ADH5 patřící do třídy III kóduje enzym zvaný formaldehydehydrogenáza a vyznačuje se velmi nízkou afinitou pro ethanol. mRNA ADH6 (třída IV) byla izolována z jater plodu i z jater dospělých jedinců, tento enzym
CH3CH2OH + NAD+ <—> CH3CH=0 + NADH + H+
dýchací řetězec
í> I4ATP + H2O
1
Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
však doposud nebyl z tkáně vyizolován a je o něm známo jen málo. Do poslední rodiny V patří ADH7, který se podílí na oxidaci retinolu a v menší míře také na oxidaci ethanolu.
U genů pro ADH1B a ADH1C bylo objeveno několik SNPs ovlivňujících kinetické vlastnosti těchto enzymů. Například polymorfismus nacházející se v kódující oblasti ADH1B genu, který vede k záměně aminokyseliny argininu v pozici 48 za histidin (ADH1B*48H) nebo polymorfismus v genu ADH1C vyznačující se záměnou valinu v pozici 350 za izoleucin (ADH1C*350I). Tyto substituce mají za následek produkci atypických forem enzymů s mnohonásobně zvýšenou Vmax pro oxidaci etanolu na acetaldehyd oproti formám klasickým (zvýšení až o 70%). Výsledky řady analýz ukazují, že polymorfismy ADH1B*48H a ADH1C*350I se právě vyskytují u osob s nadměrnou konzumací alkoholu. Přímá souvislost mezi polymorfismy a alkoholismem však nebyla potvrzena.
Reštrikční analýza
Reštrikční endonukleasy jsou enzymy, které rozpoznávají ve dvoušroubovicové DNA specifickou sekvenci složenou obvykle ze 4 až 6 párů bazí a v tomto místě DNA specificky štěpí. Většina rozpoznávaných sekvencí restrikčními enzymy jsou tzv. palindromy. Některé reštrikční enzymy katalyzují štěpení dvou vláken DNA v polohách symetricky rozmístěných okolo středu palindromové sekvence (Hha\); vznikají tak fragmenty s kohezními či lepivými konci. Jiné reštrikční enzymy naopak štěpí řetězec přímo ve středu palindromu (Ssp\). Vznikají pak fragmenty se zarovnanými či tupými konci.
K analýze jednotlivých polymorfismů využijeme reštrikční analýzu genu ADH1C za využití restriktasy Ssp\ (rs698). Jako materiál pro analýzu bude sloužit vzorek lidské krve, ze kterého budeme amplifikovat část oblasti genu obsahující daný polymorfismus, a následně se provede reštrikční analýza.
Reštrikční místo pro restriktasu Ssp\: AAT| ATT
TTA|TAA
Záměna Val/lle v genu ADH1C je výsledkem jednonukleotidové substituce G/A, kdy štěpení restriktasou Ssp\ podléhá alela A.
Aktivita ADH
Aktivita ADH se měří kolorimetrickou metodou využívající redukci N,N-dimethyl-4-nitrosoanilinu (NDMA) a ethanolu jako substrátu. Výrazně žlutý NDMA je v přítomnosti NADH+H+ enzymaticky redukován na bezbarvý hydroxylaminový derivát. Jde tedy o recyklaci koenzymu, který se redukuje při oxidaci ethanolu a následně se opět oxiduje při redukci NDMA. Změna zbarvení reakční směsi se pozoruje při 440 nm.
Odběr kapilární krve
Kapilární krev se používá v případech, kdy je třeba jen malé množství vzorku. Hlavní zásady při odběru:
■ prohřátím místa vpichu (bříško prstu, ušní boltec, u kojenců pata) zabezpečit dobré prokrvení (přiložit teplý vlhký obklad 3 min před vlastním odběrem)
■ místo vpichu dezinfikovat
■ vpich směřovat ze strany do bříška prstu, kde je lepší prokrvení než ve středu
2
Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
■ po nabodnutí lancetou první kapku otřít (příměs tkáňového moku), další tvorbu kapek podpořit lehkým tlakem (při silném vymačkávání je v krvi příměs tkáňového moku)
■ krev se obvykle odebírá do speciálních kapilárních krevních zkumavek nebo do malých plastových či skleněných zkumavek. U proužkových testů se kapka krve aplikuje přímo.
■ po odběru přiložit na místo vpichu vatu smočenou dezinfekčním prostředkem
Zpracování krve
Krev odebraná bez použití protisrážlivých prostředků se po kratší době sráží, v důsledku přeměny rozpustného fibrinogenu na vláknitou síť fibrinu. Odstředěním (10 min., 10 OOOxg, pokojová teplota) sražené krve se získá sérum. Doba srážení musí být dostatečná (při pokojové teplotě po 15-30 min). Předčasné oddělení séra od krevních elementů však může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a koagulaci séra.
Postup práce:
Odběr vzorku krve
Odběr kapilární krve se provádí z boku špičky prstu (toto místo je nejméně citlivé na bolest)
1. Připravte si sterilní, jednorázovou autolancetu - odšroubujte sterilní čepičku a nastavte hloubku vpichu.
2. Otřete prst kapesníčkem s alkoholem a vyčkejte, dokud prst nebude úplně suchý.
3. Uchopte jednorázovou autolancetu mezi ukazováčkem, prostředníčkem a palcem. Přitiskněte autolancetu pevně z boku ke špičce prstu (toto místo je nejméně citlivé na bolest) a palcem stiskněte spoušť na doraz.
4. První malou kapku otřete a další tvorbu kapek podpořte jemným masírováním prstu směrem ke konečku.
5. Krev odeberte do sterilní mikrozkumavky. Odeberte vzorek pro PCR a zbytek krve nechte srážet 30 min.
PCR
1. Smíchejte 4 u.1 odebrané krve se 4 u.1 5 nM EDTA.
2. Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Složení reakční směsi
krev 2,5 u.1
Ssp\ F+R primer (10 u.M) 1,5 ul
Kapa MasterMix B 12,5 u.1
DMSO 1,3 \i\
PCR voda 7,2 u.1
3.   Reakční směsi jemně promíchejte, krátce stočte a vložte do termocycleru. Na termocycleru nastavte následující program:
3
Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
95°C 5 min
95°C 30 s 1
55°C 30 s MOx
72°C lmin J
72°C 5 min
Reštrikční analýza polymorfismu penu ADH1C
1. Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Reakční směs Sspl
PCR produkt 10 u.1
lOx FastDigest Buffer Green 2 u.1
Enzym Sspl 1 u.1
PCR voda 7 u.1
2. Reakční směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 20 min při 37°C.
3. Připravte si 1,5% agarosový gel.
4. Vzorky naneste na gel v následujícím pořadí:
Délkový marker -RA Sspl
Stanovení aktivity ADH v krevním séru
1. Sraženou krev centrifugujte 10 min při pokojové teplotě při 10 000 x g.
2. Opatrně odeberte sérum a přeneste do sterilní mikrozkumavky.
3. Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do mikrokyvety:
Vzorek
Sérum 20 u.1
Reakční pufr 60 u.1
4. Reakční směs promíchejte a měře změnu absorbance při 440 nm po dobu 20 min při 25°C. Vyhodnocení
Na základě výsledku reštrikční analýzy určete, jaký genotyp ADH 1C genu obsahoval váš vzorek krve Vypočtěte specifickou aktivitu ADH (£440 N DMA = 34-103 M _1.cm_1) v kat/ml séra
4
ÚLOHA F
Analýza Leidenské mutace
TEORETICKÝ ÚVOD
Jednou ze základních funkcí krve v organizmu je udržování stálého vnitřního prostředí tzv. homeostázy, což je základní podmínka pro jeho správné fungování resp. existenci. Vzhledem k této nezastupitelné roli krve v těle, musí existovat mechanizmus zabraňující jejím nadměrným ztrátám v případě poranění. Schopnost krve srážet se v místě poranění je složitý mnohastupňový proces (Obrázek 1), který je na každé úrovni přísně regulován. Účinná regulace tohoto procesu je obzvláště důležitá, protože nekontrolované srážení krve by mělo pro organizmus fatální následky.
Podnětem ke vzniku krevní sraženiny však nemusí být pouze vnější poranění, může jít i o souhru endogenních pro-koagulačních faktorů, jako je zpomalení krevního průtoku cévou, poranění krevní cévy či geneticky podmíněná zvýšená krevní srážlivost.
Genetická dispozice ke zvýšené krevní srážlivosti představuje významný rizikový faktor. Jde o případy, kdy jsou v důsledku mutace v těle produkovány krevní faktory v pozměněné formě, což způsobuje např. jejich funkční změny či zvýšenou koncentraci. U osob s těmito dispozicemi ovšem ke spontánním trombózam obvykle nedochází, teprve až v součinnosti s dalšími rizikovými faktory se může, ale také nemusí, krevní sraženina vytvořit.
Poraněni
I
XII
Xlla
Prothromhin     Th rum bifl
I
1
Sraženina
Obrázek 1. Schéma procesu srážení krve
5
Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
V rámci cvičení bude provedena analýza jednonukleotidového bodového polymorfizmu (SNP) 1691 G/A genu pro faktor V. Faktor V je plazmatický glykoprotein s klíčovou rolí v koagulaci. V koagulační kaskádě působí buď prokoagulačně (pokud byl natráven trombinem či aktivovaným faktorem X) nebo antikoagulačně (pokud byl natráven aktivovaným proteinem C). Tzv. Leidenská mutace způsobuje rezistenci faktoru V k aktivovanému proteinu C, což vede k nedostatečné degradaci mutované varianty proteinem C. Tato mutace je nejznámější a nej rozšířenější, vyskytuje se cca u 5 % osob v populaci. Nositelům Leidenské mutace hrozí až 7x vyšší riziko žilní trombózy.
Ke genotypizaci vzorku bude využita reštrikční analýza s následnou detekcí vzniklých fragmentů pomocí 2% agarózového gelu. Princip metody spočívá ve štěpení produktů amplifikace části genu pro faktor V pomocí reštrikční endonukleázy Taq\, kdy buď dochází ke štěpení PCR produktu (wt alela) nebo nedochází ke štěpení PCR produktu (mutantní alela).
Postup práce:
PCR
1. Smíchejte 4 ul odebrané krve se 4 ul 5 nM EDTA.
2. Připravte reakční směsi dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Složení reakční směsi
krev 2,5 ul
3.   Reakční směsi jemně promíchejte, krátce stočte a vložte do termocycleru. Na termocycleru nastavte následující program:
FV F+R primer (10 uM) Kapa MasterMix B PCR voda
1,5 ul 12,5 ul 8,5 ul
95°C
5 min
95°C
55°C
72°C
72°C
5 min
Reštrikční analýza polymorfismu penu pro FV
1.   Připravte reakční směs dle uvedené tabulky do PCR zkumavky:
Reakční směs Sspl PCR produkt
lOx FastDigest Buffer Green Enzym Taq\
10 ul
2 m
lul
6
Úloha E+F - Analýza SNP ADH a stanovení aktivity/Analýza Leidenské mutace
PCR voda 7 \i\
2. Reakční směs promíchejte, krátce stočte a inkubujte 20 min při 37°C.
3. Připravte si 2.0 % agarosový gel.
4. Vzorky naneste na gel v následujícím pořadí:
Délkový marker -RA Taq\ Vyhodnocení
Na základě výsledku reštrikční analýzy určete, jaký genotyp genu pro FV obsahoval váš vzorek krve a jestli jste nositeli Leidenské mutace.
7