investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky DEN 1 VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ KE STUDIU GENOMU ARABIDOPSIS THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Úvod Dopolední část bude věnována analýze aktivity promotorů pomocí transkripční ffize a chemicky indukovatelného transkripčního aktivačního systému a dále praktickému osvojení softwaru pro design sekvence oligonukleotidů OLIGO 6 včetně navržení sekvence PCR primerů. Odpolední část zahrne vlastní syntézu, purifikaci a kontrolu kvality PCR primer a přípravu experimentu pro tranzientní expresi proteinů v tabákových rostlinách. Časový harmonogram1 7:45 Sraz v učebně A2/1.21 7:50 Zahájení semináře (Jan Hejátko), UKB, Kamenice 5, budova A2, místnost 1.21 8:00 PŘÍPRAVA MATERIÁLU (Jan Hejátko), laboratoř 334 8:15 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko) 1. Teoretický úvod 2. Zahájení barvení 9:00 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 1. Teoretický úvod 2. Zahájení indukce dexametazonem 10:05 DESIGN SEKVENCE PCR PRIMERŮ (Hana Konečná), místnost 1.21 11:00 Kontrola barvení 11:15 DESIGN SEKVENCE PCR PRIMERŮ (Hana Konečná), místnost 1.21 11:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 3. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 11:45 - 12:45 OBĚD 12:45 SYNTÉZA OLIGONUKLEOTIDŮ (Hana Konečná), Centrální laboratoř 342 14:00 ANALÝZA BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ A PROTEIN-PROTEINOVÝCH INTERAKCÍ (Markéta Šámalová), laboratoř 334 Infiltrace listů tabáku 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 1. DNE 1 jednotlivé časy se mohou měnit podle potřeby a rychlosti zvládnutí jednotlivých metod 1 investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Příprava materiálu Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky. Práce v laboratoři • Bezpečnost • Zdroje vody • Základní chemikálie • Odměřování a pipetování • Skladování • Odpady a použitý materiál • Sterilizace Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály: • ddH20 (sterilní, 50ml) • 70% etanol /100% etanol • Špičky/zkumavky (sterilní) • Pinzetu • Barvící pufr a destičky • Tužky, fixy, popisovači nálepky Komponenty PCR reakce. V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie: • Taq DNA polymeráza • 1 Ox koncentrovaný PCR pufr s MgCh • dNTP • primery Metoda 1A Analýza aktivity promotoru pomocí transkripciu' fůze s reportérovým genem uidA (GUS) 1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok do barvící destičky (2 ml) 2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru 3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.) 4) Vložte do termostatu (37 °C) . 5) V cca dvouhodinových intervalech provádějte kontrolu barvení pomocí stereomikroskopu. 6) Barvení zastavte pomocí 80 % etanolu, ve kterém ponechejte semenáčky odbarvovat při pokojové teplotě do druhého dne. 7) Vyměňte etanol a opět nechte odbarvovat (2. den, úterý). 8) Proveďte projasňování semenáčků (4. den, čtvrtek). 9) Opatrně přeneste projasněné semenáčky na sklíčka a připravte preparáty pro automatickou mikroskopii (4. den, čtvrtek). 10) Spuštění automatického mikroskopu (přes noc;4. den, čtvrtek). 11) Vyhodnocení výsledků barvení (5. den, pátek). 2 investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a statním rozpočtem české republiky Použité transgenní linie: ProCYCBl:GUS (sk. 1+4) ProARR5:GUS (sk. 2+5) ProAHK4:GUS (sk. 3+6) Složení barvícího roztoku: X-Glc 0,01% (w/v) Triton X100 0,1% (v/v) Pipufr, pH6,9 0,1M K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 0.5 mM X-Glc - navazuje se ráno před cvičením Triton XI00 - 200 ul 1% tritonu na jamku, nebo - 20 ul 10% tritonu na jamku Pi pufr - 2 ml 0,lMPi na jamku komponenta A - 6,899 g NaH2P04.H20 v 100 ml H20 komponenta B - 8,889 g Na2HP04.2H20 v 100 ml H2O 7,8 ml komponenty A + 12,2 ml komponenty B + 80 ml H2O = 100 ml Pi pufru (lednice) Fe soli - 20 ul zásobního roztoku na jamku 1,646 g K3[Fe(CN)6] + 2,112 g K4[Fe(CN)6] + 50 ml H2O =50 mM zásobní roztok 3 evropská unie ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy OP Vzdělávání pra konkurenceschopnost (W investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem astAtním rozpočtem české republiky Schéma nej důležitějších morfologických a anatomických částí semenáčku Arabidopsis thaliana. pravé listy ,„ DĚLOŽNÍ LlSTKY (KOTYLEDONY) apikálnímeristém prýtu KOŘENOVÉVLÁSKY BOČNÍ (LATERÄLNÍ) KOŘENY KOŘENOVÁ špička Q cévní pletiva I pericykl q endodermis m kortex O ep1dermis n postranní kořenová u čepička ~ klidové centrum a iniciály O kolu mela 4 investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Šablona k protokolům: Analýza aktivity promotoru pomocí transkripční fůze2 a dexametazonem indukovatelný transkripční aktivační systém. Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr: 2 Do protokolu zejména uveďte: název genu analyzovaného promotoru, stručný popis principu metody, zda se podařilo identifikovat místa specifické aktivity daného promotoru (uveďte stručný výčet barvených pletiv) a co lze z tohoto výsledku uzavřít, příp. pro co jej dále použít. 5 investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem české republiky Metoda 1B Dexametazonem indukovatelny transkripční aktivační systém Použití chemicky indukovatelných systémů pro expresi transgenů je zásadním požadavkem moderního biologického výzkumu (nejen) rostlin. V našem experimentu použijeme přísně regulovaný a vysoce citlivý genový expresní systém pOpó/LhGR (Samalova et al, 2005, Plánt J 41: 919-935). který je indukovatelny dexametazonem. Tento systém obsahuje transkripční aktivátor LhGR a chimérický promotor pOp, který se skládá z lac operátorů nakloňovaných před minimálním promotorem CaMV35S. Po indukci se aktivátor LhGR naváže na pOp promotor a indukuje z něj expresi požadovaného cílového genu (viz obr. 1). Bylo vyvinuto několik chemicky indukovatelných systémů (viz přehled Moore et al., 2006. Plánt J 45: 651-683). Avšak pro ideální systém je zapotřebí řady vlastností, jako jsou velmi nízké hladiny bazálni (neindukované) exprese, vysoká indukovatelnost, specifičnost a dynamický rozsah odezvy vůči induktoru, žádoucí je také rychlá odpověď a indukce různými metodami. Ideální systém by měl fungovat u několika druhů organismů a neměl by vyvolávat žádné nežádoucí fyziologické účinky, sám o sobě nebo jeho induktor. Pro induktor je dále požadováno, aby pro transgen vykazoval vysokou specifičnost, vysokou účinnost při nízkých koncentracích a nesmí být nalezen v cílových organismech, a proto jsou složky pro tyto systémy obvykle odvozeny z nepříbuzných druhů. Obr. 1 AC IV TO Tissue specific DNA- transcription ^ TATA promoter bindings, activation d. operators box 1) Opatrně umístěte semenáčky (přibližně 10-15 kusů) z dané Petriho misky do roztoku, který buď obsahuje dexametazon nebo kontrolní rozpouštědlo (DMSO). 6 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTÄTNfM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY 2) Nechte indukci pokračovat po dobu 24 hodin na pracovním stole nebo v rostlinném inkubátoru. 3) Následující den proveďte GUS barvení a analýzu jako v metodě 1A. 4) Pro vypracování protokolu: a) Vyhodnoťte výsledky barvení. b) Popište výhody používání indukovatelných systémů nad konstitutivními promotory. Metoda 1C Infiltrace agrobakterií do listů tabáku Nicotiana benthamiana Listy tabáku Nicotina benthamiana jsou vhodným rostlinným systémem pro transientní expresi různí ch proteinů, u kterých chceme studovat jejich vzájemné interakce a lokalizaci uvnitř rostlinné buňky. K transformaci listu využijeme přenos T-DNA z Agrobacterium tumefaciens. Studované geny jsou nakloňovány do expresní kazety uvnitř T-DNA oblasti binárního plasmidu a takto připravené konstrukty pro expresi fúzních proteinů (s GFP, RFP, YFP-N, YFP-C apod.) jsou transformovány do kmenu GV3101 pMP90. Vzniklé kmeny agrobakterií potom kultivujeme a ve formě suspenze je pomocí injekční stříkačky (bez jehly) vtlačíme skrze průduchy na spodní straně listu do mezofylového prostoru. Následně dojde k přenosu mnoha kopí T-DNA do jádra buněk. Pro transkripci vnesených genů není nutné začlenění T-DNA do chromozomů. Pokud před infiltrací smícháme kmeny nesoucí různé konstrukty, dojde s velkou pravděpodobností k jejich koexpresi, protože jedna buňka je zpravidla transformována mnoha agrobakteriemi současně. Avšak k dosažení koordinované exprese dvou proteinů je výhodnější spojit je peptidem se samo-štěpícími se vlastnostmi, jako je např. 2A peptid izolovaný z FMDV (Samalova et al., 2006, Traffic 7: 1701-1723). Transientní exprese proteinů je většinou velmi silná kvůli velkému počtu transkripčně aktivních kopií T-DNA v jádře, ale během několika dnů (3-4) odezní. Každá skupina si vezme 2 zkumavky s narostlou agrobakteriální kulturou podle následujícího rozpisu: Skupina 1 Skupina 2 Skupina 3 Skupina 4 Skupina 5 Skupina 6 AHP2-YFPN AHP4-YFPN CKI1-YFPC AHP2-YFPN AHP4-YFPN CKI1-YFPC 2A 2-4 2A 8-3 2A3-5 2A 3-2 2A 9-3 2A 4-2 1. Přeneste 1,5 ml od každé kultury do eppendorfové zkumavky (nezapomeňte ji označit!). 2. Centrifugujte zkumavky rychlostí 4000 ot/min po dobu 5 minut. 3. Během centrifugace připravte 25 ml infiltračního pufru (IB): Infiltrační pufr (25 ml) lOx IB 2.5 ml destilovaná voda do 25ml 1M Acetosyringon 5 ul 4. Supernatant odsajte pipetou. 5. Přidejte 1 ml připraveného IB do buněk a znovu je resuspendujte. 6. Centrifugujte zkumavky při 13000 ot/min po dobu 45-60 s a odsajte supernatant. 7 investice do rozvoje vzdělávání tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem astätním rozpočtem české republiky 7. Zopakujte krok promývání (body 5 a 6). 8. Resuspendujte buňky v 1 ml IB. 9. Nařeďte 1/5 (200 ul buněk v 800 ul IB) v kývete pro spektrofotometr. 10. Změřte ODôoo a připravte 1 ml směsi ODôoo = 0,1 pro infiltraci tabáku. Požadované OD600 x 1000 = ul 1/5 zředění se přidá k 1 ml IB ODôoo 1/5 zředění Pro testování protein-proteinové interakce zkombinujte fúze YFP-N s fúzemi YFP-C podle následující tabulky:__ Skupiny 1, 2 and 3 Skupiny 4, 5 and 6 Kombinace Poměr Kombinace Poměr AHP2-YFPN + CKI1-YFPC 1 : 1 AHP2-YFPN + CKI1-YFPC 1 : 1 AHP4-YFPN + CKI1-YFPC 1 : 1 AHP4-YFPN + CKI1-YFPC 1 : 1 Infiltrujte suspenze pomocí injekční stříkačky o objemu 1 ml (bez jehly) přes spodní stranu listu do připravených tabákových rostlin. Vezměte rostliny do skleníku. Za 2-3 dny proveďte konfokální mikroskopii epidermis na abaxiální straně listu (viz metoda 4A). Metoda ID Určení optimální sekvence PCR primeru na základě úseku DNA z Arabidopsis thaliana pomocí programu OLIGO 7 Praktické seznámení se základními pojmy a menu na počítači Aktuální oligo. Typy primerů (forward, reverse). Volná energie. Dimer versus duplex. Interní stabilita. Vlásenky. Účinnost primeru. Terminálni stabilita. Teplota tání Tm. Vložení sekvence úseku DNA z Arabidopsis thaliana do databáze. Specifikace parametrů navrhované dvojice primerů, výběr optimální dvojice pro PCR amplifikaci studovaného úseku DNA. Finální výstup v tištěné podobě přiložte k protokolu. Syntéza PCR primeru na syntetizátoru Expedite 8909 Vložení sekvence primeru do databáze. Výtisk Volba parametrů syntézy (ON vs. OFF, rozsah syntézy), volba vhodné kolony, vlastní syntéza. Sledování účinnosti jednotlivých kroků syntézy (výtisk histogramu přiložte k protokolu). Odštěpení produktu z kolonky amoniolýzou. Tepelná deprotekce. Vakuové sušení v koncentračním systému Speedvac. Purifikace primeru: Odsolení gelovou filtrací na molekulovém sítu 8 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Odstranění nízkomolekulárních nečistot se provádí etanolovou precipitací nebo gelovou fdtrací na kolonce Sephadexu G-25. Pokud je pro některé aplikace nutné odstranit kratší nedosyntetizované řetězce (např. pro antisense hybridizace), používá se purifikace na OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge). Nej účinnějším, ale finančně nejnáročnějším způsobem čištění je HPLC. Odsolení na CENTPJ-SPIN 10 kolonce (Princeton Separations. Inc.). Vysušený vzorek primem rozpustíme v 50 pl deionizované vody. Krátce necháme stát, protřepeme příp. asi na minutu zahřejeme na 65 °C a nakonec krátce zcentrifugujeme. Hydratace kolonky CENTPJ-SPIN 10 Sklepat suchý gel do spodní části kolonky, otevřít horní zátku a nanést 650 pl deionizované vody, zavřít a asi 5 s třepat na vortexu. Poklepáním se ještě zbavit posledních bublin. Poté nejméně 30 min nechat při pokojové teplotě probíhat hydrataci Sephadexu. Otevřít horní i spodní zátku kolonky a tuto vložit do připravené mikrozkumavky bez víčka (wash-tube). Centrifugovat 2 min při 750g (odpovídá 2700 otáčkám na centrifuze Eppendorf 5415C). Po skončení centrifugace je v mikrozkumavce voda, tj. odpad. Osušíme poslední kapky na kolonce. Taje nyní připravena k vlastní aplikaci vzorku, která by měla proběhnout během několika minut po skončení hydratace. Vlastní odsolení vzorku Kolonku vložte do mikrozkumavky s víčkem, víčko označte číslem skupiny (sample-tube) a opatrně do centra gelu po kapkách naneste automatickou pipetou předem 50pl připraveného vzorku. Následuje centrifugace 2 min při 75Og (2700 otáčkách). Po skončení centrifugace přidejte k odsolenému primem v mikrozkumavce 950 pl deionizované vody, protřepte. Ve stojánku je připravena jedna mikrozkumavka označená na víčku UV (pro měření výtěžku) obsahující .......pl vody a jedna prázdná označená QC (pro chromatografickou kontrolu kvality). Do UV mikrozkumavky přidejte ...... pl odsoleného primem na měření absorbance a do QC mikrozkumavky napipetujte 50 pl odsoleného primem. Určení výtěžku. Stanovení absorbance zředěného vzorku měřením při 260 nm (spektrofotometr HELIOS). Definice jednotky OD. Výpočet výtěžku syntézy v jednotkách OD a převody do jiných jednotek. Vypočtěte, v jakém objemu vody je třeba rozpustit výtěžek, abyste dostali zásobní roztok o koncentraci 500 pM. Výtisk protokolu o syntéze s doplněným výtěžkem surového a odsoleného produktu přiložte k protokolu ze cvičení. Kontrola kvality. Chromatografie na ionexovém perfúzním sorbentu Poros HQ 10 (Applied Biosystems). Stměné seznámení s výhodami perfúzní chromatografie na přístroji BioCAD 700E (Applied Biosystems). Výběr vhodné kolony a vhodné analytické metody. Manuální nástřik 20 pl surového a odsoleného PCR primem. Porovnání chromatogramů. Výtisk obou chromatogramů ve zvoleném modu (Tile, Overlay) přiložte k protokolu. 9 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Úkoly Doplňte následující protokol - pouze jeden pro dvojici PROTOKOL Číslo skupiny: Jména: Datum: Úloha: SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Cíl: Seznámit se se současnými možnostmi při automatické syntéze oligonukleotidů, s dostupnými modifikacemi a aplikacemi. Porozumět základním zásadám pro navrhování PCR primeru. Pochopit základní princip syntézy oligonukleotidů a umět se zorientovat v jednotkách, ve kterých se vyjadřuje výtěžek. Umět vysvětlit základní rozdíl v čistotě produktu po jednotlivých typech purifikací. Návrh sekvence primeru Přiložte výstup ze software OLIGO 7, primery označte číslem skupiny, stručně zhodnoťte kvalitu nalezených primeru. Syntéza Přiložte histogram ze syntézy a protokol ze syntézy s doplněným výtěžkem vyjádřeným v jednotkách OD, pg a v jednotce molární koncentrace. Uveďte výpočet objemu nutného pro přípravu zásobního roztoku primeru o koncentraci 500 pM. Odsolení Přiložte výstup z chromatografti obsahující chromatogramy surového a odsoleného vzorku. Jednou větou zhodnoťte, zdaje pozorovatelný rozdíl a vysvětlete. Rozšiřující literatura dostupná v Centrální laboratoři Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987. Aktuální verze „OLIGO", Primer Analysis Software. User Manuál. Version 7, MBI, 2008. PCR Primer, A Laboratory Manuál. Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 2003. 10 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 2 IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, PCR, PRÁCE S DATABÁZEMI A NÁSTROJI PRO ZPRACOVÁNÍ MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝCH INFORMACÍ Úvod Jednou z metod studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si osvojíte rychlou metodu izolace DNA z rostlinného materiálu a založíte několik PCR reakcí. Amplifikovat budeme oblast inzerce cizí DNA (transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21. Také se seznámíte s genomickými databázemi a užitečnými nástroji pro genomiku. Časový harmonogram 8:30 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 3. Zahaj ení barvení 8:45 IZOLACE DNA (Markéta Žďárská), laboratoř 334 10:00 DATABÁZE (Tereza Dobisová) 12:00 OBĚD 13:00 ZALOŽENÍ PCR (Markéta Žďárská), laboratoř 334 14:00 DATABÁZE-dokončení (Tereza Dobisová) 15:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hej átko), laboratoř 334 4. Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C 15:45 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 4. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 2. DNE Přehled Úvod k praktické části • Úvod do metodologie praktika o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky o schéma experimentu o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homo- 11 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTÄTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY nebo heterozygotní stav, vlastní provedení Praktická část 1. Izolace DNA 2. Založení PCR Metoda 2A Odbarvování preparátů pro analýzu genové exprese pomocí transkripční fuze 1. Proveďte výměnu 80% etanolu a umístěte semenáčky na 4°C, kde je ponecháte do 4. dne (čtvrtek). Metoda 2B Rychlá izolace DNA pro PCR 1. Homogenizovat jeden střední list vychlazenou skleněnou tyčinkou v l,5ml zkumavce (eppendorfka) ve stojánku. 2. Přidat 400 ul extrakčního pufru, vortexovat 5 s a nechat stát při laboratorní teplotě 60 min. 3. Centrifůgovat při 14000 otáčkách 30 min, 4°C. 4. Přenést 300 ul supernatantu do nové l,5ml zkumavky a přidat 300 ul izopropanolu, 4-6 krát překlopit. Nechat stát 10 min při laboratorní teplotě. 5. Centrifůgovat 20 min, 4°C. Odstranit supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu. 6. Přidat 500 ul 70% etanolu. Centrifůgovat při 14000 otáčkách 2 min. Odstranit etanol. Nechat vysušit (SpeeďVac, cca 10-15 min). 7. Pelet rozpustit ve 100 ul sterilní ddlrhO. Genomovou DNA uchovávat na ledu nebo v lednici. Extrakční pufr Tris/HCl (200mM, pH7.5) NaCl (250mM) EDTA (25mM) SDS (0.5%) Založení PCR Do 0.2 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq polymerázu podle schématu: PCR směs: lOxpufr dNTP priml prim2 Taqpol. templ. DNA H20 celk. 50 ul 5ul 4ul lul lul 2ul 5ul 32 ul 12 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY primery AHP4 spec: primery ARR21 spec. primery ARR4 spec: primer transpozon Sim612, Sim799 - 212 bp 16kon, 16new- 340 bp ARR4N, ARR4S - 137 bp 8130, Sim 799- 250 bp 8130, 16new- 390 bp dli, ARR4N- 195 bp Navrhněte vhodnou kombinaci primerů a to tak, abyste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo heterozygotního pro danou inzerční alelu. Kombinace primerů pro jednotlivé typy templátů (viz také schéma na následující straně): primery templátová DNA AHP4: la ..................... ................... 2a ..................... ................... 3a ..................... ................... 4a ..................... ................... ARR21: lb 2b 3b 4b ARR4: lc 2c 3c 4c Na základě přiložených výsledků analýzy použitých primerů pomocí programu Oligo navrhněte vhodné podmínky PCR pro dané reakce: Cvklus:94°C .... s 30 cyklů: 94°C ... s 58°C ... s 72°C ... s 72°C ... min 4°C oo 13 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY ARR4 l^dSpmJj atg| i r arr45 AHP4 B130i ATt? ARR21 l Siicv; Metoda 2C Stručná charakteristika: Vyhledání genové, proteinové sekvence genu zájmu. Seznámení se s dohledáváním důležitých informací vztahujících se ke genu zájmu. Určení podobných genů a následná fylogenetická analýza vybraných genů. Vyhledávání promotorových oblastí a analýza vazebných míst pro transkripční faktory. Analýza a zpracování obrazových dat. Databáze: NCBI - Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace http: //www .nebi .nim .nih. gov/ EMBL-EBI - Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace https://www.ebi.ac.uk/ 14 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY TAIR - Databáze shromažďující informace pro práci s Arabidopsis thaliana. www.arabidopsis.org Genevestigator - Databáze shromažďující informace o expresi genů u rostlin a v biomedicínské praxi https://genevestigator.com/gv/index.isp Nástroje: Omic tools - Databáze bioinformatických nástrojů pro genomiku https://omictools.com/genomics2-category Plant Image Analysis - Databáze nástrojů pro zobrazovací analýzu rostlin http://plant-image-analysis.org/ Alibaba2 (Transfac) - nástroj pro vyhledávání vazebných míst v promotorové oblasti genů http://www.gene-regulation.com/login Image J - Nástroj s širokým využitím pro manuální a zautomatizovanou analýza a zpracování obrazových dat na pozadí Java https: //imagei .nih. gov/ij /index.html Úkoly (příklad): 1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank 2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli 3. Určete nejbližší homolog cheY(ií. coli) u Arabidopsis pomocí algoritmů BLAST a FASTA. 4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis. 5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu v publikované sekvenci daného chromosomu). 6. Vyberte si jeden gen z úkolu 4 a určete oblast 1000 bazí v oblasti promotoru genu. Ukončete sekvenci na ATG. Analyzujte na přítomnost vazebních míst transkripčních faktorů pomocí hledání v databázi TRANSFAC. 7. Srovnejte libovolné sekvence z Arabidopsis s homologií větší než 30% a menší než 100% pomocí algoritmu CLUSTAL Omega. 8. Vyhledejte nejméně jednu EST sekvenci Glu-6-P izomerázy (hledání homologie nebo podle klíčového slova). 15 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Izolace DNA a PCR Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr3: 3 Uveďte zejména, zda jste identifikovali inzerčního mutanta a zda se jedná o homozygota nebo o heterozygota pro danou inzerční alelu a proč. 16 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 3 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU V GELU, qPCR METODA Úvod PCR produkty rozdělíme pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a představíme si metodu kvantitativní real-time PCR (qPCR), což je moderní technika molekulární biologie umožňující rychlou, citlivou a spolehlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA. v Časový harmonogram 8:30 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA (Markéta Žďárská) 9:30 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM (Markéta Sámalová), laboratoř 334 5. Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C 10:00 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTŮ V AGARÓZOVÉM GELU (Markéta Žďárská) 11:00 qPCR (Markéta Žďárská) 12:00 OBĚD 13:00 qPCR (Markéta Žďárská) 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 3. DNE Přehled metod 1. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu 2. Detekce fragmentů v UV světle 3. qPCR Metoda 3A Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce. 1. Připravit 400 ml 1,5% agarózy v lx TBE pufru a rozvařit. Po rozpuštění agarózy přidat MidoriGreen, která bude sloužit k vizualizaci DNA. 2. Připravit formu pro gel, vsadit hřeben a nalít do formy vrstvu tekuté agarózy 5-8 mm. Nechat ztuhnout. 3. Formu s gelem vložit do elektroforézové vany, zalít pufrem a vyjmout hřeben. 4. Napipetovat délkový a hmotnostní standard a vzorky: • délkový a hmotnostní standard (NEB): 0,5 pg • vzorky: 10 pl PCR + 2 pl 6x konc. nanášecího pufru 5. Spustit elektroforézu při 80 V po dobu 60 min. 17 investice do rozvoje vzdělávání TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Pozorovat proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentovat. Base Pairs Mass(ng) 45 li 9S 27 24 2 I 18 v7 3B 29 25 48 Délkový a hmotnostní standard: 100 bp DNA ladder (0,5 ug) Metoda 3B Příprava kalibrační přímky pro qPCR a analýza genové exprese ARR5 Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) přímo během reakce (tzv. „v reálném čase") pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Její výhodou oproti konvenční PCR je možnost přesného stanovení výchozícho počtu kopií cílové templátové sekvence DNA, čili schopnost kvantifikace. Real-time PCR se provádí s pomocí přístrojů zvaných cyklery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR. Real-time PCR kvantifikace Používané matematické modely pracují s hodnotou zvanou Ct („threshold cycle"), která se rovná cyklu, kdy amplifikační křivka překročí zmíněný fluorescenční práh umístěný do počátku exponenciální fáze reakce. Absolutní kvantifikace, která se používá např. při detekci specifických mikroorganismů, přímo určuje výchozí počet kopií cílových molekul. Je založena na zjištění, že existuje lineární vztah mezi logaritmem výchozího počtu kopií templátové DNA a Ct příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, 18 INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY získáme kalibační přímku („standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku. Relativní kvantifikace, která se používá ke stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje sestrojení kalibrační přímky. Porovnává se relativní změna genové exprese {relativní expresní poměr) v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku, kterým může být např. mRNA neovlivněných buněk a pod. Ct amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti Ct tzv. housekeeping genu. Při kvantifikaci mRNA {měření genové exprese) se před vlastní PCR provádí reverzní transkripce -přepis mRNA do tzv. cDNA {RT), která je následně amplifikována pomocí PCR {RTqPCR). A g c (N„)i- 103 2 B KALIBRAČNÍ PŘÍMKA (ND)2 = o (N„>3- 1Q1 / "standard curve" 3 'n c N q = výchozí koncentrace