1 
 
Enzymová kinetika – část 4 (vícesubstrátové reakce) 
Úloha 1 
Nukeosiddifosfokinasa z lidských erythrocytů katalyzuje reakci GTP + dGDP → GDP + dGTP. Závislost 
počáteční rychlosti na koncentracích substrátů shrnuje tabulka udávající hodnoty počátečních 
rychlostí v (mol. s‐1
.kg‐1
) pro různé kombinace obou substrátů: 
   [GTP] (μmol/l) 
[dGDP] 
(μmol//l) 
22  30  50  200 
20  0,095  0,112  0,141  0,196 
25  0,102   0,120  0,155  0,223 
40   0,112  0,136  0,180  0,284 
100   0,125  0,156  0,218  0,385 
 
Určete pomocí primárního a sekundárního výnosu kinetické parametry KM
dGDP
, KM
GTP
 a vlim. Jaký je 
pravděpodobný mechanismus reakce?  Kterých nezávislých metod by bylo možno využít k jeho 
ověření?  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
 
Úloha 2 
Enzym N‐methylglutamátdehydrogenasa z bakterie Pseudomonas MA katalyzuje oxidaci N‐
methylaminokyselin podle rovnice: 
R‐NH‐CH3 + Aox + H2O → R‐NH2 + Ared + HCHO 
v níž Aox a Ared symbolizuje oxidovanou a redukovanou formu elektronového akceptoru. Při fixní 
počáteční koncentraci umělého akceptoru 2,6‐dichlorfenolindofenolu rovné 50 μmol/l byly pro 
reakce různých substrátů zjištěny následující zdánlivé kinetické parametry: 
substrát  K´
M (μmol/l)  v´
lim (nmol min‐1
 (mg proteinu)‐1
) 
 N‐methyl‐L‐glutamát  43  74 
N‐methyl‐L‐isoleucin  200  79 
N‐methyl‐L‐aspartát  1300  77 
N‐methyl‐L‐fenylalanin  2500  80 
N‐methyl‐L‐alanin  6000  78 
N‐methyl‐L‐serin  36000  76 
N‐methyl‐L‐glycin  100000  74 
 
Výsledky kinetického studia různých akceptorů A při saturující koncentraci N‐methyl‐L‐glutamátu 
udává tabulka: 
akceptor  K´
M (mmol/l)  v´
lim (nmol min‐1
 (mg proteinu)‐1
) 
hexakyanoželezitan  1,4  22 
2,6‐dichlorfenolindofenol  0,054  120 
fenazinmethosulfát  0,011  360 
 
Závislosti reciproké počáteční rychlosti na reciproké koncentraci N‐methyl‐L‐glutamátu pro různé 
fixní koncentrace 2,6‐dichlorfenolindofenolu představovaly vzájemně rovnoběžné přímky. Reakci 
inhibovaly glutarát a 2‐oxoglutarát kompetitivně s N‐methyl‐L‐glutamátem. Reakční produkty L‐
glutamát a formaldehyd neinhibovaly ani v koncentracích 0,1 mol.dm‐3
, až již byly aplikovány 
odděleně nebo ve směsi. Navrhněte mechanismus enzymové reakce, který by byl v souladu s 
experimentálními nálezy. Který krok patrně určuje výslednou rychlost pochodu?  
3 
 
Úloha 3 
Reakci katalysovanou adenylátkinasou (ATP:AMP‐fosfotransferasa) inhibuje analog přechodového 
stavu P1
,P4
‐bis(adenosin‐5')tetrafosfát (Ap4A) kompetitivně vzhledem k oběma substrátům (MgATP i 
AMP). Jaký je pravděpodobný mechanismus adenylátkinasové reakce? 
 
 
 
 
 
Úloha 4 
Enzym L‐threonindehydrogenasa katalysuje oxidaci L‐threoninu NAD+
. Přitom vzniká NADH a L‐2‐
amino‐3‐oxobutyrát, který spontánně dekarboxyluje na aminoaceton a CO2. Ze studia závislosti 
počáteční rychlosti na koncentraci substrátů vyplynulo, že reakce má sekvenční mechanismus. 
K přesnějšímu určení bylo užito strukturních analogů substrátů L‐allothreoninu a adenosin‐5'‐
difosforibosy. Ukázalo se, že obě látky inhibují studovanou reakci. V případě L‐allothreoninu je 
inhibice kompetitivní vzhledem k L‐threoninu a akompetitivní vzhledem k NAD+
. Naproti tomu 
adenosin‐5'‐difosforibosa kompetuje s NAD+
 a vzhledem k L‐threoninu má charakter inhibitoru 
nekompetitivního. Interpretujte popsané výsledky a navrhněte mechanismum L‐
threonindehydrogenasové reakce. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
Úloha 5 
Malátdehydrogenasa (dekarboxylující) katalysuje oxidační dekarboxylaci L‐malátu podle rovnice: 
L‐malát + NADP+
 → pyruvát + HCO3
‐
 + NADPH 
Průběh reakce lze sledovat fotometricky. Při kinetickém studiu bylo zjištěno, že oba primární výnosy 
měly tvar svazků protínajících se přímek. K bližšímu vyjasnění mechanismu bylo testováno, zda 
přídavky jednoho z produktů ovlivní směrnici (s) nebo úsek (u) závislosti reciproké počáteční rychlostí 
na reciproké koncentraci variabilního substrátu. Výsledky uvádí tabulka: 
Variabil. substr. / 
Produkt 
NADPH  HCO3
‐
  pyruvát 
L‐malát  s, u  s, u  u 
NADP+
  s  s, u  u 
 
Interpretujte vhodně tato zjištění a pomocí Clelandova schematu nakreslete pravděpodobný reakční 
mechanismus. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Úloha 6 
 Enzym prolylhydroxylasa katalyzuje syntézu hydroxyprolinu v kolagenu hydroxylací určitých 
prolinových zbytků peptidového substrátu. Kromě peptidu jako substráty slouží 2‐oxoglutarát, kyslík, 
železnatý ion a redukční činidlo (např. askorbát). Při reakci dochází k stechiometrické dekarboxylaci 
2‐oxoglutarátu na sukcinát a CO2, přičemž se jeden atom kyslíku z molekuly O2 inkorporuje do 
hydroxyprolinu a druhý do vznikajícího sukcinátu. Kinetika prolylhydroxylasové reakce byla 
studována pomocí měření koncentračních závislostí počáteční rychlosti. Ve všech případech byla 
postupně měřena koncentrace jednoho z ligandů při různých fixních koncentracích ligandu druhého; 
koncentrace všech ostatních komponent zůstávaly konstantní. Zpracování výsledků se dělo formou 
obvyklých reciprokých výnosů. Přitom se dospělo k následujícím poznatkům: 
a) Závislosti 1/v na 1/[2‐oxoglutarát] při různých fixních koncentracích Fe2+
 měly charakter přímek 
vzájamně se protínajících na svislé ose, kdežto průsečík přímek 1/v vs. 1/[Fe2+
] pro fixní koncentrace 
2‐oxoglutarátu ležel od svislé osy vlevo. 
b) U párů tvořených substráty Fe2+
, 2‐oxoglutarát, O2 a polypeptid (Pro‐Pro‐Gly)n měly primární grafy 
vesměs podobu svazku přímek protínajících se nalevo od svislé osy. V případě vysoké (saturující) 
koncentrace O2 se ve výnosu 1/v vs. 1/[(Pro‐Pro‐Gly)10] pro různé fixní koncentrace 2‐oxoglutarátu 
získaly rovnoběžky. 
c) Rovnoběžné přímky se v primárních grafech objevily i ve všech případech, kdy jedním ze substrátů 
byl askorbát. 
d) Poly (L‐prolin) inhiboval reakci kompetitivně vzhledem k peptidovému substrátu a kompetitivně 
vzhledem k Fe2+
 a 2‐oxoglutarátu. 
e) Reakční produkt sukcinát působil jako kompetitivní inhibitor vzhledem k 2‐oxoglutarátu a jako 
inhibitor nekompetitivní vzhledem k ostatním substrátům.  
f) Inhibice kolagenem byla nekompetitivní vzhledem ke všem substrátům. 
Diskutujte význam poznatků shrnutých v bodech a‐f a navrhněte mechanismus prolylhydroxylasové 
reakce.