1      Stanovení substrátů  Úloha 1  Enzymové stanovení nízkých koncentrací dusičnanu spočívá v jeho konverzi na dusitan účinkem  nitrátreduktasy obsažené v cytoplazmatické membráně Escherichia coli. Vzniklý dusitan se po  zastavení reakce stanoví kolorimetricky citlivou diazotačně‐kopulační reakcí. Protože KM enzymu pro  dusičnan je poměrně vysoká (0,3 mmol/l), probíhá konverze při dostatečně nízkých počátečních  koncentracích NO3 ‐  jako reakce prvního řádu. Za tohoto předpokladu vypočtěte látkové množství  dusitanu (nmol), které vznikne v reakční směsi o objemu 2 ml po 5 resp. 10 minutách inkubace, je‐li  přítomna nitrátreduktasa o aktivitě 1 nebo 2 nkat a dusičnan v počátečním látkovém množství 50  nebo 100 nmol. Diskutujte, jak závisí množství vzniklého NO2 ‐  na počátečním množství NO3 ‐ , na době  inkubace a použité aktivitě enzymu.                                        2    Úloha 2  Laktátoxidasa z bakterie Diplococcus pneumoniae oxiduje L‐laktát podle rovnice:  L‐laktát + O2 → acetát + CO2+ H2O.  Jako prostetickou skupinu enzym obsahuje FMN. Je‐li k dispozici apoenzym, lze měření rychlosti  reakce využít ke stanovení FMN. Při kalibraci byly do reakční směsi (2.1 ml) v nádobce oxygrafu  obsahující apoenzym a laktát aplikovány přídavky známého látkového množství FMN (n). Příslušné  rychlosti spotřeby O2 v dílcích na oxygrafickém záznamu za minutu udává tabulka:  n (nmol)  0,1  0,2  0,3  0,5  1,0  5,0  v (dílky/min)  1,8  3,3  4,6  6,7  10,0  16,7    Sestrojte graf závislosti 1/v na 1/n a použijte jej k odečtení počtu nmolů FMN ve vzorcích, pro něž se  v rovná a) 2,5, b) 5,7 a c) 15 dílků/min. Jaká je hodnota Michaelisovy konstanty apoenzymu pro FMN?                                         3    Úloha 3  Enzym alkoholdehydrogenasa z koňských jater (LADH) má poměrně nízkou substrátovou specifitu,  takže může kromě oxidace alkoholů NAD+  (nebo redukce aldehydů či ketonů NADH) uskutečňovat i  redukci určitých arylnitrosolátek. Tato vlastnost se stala podkladem pro vypracování citlivé kinetické  metody stanovení malých množství koenzymu NAD+  resp. NADH: K pufrovanému roztoku  obsahujícímu LADH, cyklohexanol a p‐nitroso‐N,N‐dimethylanilin (NDMA) se přidá vzorek koenzymu  a měří se rychlost poklesu absorbance (‐ΔA/Δt) NDMA (ε440= 3540 m2 /mol) ve výsledné reakční směsi  o objemu 0.815 ml umístěné v 1 cm fotometrické kyvetě. Při kalibraci metody bylo zjištěno, že  velikost ‐ΔA/Δt závisela lineárně na množství koenzymu (NAD+  nebo NADH) do hodnoty 30 pmol.  Přídavek 15 pmol odpovídal ‐ΔA/Δt = 0,1 min‐1 . Ukažte, že podstatu stanovení představuje  jednoenzymová recyklizační reakce, při níž přítomné molekuly koenzymu opakovaně přecházejí mezi  svou oxidovanou a redukovanou formou a odhadněte dobu potřebnou k uskutečnění jednoho cyklu.                                          4    Úloha 4  Malá množství koenzymu A (řádově 10‐10  molu) lze stanovit pomocí fosfotransacetylasy (PTA) a  citrátsynthasy (CS), které katalyzují reakce:  PTA:       acetylfosfát + CoA → acetyl‐CoA + fosfát  CS:          acetyl‐CoA + oxalacetát + H2O → citrát + CoA  Potřebný oxalacetát se generuje z malátu působením malátdehydrogenasy:  MDH:      malát + NAD+  → oxalacetát + NADH + H+   a průběh sumární reakce proto lze sledovat měřením absorbance při vlnové délce 340 nm.  V navrženém optimalizovaném postupu reakční směs (2,15 ml) obsahuje 250 nkat PTA, 50 nkat CS,  350 nkat MDH a saturační koncentrace acetylfosfátu, malátu a NAD+ . Za daných experimentálních  podmínek má zdánlivá Michaelisova konstanta fosfotransacetylasy pro CoA hodnotu 0,5 mmol/l a KM  citrátsynthasy pro acetyl‐CoA činí 50 μmol/l.  a) Vypočtěte, kolik molů NADH vznikne v reakční směsi za 15 minut po přídavku 1 nmolu CoA. Jakým  přírůstkem absorbance v 1 cm kyvetě se to projeví, je‐li absorbční koeficient NADH roven 622  m2 /mol?  b) Jaký poměr koncentrací acetyl‐CoA a CoA se ustaví v reakční směsi při recyklizaci?  c) Fosfotransacetylasa katalysuje i přenos fosfátové skupiny z acetyl‐CoA na arsenát (AsO4 ‐ ). Vzniklý  acetylarsenát je nestálý a spontánně hydrolysuje na acetát za regenerace AsO4 ‐ . Ukažte, jak lze této  nefyziologické aktivity využít k jednoenzymovému recyklizačnímu stanovení CoA.                                  5    Úloha 5  Enzymové stanovení pyruvátu resp. laktátu v krevním séru technikou "end‐point" lze uskutečnit  pomocí laktátdehydrogenasy. Rovnovážná konstanta katalysované reakce  pyruvát + NADH + H+  ↔ laktát + NAD+   se při teplotě 25 °C rovná 4,3∙ 1011  (mol/l). Při stanovení pyruvátu bylo k 0,6 ml pufru o pH 7,0  obsahujícího NADH (0,1 mmol/l) a laktátdehydrogenasu přidáno 0,4 ml krevního séra, v němž  koncentrace pyruvátu a laktátu činily 50 μmol/l a 1 mmol/l. Rozhodněte, zda po ustavení rovnováhy  bude alespoň 99% vneseného pyruvátu převedeno na laktát. Jakým způsobem je třeba modifikovat  reakční podmínky při enzymovém stanovení laktátu?                Úloha 6  Enzymové stanovení L‐glutamátu využívá reakce:  L‐glutamát + NAD+  + H2O ↔ 2‐oxoglutarát + NADH + NH4 +   katalyzované glutamátdehydrogenasou. Při pH 9 a odčerpávání 2‐oxoglutarátu reakcí s hydrazinem  probíhá reakce kvantitativně směrem doprava. Analýza polévkového koření vycházela z navážky 16,5  mg vzorku, doplněné vodou na objem 100 ml. Po smísení 0,2 ml tohoto roztoku s 3,2 ml reakční  směsi a 0,05 ml roztoku glutamát‐dehydrogenasy vzrostla absorbance roztoku při 340 nm o 0,217 (v  1 cm kyvetě). Vypočtěte procentové zastoupení L‐glutámátu v koření, má‐li absorbční koeficient  NADH ε340  = 6,22 cm2 /μmol a Mr glutamátu se rovná 146.                    6    Úloha 7  Při stanovení obsahu fruktosa‐1‐6‐bisfosfátu v krysích játrech byl 1 g tkáně zhomogenisován ve  zředěné kyselině chloristé na celkový objem 8,0 ml. Po neutralizaci 6,0 ml homogenátu 0,2 ml  roztoku uhličitanu draselného a odstranění vyloučeného KClO4 centrifugací byl objem 1,5 ml  supernatantu smíchán s 1,5 ml pufru obsahujícího NADH a enzymy glycerolfosfátdehydrogenasu a  triosafosfátisomerasu. Následoval přídavek malého objemu aldolasy a změření odpovídajícího  poklesu absorbance při vlnové délce 340 nm, který činil 0,123. Vypočtěte obsah fruktosa‐1‐6‐ bisfosfátu v játrech v jednotkách mol/g. Jaký význam má přítomnost triosafosfátisomerasy při  stanovení?                  Úloha 8  Z komerčního preparátu adenosin‐5'‐fosfosulfátu (APS) kontaminovaného 5'‐AMP byl připraven  roztok, jehož absorbance při 260 nm v 1 cm kyvetě činila 0,90. 0,9 ml tohoto roztoku bylo smícháno s  0,1 ml směsi obsahující nadbytek difosfátu, glukosy, NADP+ , Mg2+  a enzymy ATP‐sulfurylasu,  hexokinasu a glukosa‐6‐fosfát‐dehydrogenasu. V důsledku generování NADPH vzrostla absorbance  při 340 nm o 0,262. Určete čistotu APS v %. Absorbční koeficient APS i AMP při 260 nm je roven  15400 cm2 /mmol, NADPH při 340 nm 6220 cm2 /mmol. ATP‐sulfurylasa katalysuje reakci:  APS + PPi → ATP + SO4 ‐ .                    7    Úloha 9  Při enzymovém stanovení glukosy a fruktosy v umělém medu bylo 0,2 g vzorku rozpuštěno  v destilované vodě a doplněno na 100 ml. 20 μl tohoto roztoku bylo přidáno k 2,96 ml reakční směsi  obsahující pufr, Mg2+ , nadbytek ATP a NADP+  a enzym hexokinasu v kyvetě s optickou dráhou 1 cm.  Po konversi monosacharidů na fosfáty absorbance při vlnové délce 340 nm činila 0,038. Přídavkem 10  μl suspense glukosa‐6‐fosfátdehydrogenasy se glukosa‐6‐fosfát přítomným NADP+  kvantitativně  oxidoval na 6‐fosfoglukonát a absorbance vzrostla na 0,234. Po přidání 10 μl suspenze  fosfoglukoisomerasy se absorbance postupně zvýšila až na 0,415. S použitím absorpčního koeficientu  NADPH (ε340 = 6,22 cm2 /μmol) určete procentové zastoupení glukosy a fruktosy v umělém medu. Mr  obou cukrů činí 180,2.                    Úloha 10  K 1,0 ml analyzovaného roztoku obsahujícího směs glukosa‐6‐fosfátu a glukosa‐1‐fosfátu byl přidán 1  ml pufru s nadbytkem NADP+ , MgCl2 a enzymem glukosa‐6‐fosfátdehydrogenasou. Absorbance  vzniklého NADPH v 1 cm kyvetě činila 0,57. Po přídavku 1,0 ml roztoku fosfoglukomutasy se výsledná  absorbance ustálila na hodnotě 0,50. Vypočtěte koncentrace obou glukosafosfátů ve vzorku  (absorpční koeficient NADH je 6.22 cm2 /μmol).