HPIM6018 Anton Kočan Analytická chemie životního prostředí podzimní semestr, 2017/2018 2 1.Úvod Význam analytické chemie při kontrole znečištění životního prostředí. Zdroje a transport polutantů v prostředí. Rozptyl, degradace a akumulace polutantů v prostředí, perzistence a biokoncentrace. Specifické problémy environmentální analýzy, obecné schéma analytického postupu. Učební osnova 2. Vzorkování Kvalita vzorku, jeho velikost a počet, strategie odběru, vzorkovací plán, odběrový protokol, konzervace, transport a skladování vzorků. Techniky odběru vzorků ovzduší, aktivní a pasivní vzorkovače, atmosférická depozice, odběr srážkových, povrchových, podzemních vod, odběry tuhých vzorků, půd, odpadů, sedimentů, bioty, krmiv, potravin, biologických materiálů. 3. Zpracování vzorků Úprava vzorku před analýzou, extrakce tuhých vzorků pomocí rozpouštědel, extrakce vodných vzorků (kapalinou, plynem, na tuhou fázi), analýza rovnovážné plynné fáze. Čištění a frakcionace vzorku (kolonová kapalinová chromatografie, gelová permeační chromatografie) 4. Techniky analytického stanovení Chromatografické techniky, jejich princip, instrumentace, využití, interpretace dat. HPLC, GC, výběr kolon, fází, detektorů, GC-MS 5. Postupy stanovení významných polutantů ve složkách životního prostředí Prioritní polutanty, nové typy sledovaných polutantů, vlastnosti PCBs, PCDDs/Fs, PAHs, pesticidů, fenolů a chlorfenolů a jejich stanovení ve vzorcích ovzduší, vody, půd, sedimentů, bioty (homogenizace, extrakce, rozklad kyselinou, odstranění lipidů a interferentů, frakcionace, zakoncentrování, GC-ECD, GC-MS, HPLC). 6. Kvalita dat, základy QA/QC a GLP Kalibrace, její rozsah a linearita. Citlivost metody, mez detekce a mez stanovitelnosti. Přesnost, správnost, shodnost analytických dat, reprodukovatelnost a opakovatelnost. Výtěžnost metody, referenční a certifikované materiály, obohacené a slepé vzorky, regulační diagramy. Mezilaboratorní srovnávací testy. Základy GLP, validace a verifikace metod, dokumentace, plány, standardní operační postupy, protokoly, uchování dat, akreditace. 15 ? •Začiatkom 60. rokov minulého storočia sa švédsky výskumník, Dr. Jensen pokúšal študovať hladiny DDT v ľudskej krvi. Pri prezeraní plynovochromatografických záznamov pozoroval záhadnú skupinu chemických látok. História detekcie PCB v životnom prostredí (1) •Tieto zlúčeniny boli prítomné vo všetkých vzorkách, takže si nebol istý, či ide o prírodné alebo syntetické látky. •Po 2 rokoch skúmania zistil, že tieto látky obsahujú chlór a chemicky sa podobajú DDT. •Jensen zistil, že to nie sú pesticídy, pretože ich pozoroval aj v múzejných vzorkách pochádzajúcich z r. 1935, kedy sa ešte organochlórové pesticídy nepoužívali. História detekcie PCB v životnom prostredí (2) •Zistil, že vzorky pochádzajúce zo Švédska a okolitých morí tiež obsahovali tieto látky. Dokonca vzorky vlasov jeho ženy a 3 detí obsahovali stopové množstvá. Najvyššie hladiny však pozoroval u svojej dcéry, ktorá bola ešte dojčená. •V tomto momente Jensen nebol schopný sa pohnúť ďalej. Bez použitia referenčných štandardov neumožňovala plynová chromatografia s klasickými detektormi identifikovať „nové“ zlúčeniny. História detekcie PCB v životnom prostredí (3) •Pretože obsah DDT a neznámych zlúčenín prítomných vo vzorke tuku z orla bol veľmi vysoký, Jensen využil hmotnostnú spektrometriu na identifikáciu, hoci v tom čase to nebol veľmi citlivý detektor pre plynovú chromatografiu. Získané hmotnostné spektrá ukázali, že tieto neznáme zlúčeniny sú polychlórované bifenyly (PCB). C l y C l x História detekcie PCB v životnom prostredí (4) https://www.youtube.com/watch?v=NKiIM6WJZfQ 5:00 – 7:00 min O O C l y C l x P C D D 2 , 3 , 7 , 8 - T C D D y C l C l x O P C D F C l C l C l O 1 2 3 4 6 7 8 9 O C l Polychlórované dibenzo-p-dioxíny a dibenzofurány Zovšeobecnený vzorec PCB C l x C l y p a r a m e t a m e t a o r t h o m e t a m e t a p a r a 4 ' 6 ' 5 ' 2 3 2 ' 3 ' 4 5 6 x = 1 až 5 y = 0 až 5 o r t h o o r t h o o r t h o C l C l 4 ' 6 ' 5 ' 2 3 2 ' 3 ' 4 5 6 C l C l C l 3,3’,4,4’,5-pentachlórbifenyl (PCB-126) (kongenér s najvyššou dioxínovou toxicitou) Čo sú to perzistentné organické polutanty (POPs-y)? §Organické látky kontaminujúce životné prostredie, krmivá, potraviny a živé organizmy; Prenášajú sa vzduchom a vodnými tokmi aj do veľmi vzdialených oblastí zemegule, napr. Arktídy. §Organické látky, ktoré sa len pomaly odbúravajú v ŽP a živých organizmoch (perzistencia). §Organické látky, ktoré sú toxické pre živé organizmy, vr. človeka aj pri veľmi nízkych dávkach. §Organické látky, ktoré sa kumulujú v tkanivách a orgánoch živých organizmov, vr. človeka. PCB's concentration in the food chain Chlórakné vľavo: 4 mesiace po havárii v Sevese vpravo: o 5 rokov neskôr http://www.driko.org/blogicons/yushchenko_poison.jpg Čo je dioxínová toxicita? •Látky s dioxínovou toxicitou majú spoločnú vlastnosť, že sa viažu na vnútrobunkový aryl-hydrokarbónový receptor (AhR) a aktivujú ho. •Tento komplex sa pohybuje smerom k bunkovému jadru a viaže sa na špecifickú sekvenciu DNA, tzv. dioxínový odozvový element (DRE). •To spôsobí expresiu asociovaných génov, čo môže byť spúšťačom toxických prejavov. •Takto pôsobia najmä 2,3,7,8-chlórsubstituované dioxíny a tzv. koplanárne PCB. Ich dioxínová toxicita sa však líši medzi kongenérmi. Vyjadruje sa to k toxickej potencii 2,3,7,8-TCDD tzv. faktorom ekvivalentnej toxicity (TEF). •Celková dioxínová toxicita vyjadrená ako tzv. toxický ekvivalent (TEQ) sa vypočíta: Štokholmský dohovor o POPs (do konca r. 2017 k dohovoru pristúpilo 181 štátov a ratifikovalo 152 štátov) §Cieľom dohovoru je chrániť ľudské zdravie a životné prostredie pred perzistentnými organickými polutantmi s konečným cieľom ich úplnej eliminácie. §Obvyklým spôsobom ako hodnotiť účinnosť dohovoru je sledovať (monitorovať koncentrácie POPs uvedených v dohovore vo vybraných matriciach. A. Kočan, Slovak Medical University Pôvodných 12 POPs zahrnutých v ŠD: 1. Aldrin 7. Toxafén 2. Chlórdan 3. Dieldrin 4. Endrin 5. Heptachlór 6. Mirex 8. DDT 9. HCB 10. PCBs 11. Dioxíny 12. Furány (1R,4S,4aS,5S,8R,8aR)-1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahydro-1,4:5,8-dimethanonaphthalene 1,2,4,5,6,7,8,8-octachloro-2,3,3a,4,7,7a-hexahydro-4,7-methanoindene (1R,4S,4aS,5R,6R,7S,8S,8aR)-1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydro-6,7-epoxy-1,4:5,8- dimethanonaphthalene (1R,4S,4aS,5S,6S,7R,8R,8aR)-1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydro-6,7-epoxy-1,4:5,8- dimethanonaphthalene 1,4,5,6,7,8,8-heptachloro-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-methanoindene dodecachloropentacyclo[5.3.0.02,6.03,9.04,8] decane reaction mixture of chlorinated camphenes containing 67–69% chlorine 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane Hexachlorobenzene Polychlorinated biphenyls Polychlorinated dibenzo-p-dioxins Polychlorinated dibenzofurans A. Kočan, Slovak Medical University Ďalšie POPs doplnené do Štokholmského dohovoru: 18. Hexabrómdifenyléter a heptaBDE (komerčný oktaBDE) 15. Chlórdekon 21. Pentachlórbenzén 13. a-Hexachlórcyklohexán (HCH) 14. b-HCH 16. Hexabrómbifenyl 20. Lindan (g-HCH) 23. Perfluóroktánsulfónová kyselina (PFOA), jej soli a perfluóroktán-sulfonylfluorid (PFOS-F) A. Kočan, Slovak Medical University 26. Technický endosulfan a príbuzné izoméry 17. Hexabrómcyklododekán (HBCD) 19. Hexachlórbutadién 24. Polychlórované naftalény 22. Pentachlórfenol, jeho soli a estery 27. Tetrabrómdifenyléter a pentaBDE (komerčný pentaBDE) 25. Chlórované parafíny s krátkym reťazcom 15 Zdroje znečistenia - bodové - rozptýlené Transport polutantov v prostredí Polutanty sú často veľmi toxické a nepodliehajú rýchlej degradácii (sú perzistentné) Dochádza k ich transportu a v závislosti na rozdeľovacom koeficiente n-oktanol/voda (Kow) k: §Biokoncentrácii – k príjmu a zadržaniu látky v organizme výlučne pobytom vodného živočícha vo vode (dýchaním, príp. prestupom cez kožu) a suchozemského živočícha dýchaním vzduchu §Bioobohacovaniu – k zvyšovaniu koncentrácie látky príjmom potravy (predátory majú vyšší obsah polutantov než ich obete) §Bioakumulácii – k príjmu látky všetkými možnými spôsobmi, t.j. dýchaním, prestupom cez pokožku a konzumáciou potravy Prenos POPs-ov ovzduším 138 rokov DDT 1874 Otmar Zeidler publikuje metódu chemickej syntézy DDT. 1,1,1-trichlór-2,2- -bis(4-chlórfenyl)etán 1939 Paul Herman Müller objavuje insekticídne vlastnosti DDT. 1943-45 DDT sa využíva počas 2. svet. vojny na ochranu vojakov a civilistov proti malárii, týfusu a ďalších chorôb prenášaných hmyzom. 1948 Müller získava Nobelovu cenu za medicínu. 1962 Kniha Silent Spring od Rachel Carsonovej varuje pred negatívnym pôsobením DDT a ďalších pesticídov na ŽP. carson-silent-spring ddt-3d-balls 1967 Orol bielochvostý je vo Švédsku ohrozený vyhynutím v dôsledku otravy s DDT. Picture: Indoor DDT spraying muller 138 rokov DDT 1970. roky Zákaz používania DDT v mnohých štátoch, vrátane Československa. 1,1,1-trichlór-2,2- -bis(4-chlórfenyl)etán 2004 Štokholmský dohovor o POPs zakazuje výrobu a použitie DDT, okrem prípadov, keď je nevyhnutné chrániť zdravie ľudí pred chorobami prenášanými hmyzom (napr. malária komármi). ddt-3d-balls https://www.youtube.com/watch?v=Ipbc-6IvMQI https://www.youtube.com/watch?v=gtcXXbuR244 https://www.youtube.com/watch?v=-UiCSvQvVys Košice HPIM2124 Spaľovňa tuhého komunálneho odpadu Bratislava Bratislava po rekonštrukcii v 2004 Projekt „Štúdium vplyvu vybraných zdrojov dioxínov na kontamináciu životného prostredia a prenosu do krmív a potravín“, 2006 – 2009 Štyri vybrané oblasti s potenciálnymi zdrojmi dioxínov: * Košice: Produkcia Fe, koksu, spekanie rudy; spaľovňa TKO * Krompachy: Spracovanie sekundárnej medi * Nemecká: Spaľovanie nebezpečného odpadu * Šaľa: Chemická továreň, spaľovanie nebezpečného odpadu Okolie v. n. Starina bez významného bodového zdroja dioxínov Kovohuty Krompachy U.S. Steel Košice Petrochema Dubová Spaľovňa komunálneho odpadu v Košiciach Kovohuty Krompachy Duslo Šaľa Vodná nádrž Starina Výroba železa a ocele v Košiciach Spaľovanie záhradného a domového odpadu (zdroj PCDD/F a ďalších POPs) HPIM5511 Spaľovanie záhradného odpadu IMG_1274 Vypaľovanie trávnych porastov HPIM0492 Elektrické transformátory (v minulosti plnené PCB) HPIM0714 Silový kondenzátor plnený PCB (náplň 5,2 kg Deloru 103) Transformátor IMG_1127 C:\DATA\Copy_Agem_01072003\OBRAZKY\Digital_photo\PCB zariadenia\HPIM1201.JPG Obaľovačka asfaltu Kameňolom C:\DATA\Copy_Agem_01072003\OBRAZKY\Digital_photo\Chemko\HPIM1763.JPG Chemko Laborec D:\PROJEKTY\Michalovce 1\Spravy\mapy\Michalovce2s.JPG NRC-Diox / IPCM 30 •definice problému Kroky kontroly chemického znečištění životního prostředí •monitorování s cílem určit rozsah problému •nalezení optimálního postupu pro kontrolu znečištění •vyhodnocení stavu a prognóza vývoje kontaminace •odhad expozice a posouzení rizik pro člověka •návrh opatření •vytvoření legislativy pro účinnou kontrolu •monitorování pro zjištění účinnosti opatření 31 •široký rozsah koncentrací i vlastností analytů •monitorování na hladinách blízkých mezi detekce (stopové a ultrastopové koncentrace analytů, riziko chyb) •riziko sekundární kontaminace •nehomogenita vzorků •nutnost aplikace složitých metod pro izolaci analytů z matrice •omezená stabilita analytů a matric •cena instrumentace, čistých chemikálií, standardů Specifické problémy environmentální analýzy 32 •odběr vzorku - konzervace - transport - skladování Obecné schéma analytického postupu •příprava vzorku - extrakce - přečištění, odstranění interferentů - frakcionace - zakoncentrování - derivatizace •analytické stanovení •interpretace dat 33 §Dlouhodobé pravidelné sledování přesně určených ukazatelů, důsledně definovaných v prostoru a čase, v bodech, tvořících síť reprezentující daný region. Monitoring §Jeho cílem je sledování určitého jevu či parametru v přesně definovaných časových a prostorových podmínkách. §Skládá se z pozorování a měření, z hodnocení existujícího stavu a prognózy do budoucnosti. 34 •předchází výběr - sledovaných látek - lokalit - frekvence, počtu vzorků - metod Odběr vzorků •důraz na kvalitu - reprezentativnost -velikost -stabilitu •optimální poměr mezi cenou a hodnotou dat 35 •Kvalitní dokumentace (číslo, jméno vzorku, lokalita, datum, osoba, místní pozorování a měření, metody). Zásady odběru vzorků •Zachování požadované kvality (inertní kontejner, rychlý transport a analýza, zmražení vzorků). 36 •volné ovzduší ‒ plynné látky (napr. SOx, NOx, COx) -těkavé látky (např. freóny, benzén, CCl4) -semitěkavé látky (napr. PAH, PCB, PCDD/F) -pevné částice (PM10, PM2,5, PM1) Odběry ovzduší •ovzduší v místnostech •pracovní ovzduší •emise •imise 37 §odběr plynné fáze do vzorkovnice s pevným objemem – těkavé (kanystr, vak, plynotěsná stříkačka) Techniky odběru ovzduší §absorpce plynu v roztoku (promývačka, filtr impregnovaný absorpční kapalinou) - je třeba kalibrované zařízení na měření objemu http://www.casellameasurement.com/images/kb-air-sampling-15.png 38 Techniky odběru ovzduší §záchyt plynů na sorbentech (detekční trubičky s aktivním uhlím, silikagelem, polymery, denudery - nezachycují aerosol) 39 Techniky odběru ovzduší §vzorkování pevných částic (vysokoobjemové vzorkovače, odběrové filtry křemenné a polyuretanové, vzorkování inhalovatelné frakce < 10 µm (PM10), resp. respirabilní frakce < 2,5 µm (PM2,5) a < 1 µm (PM1) - kaskádový a cyklónový impaktor, univerzální vzorkovač (VAPS) 40 > Vysokoobjemový vzorkovač pre POPs-y vo forme tuhých častíc a v plynnej fáze HPIM6112 D:\DATA_Odd-TOP\Copy_fileserver-oddTOP_26092011\Projekty\Ukoncene\APVT_2006_Kocan-dioxiny\Odbery\Fo to_odbery_jun2007\Odbery_Sala_14Jun2007\HPIM5785.JPG D:\DATA_Odd-TOP\Copy_fileserver-oddTOP_26092011\Projekty\Ukoncene\APVT_2006_Kocan-dioxiny\Odbery\Fo to_odbery_jun2007\Odbery_Sala_14Jun2007\HPIM5790.JPG D:\DATA_Odd-TOP\Copy_fileserver-oddTOP_26092011\Projekty\Ukoncene\APVT_2006_Kocan-dioxiny\Odbery\Fo to_odbery_jun2007\Odbery_Sala_14Jun2007\HPIM5793.JPG D:\DATA_Odd-TOP\Copy_fileserver-oddTOP_26092011\Projekty\Ukoncene\APVT_2006_Kocan-dioxiny\Odbery\Fo to_odbery_jun2007\Odbery_Sala_14Jun2007\HPIM5803.JPG IMG_1166 Odber ovzdušia v obci pri U.S. Steel Hi-Vol vzorkovač GPS-1 Meranie atmosferického tlaku, teploty vzduchu a smeru a rýchlosti vetra 44 Techniky odběru ovzduší §pasivní vzorkovače (náplň PUF, XAD živice, semipermeabilní membrána, extrakční disk EMPORE) Semipermeabilná membrána (vyrobená z polyetylénu o nízkej hustote, hrúbky 75 – 90 µm obvykle tvar vrecúška o dĺžke 91 cm a šírke 2,5 cm plneného 1 ml trioleínu) http://www.recetox.muni.cz/res/image/labiny/pasive%20sampler.gif Pasívne vzorkovače s polyuretánovou penou pre POPs-y http://www.ec.gc.ca/rs-mn/6AA18234-2631-4244-BAD2-79903633A372/BukitKototabang_Indonesia%20-%2072pp i.jpg 47 §mokrá (přenášená na zem srážkami, převládá v čistých oblastech) Atmosférická depozice §mokrá (odběr pouze srážek do automatických jímačů) Odběr atmosférické depozice §suchá (sedimentací velkých částic atmosférického prachu a vlivem znečišťujících plynů, převládá ve městech) §suchá (funkce koncentrace složky v ovzduší a rychlosti depozice, sběrné nádoby) §součet mokré a suché atmosférické depozice (sběrné nádoby, nálevky) 48 §srážkové ‒ sběrné nádoby, nálevky ‒ pasivní jímače vody z ovzduší Vzorkování vod §povrchové ‒ skleněné vzorkovnice §podpovrchové ‒ skleněné vzorkovnice plněné čerpadlem Vzorky vod jsou nestabilní, vytěkávají, precipitují, fotochemicky se rozkládají, mikrobiálně degradují, snadno se kontaminují. Je třeba analyzovat co nejrychleji, konzervovat nebo sorbovat (přenos analytů na tuhý sorbent). Odber_jadrovnica_VUVH Vzorkovanie sedimentu Corer60 §nejtěžší matrice na vzorkování Odběry vzorků půdy a tuhých odpadů §heterogenní materiál, omezená migrace látek §vliv biologické aktivity, srážek, hnojení §používají se rýče, vrtáky, trubkové vzorkovače §nejprve orientační vzorkování, údaje o heterogenitě §pak odebíráme několik vzorků, které promícháme §obvykle vzorkujeme do hloubky 15 ‒ 20 cm (pokud se nezabýváme profilem) http://i.ebayimg.com/t/Strong-6-Garden-Fence-Gate-Post-Auger-Drill-Earth-Soil-Hole-Borer-Digger-/00 /s/NTAwWDUwMA==/$(KGrHqVHJCUE7zPTjmjPBPCg(QiwgQ~~60_12.JPG http://www.johnsonsoilauger.co.za/images/Pic%201.gif http://www.greenpeace.org/international/ReSizes/OriginalWatermarked/Global/international/planet-2/i mage/2006/4/chernobylradioactivecontaminatedsoil.jpg HPIM5820 HPIM5848 slovensko Šaľa Nemecká Košice Krompachy Starina Sampling sites selected Petrochema Dubová Starina water reservoir US Steel Duslo Šaľa Kovohuty Krompachy Čo je ľudský biomonitoring (HBM)? (1) §HBM je hodnotenie ľudskej expozície chemikáliám prítomným v ovzduší, vode, pôde, prachu, potravinách a/alebo ďalším environmentálnym médiám cestou merania týchto chemikálií a ich metabolitov prítomných v ľudských vzorkách ako sú krv, mlieko, moč, vlasy, sliny, stolica, tkanivá. Výsledok týchto meraní sa obvykle nazýva „zaťaženie organizmu“. §HBM je nástroj, ktorý pomáha k lepšiemu pochopeniu ľudskej expozície environmentálnym chemikáliám, tak prírodným ako aj vyrobeným človekom. §Ak sa HBM vykonáva na reprezentatívnej vzorke populácie, napr. detí alebo dospelých v určitej oblasti, HBM sa môže použiť na dokumentovanie či takáto podskupina bola exponovaná určitým chemikáliám a v akom rozsahu. A. Kočan, Slovak Medical University §HBM je vedecká technika na hodnotenie ľudskej expozície environmentálnym polutantom a ich účinkov založená na vzorkovaní a analýze jednotlivých tkanív a tekutín. Kým krv, moč, materské mlieko a vydýchnutý vzduch sa analyzujú najčastejšie, je možné sledovať aj vlasy, nechty, tuk, kosti a ďalšie tkanivá. §HBM umožňuje zistiť, či environmentálne polutanty, ktoré prenikli do ľudského organizmu zanechali markery odzrkadľujúce túto expozíciu. Takýto marker môže byť samotný polutant alebo jeho rozkladný/metabolický produkt ale môže to tiež byť nejaká zmena v organizme spôsobená interakciou polutantu alebo jeho degradačných produktov, ako sú zmeny v hladinách určitých enzýmov alebo ďalších proteínov, čo môže viesť k zmenám normálnych telesných procesov. A. Kočan, Slovak Medical University Čo je ľudský biomonitoring (HBM)? (2) HBM je využiteľný na: §posilnenie regulačných opatrení poskytnutím aktuálnych údajov o chemikáliách dostávajúcich sa do ľudskej populácie a v akej miere. §zdokonalenie hodnotenia expozície. §určenie východiskových hladín alebo referenčných rozsahov. A. Kočan, Slovak Medical University §napomáhanie právu ľudí vedieť aké chemikálie sa nachádzajú v ich telách. §určenie priorít na riešenie environmentálnych problémov. Niektoré faktory ovplyvňujúce HBM (1) §Tukovosť a zloženie materského mlieka sa dramaticky mení počas prvých týždňov po pôrode, čo tiež vedie ku kolísaniu hladín POPs. Aby sa potlačili tieto kolísania, odber vzoriek by sa mal realizovať v určitom čase, napr. 3 – 8 týždňov po pôrode a po dojčení, pretože obsah tuku je iný na začiatku dojčenia a iný na jeho konci. §Ak sa odoberie iba málo vzoriek s úzkej skupiny populácie, môže to viesť k falošným predpokladom, že výsledky sú platné pre celú populáciu, napr. tak pre mužov ako aj ženy alebo pre rôzne vekové skupiny. A. Kočan, Slovak Medical University Porovnanie hladín niektorých POPs v ženách a mužoch - Projekt PCBRISK (r. 2001) - Mediánové hladiny PCB-153, HCB a p,p’-DDE v krvnom sére v rôznych vekových skupinách (vzorky odobraté v r. 2001 v rámci projektu PCBRISK) 1665 1056 718 348 151 90 994 367 364 295 212 109 4262 2485 1967 1361 763 473 60 – 78 50 – 59 40 – 49 30 – 39 17 – 29 8 – 9 PCB-153 HCB pp'-DDE ppb, lipid adjusted N=434 N=369 N=198 N=708 N=683 N=89 Niektoré faktory ovplyvňujúce HBM (2) §Verí sa, že presnosť chemických analýz vplýva iba málo na celkový rozptyl výsledkov v nejakom monitorovacom programe, keďže sa predpokladá, že rozptyl vo vzorkách je oveľa väčší než laboratórna presnosť. §To je pravda, ak tieto vzorky analyzuje to isté akreditované laboratórium. Avšak, ak vzorky analyzujú rôzne laboratória, najmä z rôznou analytickou kvalitou, môže to potlačiť alebo dokonca znemožniť hodnotenie zmeny hladín, napr. POPs v počas rokov kedy sa monitoring vykonáva. §To isté môže platiť, ak laboratórium zmenilo metodológiu. Napr. ak vyriešilo separáciu analytu od rušiaceho kongenéru, čo spôsobilo pokles stanovených hladín tohto kongenéru. §Rovnako, ak sa vylepší (zníži) medza stanovenia (LOQ), čo spôsobí, že sa stanovia analyty, ktoré sa predtým udávali ako nekvantifikované, môže to viesť k podobným problémom v závislosti ako sa pracovalo s výsledkami < LOQ. Odber vzoriek materského mlieka a krvi §Materské mlieko sa odoberá podľa WHO protokolu. §V každom štáte sa musí odobrať najmenej 50 vzoriek. Štáty, ktoré majú viac než 50 mil. obyvateľov, by mali na každý milión na 50 miliónov odobrať najmenej 1 vzorku navyše. A. Kočan, Slovak Medical University üMatka je prvorodička üMatky, ktoré mohli byť vystavené vysokej expozícii POPs-om (žijúce v okolí spaľovní odpadu, celulózok, metalurgických závodov alebo kde sa vyrábali organochlórové chemikálie sú vylúčené z monitoringu, pretože by mohli skresľovať výsledky. §Krv od matky sa odoberá podľa AMAP protokolu. §Výberové kritériá pre matky: üVek matky pod 30 rokov üTak matka aj dieťa musia byť zdravé; tehotenstvo bez problémov. üMatka dojčí iba jedno dieťa (nie dvojčatá). üMatka býva oblasti bez prerušenia najmenej 10 rokov. [USEMAP] [USEMAP] Odber vzoriek A. Kočan, Slovak Medical University §Vzorkovanie sa vykonáva medzi 3. až 8. týždňom po pôrode. §Odoberie sa najmenej 50 ml mlieka ručným vytláčaním po dojčení alebo, kým dieťa pije z druhého prsníka, a tak využiť „let-down“ reflex. Môže sa tiež použiť vyčistená odsávačka mlieka. Matka môže odoberať mlieko doma. Dostane podrobné inštrukcie na odber, uskladnenie a transport vzorky a čistú sklenené nádobu na vzorku s uzáverom. §Vzorka by sa mala odobrať priamo do dodanej sklenenej nádoby. Ak ju matka odoberá doma, uskladní sa v mrazničke až do odoslania do laboratória. V chladničke pri 4 °C sa môže uskladňovať max. 3 dni. Ak nie je k dispozícii chladnička, pridá sa tabletka K2Cr2O7 na chemickú sterilizáciu mlieka. [USEMAP] •sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací Úprava vzorků půdy před extrakcí •přeosítí přes síto s oky 2 mm (odstranění hrubého písku); (jíl je < 2 µm) •mletí nebo rozetření v misce •subvzorkování pro zachování homogenity •uchovávání v uzavřených prachovnicích •chránit před světlem a teplem Drvenie, mletie, homogenizácia a preosievanie vzoriek Čeľusťový drvič Rotačný mlyn Sekací mlyn Nožový mixér Mažiarový mlyn Diskový mlyn Guľový mlyn Laboratorné sitá [USEMAP] Ultrazvukový homogenizátor •vzorky s vysokým obsahem vody, nehomogenní, vyžadují zvláštní úpravu Odběry sedimentů a odpadních kalů •odebírá se několik vzorků a promíchá se •podle hloubky odběru se dá usuzovat na stáří kontaminace •používají se drapákové vzorkovače a bagry pro vzorkování bez vertikální struktury •tyčové vzorkovače pro vzorkování profilu •odstranění kamenů a vody (dekantací) Úprava vzorků sedimentů před extrakcí •sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací •rozemletí a separace frakce vhodné zrnitosti (< 63 um) •subvzorkování pro zachování homogenity •uchovávání v uzavřených prachovnicích •chránit před světlem a teplem •pro odstranění síry se přidává prášková měď •Flóra - sběr, trhání nadzemních částí aspoň 3 cm nad zemí Odběr biotických vzorků Vzorky jsou nestabilní, biologicky aktivní, s časem mění své složení. Chráníme je před vyšší teplotou a světlem, skladujeme ve vzduchotěsně uzavřených kontejnerech, zpracujeme co nejdříve. •Fauna - pasti, sítě, lov, vyhrabávání •Rostlinné vzorky - rozetřeme v třecí misce nebo rozmixujeme - vysušíme (nejlépe lyofilizací) Úprava biotických vzorku před extrakcí •Živočišné vzorky - pokrájíme na malé kousky - rozmixujeme, homogenizujeme - vysušíme, např. s bezvodým Na2SO4 nebo lyofilizujeme •filtry z odběrových zařízení jsou extrahovány horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Randall, Twisselman) pomocí ultrazvukové, mikrovlnné, superkritické, zrychlené tlakové extrakce Příprava vzorků ovzduší •čištění vzorků zahrnuje odstranění interferujících látek, které se extrahují spolu s analytmi (např. působením H2SO4, alkalického hydroxidu, pomocí gelové permeační chromatografie) •frakcionace jednotlivých analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (silikagel, modifikovaný silikagel, florisil, aktivní uhlí) •zakoncentrování •Při vysoké koncentraci a čistotě je možná přímá analýza Příprava vzorků vod •Extrakce - plynem (statický head space) -plynem se zkoncentrováním na sorbent (dynamický head space, purge and trap) -nemísitelnou kapalinou (LLE) v dělící nálevce, např. hexanem -extrakcí na tuhou fázi (SPE, SPME) – klíčový je výběr extrakčního sorbentu a elučního rozpouštědla •Čištění a frakcionace -jeli potřeba tak podobně jak při zpracování půd nebo sedimentů •extrakce horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Randall, Twisselman), pomocí zrychlené tlakové, ultrazvukové, mikrovlnné, nebo superkritické extrakce Příprava vzorků půd a sedimentů •u sedimentů je nezbytné odstranění síry, např. aktivovanou práškovou mědí •čištění vzorků od interferujících látek (např. na koloně plněné silikagelem modifikovaným kyselinou sírovou, alkalickým hydroxidem, AgNO3) •frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (oxid hlinitý, florisil, aktivní uhlí) •zakoncentrování •extrakce horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Randall, Twisselman), pomocí zrychlené tlakové, ultrazvukové, mikrovlnné, superkritické extrakce, SPE Příprava biotických vzorků •čištění vzorků (např. na koloně plněné silikagelem modifikovaným kyselinou sírovou, alkalickým hydroxidem) •odstranění vysokomolekulárních látek (lipidů) pomocí gelové permeační chromatografie, dialýzou nebo kyselinou sírovou •zakoncentrování •frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou chromatografií (oxid hlinitý, florisil, aktivní uhlí) Extrakcia toluénom (PLE/ASE, Soxhlet) TOLUÉN reverzná elúcia PCDD, PCDF non-orto PCB 13C-dávkov. štandardy Kolóna s oxidom hlinitým Kolóna s aktívnym uhlím HRGC / HRMS mono-orto PCB Sediment / pôda Úprava vzorky (drvenie, preosiatie, sušenie) 13C-extrakčné štandardy Schéma analýzy PCDD, PCDF, dl- a ndl-PCB v sedimente/pôde DCM:HEX 2:98 DCM:HEX 1:1 ndl-PCB (multi-orto) Prídavok aktívnej Cu Silikagél Silikagél + H2SO4 Silikagél + KOH Silikagél Silikagél M u l t i v r s t v o v á k o l ó n a Silikagél + AgNO3 Kolóna s Al2O3 (dočistenie ndl-PCB frakcie) HEXÁN PowerPrep Niektoré extrakčné metódy Extrakcia typu kvapalina – kvapalina (LLE) mlieka HPIM6833.JPG §Vrchná fáza organického rozpúšťadla (hexán-dietyléter) obsahuje mliečny tuk a v ňom rozpustené látky, napr. PCB, dioxíny, pesticídy Extrakčný prístroj podľa Soxhleta Twisselmana (opakovaná extrakcia horúcim rozpúšťadlom) Extrakčný prístroj na zrýchlenú extrakciu podľa Soxhleta (extrakcia prebieha niekoľkonásobne rýchlejšie než klasická extrakcia podľa Soxhleta, pretože extrakčné patróny sú vyhrievané) IMG_4658.JPG IMG_4955 HPIM6589 Extraktor na zrýchlenú kvapalinovú extrakciu od fy Dionex (ASE 300) Schéma zrýchlenej tlakovej extrakcie (Dionex ASE 300) Naplnenie patróny Zaplnenie patróny rozpúšťadlom (0,5 – 1 min) Zahriatie a tlakovanie (5) Statická extrakcia (5) Výplach patróny novým rozpúšťadlom (0,5) Prefúknutie s N2 (1 – 2) Koniec extrakcie (celkový čas 17 – 22 min) 2-3x Extrakčná cela: •100 ml •34 ml •10 ml HPIM6589 filtračný papier filtračný papier sediment + Cu Hydromatrix® Hydromatrix® : •prečistená a preosiata rozsievková zemina (kremelina) •má vynikajúce sušiace vlastnosti 1 diel Hydromatrixu = 6 dielov bezv. Na2SO4 Úprava vzorky vysušeného sedimentu: •preosiata cez 63 µm, príp. 0,2 mm sito •dosušená premiešaním s Hydromatrixom •premiešaná s medeným práškom na odstránenie síry HPIM6604 Príklad zrýchlenej extrakcie zo sedimentu Písek Cu prášok https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRNVGGUSnQSEDsp5rIygk3yr_Ox9BSkDm2hY2_VpE972LE BF84zfQ https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcScRg7xC3bgWYELIKMdtgEwYyZ_XrZG-arcC1iljB-Vbv8 0pV0Z4Q IMG_5655.JPG Extraktor na tlakovú kvapalinovú extrakciu (PLE) od fy FMS Extraktor na tlakovú rozpúšťadlovú extrakciu (PSE) od fy Büchi (SpeedExtractor E-914) IMG_8940.JPG Cleanup2 Izolácia PCB a ďalších POPs z krvného séra na tuhej fáze (C18-SPE) H2SO4/silikagélová kolóna používaná na počiatočné čistenie extraktov IMG_5294 HPIM6636 IMG_4650.JPG IMG_4666.JPG Kolóna plnená aktívnym uhlím na frakcionáciu indikátorových PCB (1. fr.), dioxínom podobných PCB (2. fr.) a PCDD/F (3. frakcia) Silanizovaná sklená vata 0.5 g Celite 545 1 g AX-21 aktívne uhlie na Celite 545 (1:19) 0.5 g Celite 545 Silanizovaná sklená vata Gélová permeačná chromatografia (GLC) (patrí do skupiny size exclusion chromatography) P1220034.JPG http://www.malvern.com/labeng/technology/gel_permeation_chromatography_theory/retention_volume_GPC_ SEC.jpg http://salescience.co.kr/zeroboard/GPC/images/GPC_fig1 kolóna plnená Bio-Beads S-X3 napučanom v zmesi EtAc-hexán (1:1 v/v) čerpadlo zber frakcií zásobník na vzorky dávkovač Polystyrénový polymér zosieťovaný prídavkom divinylbenzénu – množstvo DVB určuje veľkosť pórov Automatizovaný systém spracovania vzoriek Power-PrepTM (konfigurácia pre 2 vzorky) IMG_5303 H2SO4/silikagél KOH/silikagél AgNO3/silikagél Al2O3 zásaditý Aktívne uhlie Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep) Krok nanesenia extraktu vzorky na viacvrstvovú silikagélovú kolónu IMG_5523 Krok čistenia na viacvrstvovej silikagélovej kolóne a adsorpcii analytov na kolóne s Al2O3 Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep) IMG_5527 Krok elúcie analytov z kolóny s Al2O3 a adsorpcii planárnych zlúčenín na kolóne s aktívnym uhlím; Zachytávanie frakcie obsahujúcej PCB (okrem planárnych non-orto kongenérov) Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep) IMG_5527 Krok elúcie planárnych non-orto PCB a PCDD/PCDF z kolóny s aktívnym uhlím Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep) IMG_5527 IMG_4662.JPG Koncentrátor TurboVap LV na odfúkanie rozpúšťadla z extraktov Farbivo v MeOH Rezíduá extraktu z červenej papriky na stenách odparovacej skúmavky po odparení rozpúšťadla IMG_4574.JPG Koncentrátor na odfúkavanie rozpúšťadiel z eluátov vzoriek IMG_4564.JPG https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR2tsLIyRGpagkvQBxwpsbGJfbcYPHAZGDQNN1C7YUiILR _Hezd Derivatizácia analytov Je to proces, ktorým sa pôvodná zlúčenina mení na zlúčeninu s vlastnosťami vhodnejšími na stanovenie. V prípade, že sa na analýzu používa plynová chromatografia tak dôvodom na derivatizáciu je nízka prchavosť analytu, tepelná nestabilita, sorpcia v injektore, nekvalitná separácia v kolóne, nízka odozva v detektore. Ak sa používa GC, základné typy derivatizácie sú: •Silanizácia – reakcia aktívneho vodíka so zlúčeninami s tri- alebo dimetylsilyl skupinou, napr. trimetylchlórsilánom •Acylácia – zavedenie acylovej skupiny •Alkylácia – nahradenie kyslého vodíka s alkylovou (metylovou) skupinou, napr. reakciou s diazometánom (CH2=N+=N-) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/da/Trimethylsilyl_group.PNG http://www.chemistry-drills.com/icons/20.jpg pentafluórbenzylbromidom reakciou, napr. Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov vo vzorkách zo životného prostredia Rozdelenie podľa princípu merania: •Bioanalytické metódy (CALUX, ELISA, RIA) •Fyzikálnochemické metódy (GC/MS, GC/ECD, TLC) Rozdelenie podľa kvality merania: •Skríningové metódy (všetky bioanalytické metódy, TLC, GC/ECD, GC/LRMS •Konfirmačné metódy (GC/HRMS, GC/MS-MS) −ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), v ktorom sa do extraktu vzorky pridá špecifická protilátka s už naviazaným značeným antigénom imobilizovaná napr. na stenách skúmavky. Analyt, t.j. antigén kompetuje so značeným antigénom. Po krátkej inkubácii sa vzorka s neviazaným analytom vypláchne. Pridá sa chromogénny substrát, ktorý vytvára farebný produkt s enzýmom na značenom antigéne. Intenzita zafarbenia sa meria fotometricky. Platí, čím nižšia intenzita zafarbenia tým vyššia koncentrácia analytu. Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov vo vzorkách zo životného prostredia (1) §Skríningové bioanalytické metódy •Imunotesty – sú založené na vysoko špecifickom viazaní určitých organických zlúčenín (antigénov) na protilátky (antibodies) – princíp „zámok-kľúč“. Príklady imunotestov: −Rádioimmunoassay (RIA), v ktorom do extraktu vzorky pridá špecifická protilátka s naviazaným rádioaktívnym ligandom. Analyt kompetuje s týmto ligandom. Po separácii, napr. na filtri sa zmeria rádioaktivita filtra. Platí, čím nižšia aktivita, tým vyššia koncentrácia analytu, ktorý vytlačil ligand z protilátky. Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov vo vzorkách zo životného prostredia (2) §Skríningové bioanalytické metódy −Ah-receptor immunoassay, v ktorom sa do extraktu vzorky na špeciálnej platničke pridá reakčná zmes obsahujúca Ah-receptor a nechá sa inkubovať. Zlúčeniny s dioxínovou aktivitou sa naviažu na AhR a komplex za zachytí na platničke. Zvyšok vzorky sa vypláchne. Pridá sa protilátka, ktorá zafarbí iba AhR s analytom. Platí, čím vyššia intenzita zafarbenia, tým vyššia koncentrácia analytu. •Imunotesty https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSmzkh1ndISGmb89X6RJ1iF8XJ_XuMHvd_5Ud_p-5GvAXB SGJPbDA 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxín škodlivina s doteraz najvyššie známou afinitou k arylhydrokarbónovému receptoru Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov vo vzorkách zo životného prostredia (2) §Skríningové bioanalytické metódy −DR CALUX (Chemical-Activated LUciferase gene eXpression) Zlúčeniny s dioxínovou toxicitou prenikajú bunečnou membránou a viažu sa na Ah-receptor, ktorý je spojený s proteínom hsp90. Tento komplex sa uvoľní a migruje do bunečného jadra. Viaže sa na AhR jadrový translokátorový proteín (Arnt), ktorý interaguje so špecifickými sekvenciami DNA, tzv. dioxínovými odozvovými elementami (DRE). Tým sa indukuje transkripcia určitých génov. Následne sa produkuje niekoľko proteínov, vč. cytochromu P4501A1. Výsledkom sú viaceré toxické účinky. Tento princíp sa využíva v komerčne dostupných biotestoch CALUX. Využívajú sa potkanie, myšie alebo ľudské rakovinové pečeňové bunky, ktoré sú geneticky modifikované luciferázovým reportérovým génom získaným zo svetlušky. Tieto bunky po expozícii dioxínovým zlúčeninám emitujú svetlo, ktorého intenzita závisí od koncentrácie týchto látok. Meria sa spektrofotometricky (luminometrom). •Biotesty – sú založené na interakcii analytu so živou bunkou Príklad biotestu pre zlúčeniny s dioxínovou toxicitou: Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov vo vzorkách zo životného prostredia (3) •Fyzikálno-chemické analytické metódy založené na chromatografickej separácii zmesí zlúčenín v extrakte a následnej detekcii a kvantifikácii niektorým z detektorov, najčastejšie hmotnostnospektrometrickým detektorom. •Na separáciu pri analýze organických látok v environmentálnych vzorkách sa v súčasnosti používajú takmer výhradne separačné metódy založené na vysokoúčinnej plynovej chromatografii (HRGC) alebo vysokoúčinnej (vysokotlakej) kvapalinovej chromatografii (HPLC, UHPLC) •Tenkovrstvová a papierová chromatografia – používajú sa na skríningové stanovenie Princíp chromatografie (1) •Chromatografia je fyzikálna metóda separácie, pri ktorej sa využíva rozdielna afinita zložiek v zmesi k dvom navzájom nemiešateľným fázam. •Ak sa zlúčeniny separujú podľa veľkosti svojich molekúl – gélová chromatografia; ak sa na ionexe vymieňajú katióny alebo anióny – ionexová chromatografia •Aj je táto afinita daná rozdielnym adsorpčným (adsorpčná chromatografia) alebo rozdeľovacím koeficientom (rozdeľovacia chromatografia) separovaných látok medzi dvoma nemiešateľnými fázami, tj. stacionárnou fázou (adsorbent alebo viskózna kvapalina) a mobilnou fázou (plyn alebo kvapalina). 105 Princíp chromatografie (2) •Separačný proces v súčasných HRGC a UPLC/HPLC sa skladá s veľkého množstva (až niekoľko stotisíc) jednotlivých separačných rovnováh, čo znamená, že sú tieto typy chromatografie najúčinnejšie, a preto najpoužívanejšie v separácii zložitých zmesí environmentálnych polutantov. HexaCDF separované: modernou kapilárnou kolónou (SP-2331, 60 m, 0.25 mm vnútorný Ø) zastaralou náplňovou kolónou (3% Dexsil 300 on Supelcoport 100/120, 2.4 m, 2 mm vnútorný Ø Chromatogram •Je grafickým výstupom z chromatografu, konkrétne z jeho detektora. •V prípade najčastejšie používanej plynovej chromatografie a vysokotlakej kvapalinovej chromatografie je to chromatogram skladajúci sa z elučných vĺn (píkov); Na osi x je retenčný čas a na osi y intenzita nameraná niektorým z detektorov (FID, ECD, MS, DAD, a i.). Chromatogram (2) •Retenčný čas je kvalitatívnym údajom slúžiacim na výpočet retenčných indexov (napr. Kovatsovho RI) charakterizujúcim separovanú zlúčeninu. Spolu so šírkou píku sa používajú na výpočet rozlíšenia 2 píkov a počtu pater pre danú kolónu. Ak sa použije hmotnostná spektrometria ďalším údajom pre kvalitatívnu analýzu je hmotnostné spektrum alebo pomer intenzít monitorovaných vybraných iónov zo spektra. •Kvantitatívnym údajom je plocha píku. Kvantifikácia sa vykonáva porovnaním plochy s údajmi v kalibračnej krivke alebo interným štandardom pridaným do vzorky pred jej spracovaním. tR t'R = tR - tM tM Wh Wh/2 tM mŕtvy retenčný čas tR retenčný čas t'R redukovaný retenčný čas A B C D E Vzorka: Zmes organických látok rozpustených v rozpúšťadle (vhodná pre látky, ktoré je možné odpariť bez toho, aby sa rozložili) Plynový chromatogram 0 5 10 15 20 Čas (minúty) A B C D E Plynový chromatograf Plynová chromatografia A1242.bmp GC separácia PCB produktu Aroclor 1242 Datasystém Termostat Separačná kolóna Dávkovací priestor Detektor Nosný plyn HPIM3649 Plynový chromatograf Nosný plyn: He, N2 alebo H2; Prietok: okolo 1 ml/min Dávkovací priestor: S delením toku, bez delenia toku, s programovateľnou teplotou, dávkovanie veľkých objemov, a ďalšie. Separačná kolóna: V súčasnosti takmer výhradne kapilárna kolóna, tj. tenká kapilára s kremenného skla s vnút. priemerom okolo 0,25 mm a dĺžky 30 až 60 m. GC detektor: Hmotnostnospektrometrický detektor (MSD), detektor elektrónového záchytu (ECD), plameňovo-ionizačný detektor (FID), FID s alkalickým kovom (NP-FID), tepelno-vodivostný detektor (TCD). MS je najselektívnejší ale FID a TCD patria medzi najmenej selektívne, tzv. univerzálne detektory. ECD je selektívnejší ako FID ale menej selektívny ako MS. C:\DATA\My texts\My Pictures\2005-07 (VII)-09\Redaced\HPIM3691.jpg §Vhodná pre separáciu organických látok, napr. biologicky aktívnych látok, liečiv, vitamínov, drog, bielkovín, metabolických produktov, stereoizomérov, zmesí polárnych látok. Nenahraditeľná na stanovenie tepelne labilných látok (nie je možné použiť GC). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (ultravysokoúčinná, vysokotlaková) §Mobilnou fázou je kvapalina, často zmes kvapalín (napr. voda, metanol, acetonitril, rôzne pufre). Využíva sa gradientová elúcia, t.j. plynulá zmena koncentrácie zložiek v mobilnej fáze. §Stacionárnou fázou je sorbent, napr. chemicky modifikovaný silikagél, oxid hlinitý, rôzne polyméry, aktívne uhlie; Veľkosť častíc už od 1,7 µm. §Detektory: Hmotnostnospektrometrické (LRMS,MS-MS, TOF), optické (absorpčný UV/visible, fotometrický, fluorescenčný, refraktometrický, odparovací detektor rozptylu svetla), elektrochemické (coulometrický, ampérometrický), vodivostný; MS detektor je najselektívnejší. Kvapalinový chromatograf Vysokotlakové čerpadlo Analytická kolóna Riadiaci a vyhodnocovací počítač Detektor Zásobník elučného činidla Filter Filter Predkolónový filter Viaccestný ventil na nástrek vzorky Predkolóna Zásobník odpadu Proti- tlakový regulátor −Analytická kolóna má vnútorný priemer najčastejšie 2,1, 3,0 a 4,6 mm, dĺžku 20 až 250 mm, je umiestnená v termostate, tlak: až 120 MPa −Semipreparatívna a preparatívna kolóna má vnútorný priemer 20 až 50 mm, dĺžku 20 až 250 mm, veľkosť častíc 5 až 10 µm. −Predkolóna chráni analytickú kolónu tým, že zachytáva častice, zlúčeniny viažuce sa nevratne na stacionárnu fázu analytickej kolóny, nasycuje mobilnú fázu sorbentom. Je spravidla plnené rovnakým sorbentom ako analytická kolóna. Dĺžka do 30 mm. http://1.1.1.1/bmi/www.waters.com/webassets/cms/category/media/other_images/primer_l_chromatography .jpg http://1.1.1.4/bmi/cobertassociates.com/images/hplcColumn3.png IMG_3296.JPG Kvapalinový chromatograf v spojení s hmotnostným spektrometrom Hmotnostná spektrometria (MS) §Používa sa na identifikáciu tak jednoduchších ako aj zložitých organických zlúčenín počínajúc prchavými zlúčeninami a končiac peptidmi pomocou nameraných hmotnostných spektier. §V posledných 30 rokoch sa masovo využíva ako selektívny detektor v plynovej a kvapalinovej chromatografii v oblasti environmentálnej analýzy, analýzy liečiv, drog, dopingu, metabolických a degradačných produktov, toxických a esenciálnych prvkov. §MS je deštruktívny detektor (ako FID), t.zn., zlúčeniny sa počas detekcie chemicky menia. Medzi nedeštruktívne detektory patria, napr. TCD, UV/VIS detektor, refraktometrický detektor. V praxi to znamená, že za nedeštruktívnym detektorom môže byť umiestnený iný detektor. §MS sa najčastejšie používa v režime nízkeho rozlíšenia (LRMS) využívajúc separáciu iónov napr. kvadrupólovým analyzátorom. Vysokej selektivity a citlivosti sa dosahuje ak sa odseparovaný vybratý ión z 1. stupňa spektrometra znova ionizuje a separuje – tento typ MS sa nazýva tandemová MS (MS-MS). §MS patrí medzi vysokocitlivé a selektívne detektory. §Medzi najselektívnejší a najcitlivejší MS detektor patrí vysokorozlišovací hmotnostný spektrometer využívajúci separáciu iónov magnetom a fokusáciu elektrickým poľom. Kvantifikovateľnú odozvu poskytuje už niekoľko fg (10-15 g) v GC píku. §Najmä pri identifikačných analýzach nachádza uplatnenie preletový MS (Time-Of-Flight MS) a elektrostatické MS (Orbitrap, cyklotrónový rezonančný MS). Hmotnostné spektrum m/z (pomer hmotnosti a náboja) Relatívna intenzita (%) 100 Fragmentový ión Základný pík Molekulový ión M+. [M-X]+. [M-Y]+. 194 67 109 55 82 42 165 136 94 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Hmotnosť/náboj (Da) Hmotnostné spektrum Hmotnostný spektrometer Hmotnostná spektrometria Neznáma látka Kofeín RECETOX_DFSa.JPG http://1.1.1.1/bmi/chem242.wikispaces.com/file/view/caffeine.png/62427678/caffeine.png M+. [M+2]+. [M+4]+. [M+6]+. 320 [M-Cl]+. [M-COCl]+. Horný segment hmotnostného spektra 2378-TCDD Zoskupenie iónov vytvorených 4 chlórsubstituentami 4×35Cl 3×35Cl 1×37Cl 2×35Cl 2×37Cl 1×35Cl 3×37Cl 4×37Cl https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSmzkh1ndISGmb89X6RJ1iF8XJ_XuMHvd_5Ud_p-5GvAXB SGJPbDA Identifikácia zlúčenín v GC/MS zázname pôdneho extraktu pomocou hmotnostných spektier a-HCH HCB IZOMERY Porovnanie hmotnostných spektier izomérov hexachlórbifenylov Izoméry: Chemické zlúčeniny, ktoré majú rovnaký sumárny vzorec, ale rozdielny štruktúrny vzorec. Kongenéry: Chemické zlúčeniny, patria do skupiny látok so spoločnými znakmi. Napr. 2,3,7,8-TCDD je jedným z 210 kongenérov PCDD/PCDF. TCDD_sediment Analýza 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxínu vo vzorke sedimentu pomocou GC/HRMS v režime vybraných iónov (SIM, MID) metódou izotopovej zrieďovacej analýzy Princíp hmotnostnej spektrometrie •Na vzdialenej skale je váza, na ktorej je niečo namaľované, ale nedá za rozoznať, čo to je – paralela s neznámou zlúčeninou vo vzorke •Pozorovateľ má iba pušku; Úlomky z vázy zasiahnutej projektilom sa rozsypú po okolí – paralela s bombardovaním molekuly elektrónmi v iónovom zdroji hmotnostného spektrometra •Úlomky sa poskladajú, a tak sa zistí, čo bolo na váze namaľované – paralela s hmotnostným spektrom a jeho vyhodnotením •Elektrónová ionizácia (EI) •Chemická ionizácia (CI) •Elektrosprej (ESI) •Bombardovanie rýchlymi atómmi (FAB) •Laserová ionizácia (LIMS) •Rezonančná ionizácia (RIMS) •Termická ionizácia (TIMS) •Ionizácia plazmovou desorpciou (PD) •Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Iónový zdroj Hmotnostný analyzátor Detektor iónov Vákuové čerpadlá (rotačné vývevy + turbopumpy) Vstup Vstup vzorky Datasystém Výstup dát Hmotnostný spektrometer •Všetky MS systémy sa skladajú z týchto častí: Ionizácia, separácia iónov a ich detekcia prebiehajú vo vákuu (~ 10-4 – 10-6 Pa) •Elektrónový násobič •Fotonásobič •Magnetický sektor •Kvadrupól •Iónová pasca •Preletový •Ión-cyklotrónová rezonancia •GC •LC •Priamy vstup Schéma elektrónovej ionizácie Iónový zdroj Molekuly, napr. vody elektróny Magnetický sektorový hmotnostný analyzátor C:\DATA\My texts\My Text\Konv2\HPIM3647.jpg Detektor iónov Elektromagnety Iónový zdroj Dráha nedetegovaných iónov s nižšou hmotnosťou (m/z) Dráha detegovaných iónov Dráha nedetegovaných iónov s vyššou hmotnosťou (m/z) Detektor iónov Iónový zdroj + _ _ Prívody jednosmerného a rádiofrekvenčného napätia Rezonujúci ión Nerezonujúci ión + Kvadrupólový hmotnostný analyzátor Hmotnostný spektrometer s iónovou pascou IMG_0399 Photo of TOF-MS for gases Preletový hmotnostný spektrometer (TOFMS) http://1.1.1.1/bmi/img.directindustry.com/images_di/photo-g/time-of-flight-mass-spectrometer-tof-ms -32598-2451991.jpg Urýchľovanie iónov v pulzoch Vstup vzorky Detektor iónov Vákuum Meranie času Ionizačná komôrka Preletová trubica Ťažšie ióny Ľahšie ióny Lineárny TOFMS Iónový zdroj s urýchľovaním iónov v pulzoch Detektor iónov Reflektrón Reflektrónový TOFMS D:\OBRAZKY\Skenovane obrazky\Pictures\HPIM2031.JPG Hmotnostný spektrograf podľa Astona z r. 1919/20 D:\OBRAZKY\Skenovane obrazky\Pictures\HPIM2032.JPG D:\Photos_Kocan\Pracovne\Oddelenie-pristroje\MAT95XL\HPIM3645.jpg Vysokorozlišovací hmotnostný spektrometer z r. 2000 IMG_2736.JPG IMG_2747.JPG RECETOX_DFSa.JPG IMG_2741.JPG Sektorový vysokorozlišovací hmotnostný spektrometer (HRMS) s dvomi plynovými chromatografmi Tandemový hmotnostný spektrometer (MS-MS) s vysokoúčinným kvapalinovým chromatografom Tandemové hmotnostné spektrometre (MS-MS) s plynovými chromatografmi Hmotnostný spektrometer s indukčne viazanou plazmou (ICP-MS) na analýzu kovov a polokovov Základy správnej laboratórnej praxe (GLP, QA/QC) •Výsledky analýz môžu mať značné spoločenské a ekonomické dôsledky, môžu ovplyvňovať závažné rozhodnutia. •Môžu vznikať pochybnosti o vierohodnosti údajov. •Laboratórium musí vedieť spätne preukázať, ako bola vzorka analyzovaná, prípadne odobratá. •Laboratórium musí v pravidelných intervaloch overovať kvalitu vykonávaných analýz, a to analýzou slepých vzoriek (blank samples), certifikovaných referenčných materiálov (CRM) alebo aspoň referenčných materiálov (RM), zúčastňovaním sa v testoch spôsobilosti (proficiency tests, interlaboratory studies, round robin tests). •Analytické laboratórium by malo byť akreditované ako skúšobné laboratórium podľa normy ČSN ISO/IEC 17025. To ho bude zaväzovať na vedenie potrebnej laboratórnej dokumentácie, validovanie analytických metód, overovanie kvality svojich výsledkov, správnu manipuláciu zo vzorkami a odpadom z analýz, zvyšovanie kvalifikácie personálu, atď. Akreditované laboratórium sa musí v pravidelných intervaloch podrobiť interným a externým auditom. Výsledky testu způsobilosti pro stanovení PCDD/F, dioxínům podobných PCB a indikátorových PCB ve vepřové klobáse a sádle (organizované Referenční laboratoří EU pro dioxiny a PCB v potravinách a krmivech v r. 2012) −0.2 (z-skóre pro RECETOX) RECETOX value: 1.40 pg/g fat •Maso vysušeno s bezvodým Na2SO4 •Soxhletova extrakce n-hexanem •K tuku přidané 13C12-lznačené kongenery •Čištění s H2SO4/na silikagelu, KOH na silikagelu, aktivním uhlí •GC separace na 60m koloně DB5-MS •Kvantifikace pomocí HRMS (rozlišení 10000) Pojmy popisující nejistotný přístup k měření v analytické chemii Preciznost: Těsnost shody mezi naměřenými koncentracemi získanými opakovanými měřeními na stejném vzorku (precission) Pravdivost: Těsnost shody mezi aritmetickým průměrem nekonečného počtu opakovaně naměřených koncentrací a referenční hodnotou (trueness) Přesnost: Těsnost shody mezi naměřenou koncentrací a skutečnou koncentrací (accuracy) Zvyšovanie precíznosti Systematická chyba merania Príklad realizácie systému kvality v analytickom laboratóriu využívajúcom plynovú chromatografiu •Údržba meracích zariadení sa vykonáva podľa plánu údržby. •Kalibračné krivky sa tvoria najmenej z 5 koncentračných úrovní v lineárnej oblasti detektora. •Stabilita kalibračnej krivky sa kontroluje denne kalibračným štandardom so strednou koncentráciou. •V sade nie viac než 10 vzoriek sa analyzuje aj vzorka na slepý pokus (SP) a vzorka referenčného materiálu. •Koncentrácia analytu v blanku nesmie prekročiť hodnotu predpísanú v štandardnom operačnom postupe (SOP) alebo v norme (oficiálnej metóde) – spravidla je to < 1/10. •Výsledky meraní najčastejšie CRM alebo RM sa vnášajú do (Shewhartovho) regulačného diagramu; Musia spĺňať požiadavky dané metódou, t.j. precíznosť (napr. relatívna smerodajná odchýlka < 15%) a pravdivosť (napr. v intervale ± 20% od referenčnej hodnoty) •Dokumentácia týkajúca sa analýzy sa archivuje (napr. 5 rokov) – protokoly z odberov a spracovania vzoriek, GC/MS záznamy kalibračných roztokov, blankov, RM a vzoriek, parametre GC/MS meraní. Shewhartove regulačné diagramy a kvalita analytických meraní •Snahou je udržať merací proces v štatisticky zvládnutom stave, aby sa zabezpečila požadovaná zhoda výsledkov •Konkrétne pri stanovení PCDD/PCDF a dioxínom podobných PCB v potravinách a krmivách sa za účelom úradnej kontroly podľa nariadení (ES) č. 1883/2006 a č. 152/2009 požaduje, aby v koncentračnej oblasti maximálnych limitov bola relatívna chyba merania, ktorá vyjadruje pravdivosť merania ≤ 20 % a relatívna smerodajná odchýlka (RSD), ktorá vyjadruje precíznosť merania < 15 %. •Regulačný diagram obsahuje centrálnu priamku (CL) rovnobežnú s osou x; Hodnota y predstavuje referenčnú hodnotu, napr. priemer meraní, koncentráciu v RM, atď. •Hranice reg. diagramu môžu predstavovať priamky vzdialené od CL o hodnotu 3s na každú stranu (je pravdepodobné, že 99,7 % hodnôt sa bude nachádzať medzi dolnou [LCL] a hornou [URL] reg. medzou ); Je vhodné zakresliť aj tzv. výstražné medze pri hodnote ± 2s (~ 68 % hodnôt v intervale) •Pre analytické stanovenia má vedenie reg. diagramov prínos v tom, že manažér kvality dostáva rýchlu informáciu o stave kvality meraní Regulačný diagram precíznosti stanovenia TEQPCDD/PCDF v referenčnom materiáli (slnečnicový olej s prídavkom 17-ich štandardov) za obdobie 2001–2009 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Referenčná hodnota + 20 % pg/g tuku Referenčná hodnota – 20 % Refer. hodnota Rozšírená neistota Ue,k=2 = 18.9 % RSD = 9,5 % (podmienka: < 15 %) Definice některých pojmů v analytické chemii Analyt (Analyte) Konkrétní sloučenina, prvek, ion, funkční skupina, nebo jejich kombinace ve vzorku, jehož přítomnost nebo množství je určováno metodami analytické chemie Vzorek (Sample) Část materiálu vybraná z jeho většího množství Vzorkování (Sampling) Činnosti související s přípravou a zpracováním plánu vzorkování, s vlastním odběrem vzorku a dalším nakládáním se vzorkem a činnosti související se zpracováním příslušné dokumentace Plán vzorkování (Sampling plan) Předem stanovený postup pro výběr, odběr, úpravu na místě, dopravu a přípravu dílčích vzorků nebo vzorků, které budou odebrány ze základního souboru jako vzorek Bod odběru (Sampling point) Pozice, ze které je vzorek odebrán, definovaná jednoznačně a nezaměnitelně prostorovými a časovými souřadnicemi Protokol o odběru vzorku (Sampling protocol) Dokument obsahující všechny potřebné informace o místě, způsobu provedení odběru vzorku a jeho dalším zpracování Mez detekce (Limit of detection, LOD) Naměřená hodnota analytu, který je přítomen ve vzorku s pravděpodobností β, přičemž pravděpodobnost jeho nepřítomnosti je α Mez stanovitelnosti (Limit of quantification, LOQ) Nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit jako exaktní hodnotu se stanovenou nejistotou Nejistota měření (Measurement uncertainity) Při výpočtu nejistoty se může vycházet ze statistické analýzy série opakovaných měření např. CRM (nejistota typu A) a/nebo příspěvku deklarovaných nebo odhadnutých nejistot z jednotlivých složek analýzy (nejistota typu B) Vytěžnost (Recovery) Podíl stanoveného množství analytu nebo jeho ekvivalentu ve vzorku po jeho zpracování (extrakce, čištění) k množství této látky přidané ke vzorku před jeho zpracováním Štandardný operačný postup v analytickom laboratóriu •SOP je súbor písomných inštrukcií, ktoré popisujú rutinnú alebo opakujúcu sa činnosť v analytickom laboratóriu. •Účelom SOP je, aby sa činnosti vykonávali správne a vždy rovnakým spôsobom. SOP sú neoddeliteľnou súčasťou systému kvality v analytickom laboratóriu. •Technický SOP stručným a jasným spôsobom zrozumiteľným pre pracovníka so znalosťami práce v laboratóriu popisuje ako realizovať určitý analytický postup. SOP môže popisovať kompletný analytický postup, t.j. od úpravy vzorky pred extrakciou, extrakciu, čistenie, frakcionáciu, zakoncentrovanie, separáciu pomocou GC, detekciu pomocou MS, vyhodnotenie GC/MS záznamov a výpočet koncentrácií analytov. Pre každý z uvedených krokov však môže existovať samostatný SOP a na výkon analýzy sa potom použije súbor vybraných SOP. •Technický SOP môže obsahovať tieto časti: (a) Názov, (b) účel a oblasť použitia, (c) zhrnutie metódy, (d) rušenie analýzy, (e) bezpečnostné opatrenia, (f) zariadenia a materiál, (g) chemikálie, (f) odber vzoriek, manipulácia a uskladnenie, (g) kontrola kvality (SP, RM), (h) postup spracovania vzorky, (i) postup stanovenia, napr. GC/MS.