Rozvrh přednášek 20.09.2018 8-9.30hod A2-2.ll Doc Paleček Uvod - historie, význam 27.09.2018 8-9.30hod A2-2.ll Doc. Paleček Základní charakteristiky kvasinek 04.10.2018 8-9.30hod A2-2.ll Doc. Paleček Diagnostické a molekulárne biologické metody 11.10.2018 8-9.30hod A2-2.ll Doc. Paleček Genetika kvasinkových organismů 18.10.2018 8-9.30hod A2-2.11 Dr. Špirek Mitochondrie 25.10.2018 8-9.30hod A2-2.11 Doc. Paleček Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces. 01.11,2018 8-9.30hod A2-2.11 Doc Paleček Regulace transkripce. 1-2-3 hybridní systémy, reportér systémy 08.11.2018 8-9.30hod A2-2.ll prof. Svoboda Protoplasty kvasinek jako modelový objekt 15.11.2018 8-9.30hod A2-2.ll prof Svoboda Struktura kvasinkové buňky, sekreční dráhy a endocytoza 22.11.2018 8-9.30hod A2-2.ll prof. Svoboda Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty 29.11.2018 8-9.30hod A2-2.11 Doc. Paleček Organizace kvasinkového chromatinu a evoluce 06.12.2018 8-12hod A7-2.17 Svoboda+Paleček Cvičení k přednáškám 13.12.2018 9-12hod A2-2 I 1 Doc. Paleček test + předtermín zkoušky Přednášky - PPT budou na IS po přednášce Cvičení - blokově 2-3 termíny zkoušení test a přednáška Osnova přednášky • Základní charakteristiky kvasinek -Taxonomie, evoluce - Podmínky růstu, růstové formy, sporulace ... • Morfologie buněk, kolonií... • Komunikace -Amoniak h^h; -Aglutininy, flokulace -Adhesiny, invasiny - Killer toxiny Bakterie x kvasinka Bakterie Kvasinka Četnost v lidské mikroflóre 99% <1% Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan PPM, PLM, glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického materiálu Jádro Ano Ne Ne Ano LPS - lipopolysacharid, LTA - lipoteichoová kyselina, PPM - fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy), domény (nadříše) Eukarvota. - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu (nemožné je jednotně definovat) - roztroušeny ve dvou odděleních hub: houby vřeckovvtrusné nebo stopkovvtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyssi) Saccharomyces cerevisiae: nadříše > Eukarvota říše_> Funai Vhoubv^_ eukaryollc multicellular ingest - sexual oddělení pododdělení třída řád čeleď rod druh > Ascomvcota (vřeckovýtrusé) > Ascomvcotina > (hemi) Ascomycetes > Saccharomycetales (kvasinkotvaré) > Saccharomycetaceae > Saccharomyces > Saccharomyces cerevisiae wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Kvasinky netvorí žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovvtrusné nebo stopko vvtrusné pododdělení/třída: oddělení i—Pezizomycotina (47,000 spp.) _p—Saccharomycotina (300 spp.) '— Taphrinomycotina (120 spp.) _ i—Urediniomycetes (8,000 spp.) ^_r- Ustilaginomycetes (1,500 spp.) Hymenomycetes (20,000 spp.)_ -Glomales (160 spp.) Zygomycetes/Mucofales (700 spp.) -ChitrkJiomycota (900 spp.) říše hub: Ascomycota (47,420 spp) Basidiomycota (29,500 spp) Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes 670 ± TO 1.090 : ' SO 1,140 ± ' ao Í10± 10 (aspergillus) ■ PentciWum chrysogenum (penicillin fungus) Coccidioides immitis (coccidioidomycosis Fungus) Posanum graminearum Sontfariomycetes (head scab fungus) Neurospora crass a (orange bread mould) Magnaporthe grisea free blast fungus) Yarrowia lipoidica (yarrowia yeast] (pyrenoinycetes) Saccharomycotina (Hemiascomycetes) 50 1-970 ± 90 l_ i—I Saccharomyces cerevisiae |—340 ± (baler's yeastj Candida albicans (pathogenic yeast) Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) Pneumocystis carina (pneumonia fungus) WScrobotryum viofaceum (anther smut fungus) UsSiago maydis (com smut fungus) i—I Phanerochaete Hymenomycetes enrysosporium (white rot fungus) Agaricus bisporus CD o o E o N N Q) CL Taphrinomycotina :Ak Im.o; n y c oť. •: i Urecfiniomyi;et« — Ustilaginomycetes Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Cryptococcus neoformans Tremellomycetes, cerevisiae Taxonomie kvasinek Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes mezidruhová vzdálenost TRENDS in Genetics 22 (2006) ■ ■ E E 03 O Ü >% E o o (/) < r -i I I Euascomycetes Saccfcayomyces paradoxus Saccharomyces mikatae Saccharomyces kudnavzevii Saccharomyces bayanus Saccharomyces exiguus Saccharomyces servazzii Saccharomyces castellii Candida gtabraXa Zygosaccharomyces roux.-i KSuyveromyces thermotolerans KUtyveromyces waM Saccharomyces *iuy.ec A Kkiyveromvces lactis Kluyveronryces marxianus Ashbya gossypii i i Pichia angusta Debaryomyces hansenii Pichia sorbrtophila Candida guilliermondii Candida lusitaniae Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida albicans Candida dubliniensis Yarrowia lipolytics Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Xerotolerant Využívá laktózu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany rody: Saccharomyces Kazachstania Naumovia Nakaseomyces Zygosaccharomyces Lachancea Kluyveromyces Eremothecium Clade 2 Clade 1 (Neurospora, Magnaporthe, Aspergillus. Podospora, etc) i Archiascomycetes Schizosaccharomyces pombe Pivo Cryptococcus neoformans LídSký patogen Srovnání průměrnýkí&jshody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata A Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomu. Genomy (sekvence) kvasinek $ ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu se srovnávají těžko Yarrowia tipolytica Debaryomyces — hansenii Kluyveromyces lactis Candida glabrata 3> í) Saccharomyces paradoxus I Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces uvarum 80 % odlišnost sekvence proteinů: - S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba - mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců - Proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhu ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! rozdí, mezj Sc a s p je cca 300mya Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázaná) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody 0,95: Pseudomonas, Escherichia,...,většina bakterií 0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) 0,75: většina halofilních mikroorganismů 0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Deb ary omyce s hensenii Bakterie vyžadují vyšší hodnoty a^ (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa ... lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku - (a^=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) - rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), Lipomyces mají pouzdro - při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCI Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je obligatórne aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů - ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy (Saccharomces c, S. p.) - pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují (gluk. repr.) - respirativní typy - převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu -neprodukují ethanol) - rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 - 48 °C) - většina druhů - psychrofilní (-2 - 20 °C) - voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus) - termofilní (ne méně než 20 °C) - potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyceš) Maximální teploty, které (některé) kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. - rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (některé jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulózu ... nebo methanol (Pichia pastoris), alkany apod. • Nejpreferovanějším cukrem S.c. je glukóza (represe ostatních) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD/YES - bohaté médium = 10g/I yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/u S.pombe supplements: A, U, H, L, K Sabouraudův agar (1892) = 10g/I pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) - např. SD-L,T pro Y2H systém Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2S04, 1 g/l KH?S04, 0,5g/l MgS04 x7H20, 10g/I glukosa, 1 ml/l WicKerhamův roztok, 20g/l agar Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) Forsburg and Rhind, Yeast (2006) - Živiny určují morfologii/buněčnou formu - kvasinková nebo houbová (pseudohyfy) nebo sporulace ... - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Carbon Rich Poor Yeast Form Growth Colony Morphology Pseudohyphal Grqwjff C C Q_ 1. Sporulation B Mutant Phenotype Gain of CCM Loss of CCM í Glucose Elongator i Nitroc MAP Kinase cAMP-PKA Nitrogen Discrimination Ira2p Ras2p Tpk2p Tpk3p G,n3p Flo11p Rim15p Sporulace/meiosa Complex Colony Morphology Rim15p Granekand Magwene, PLoS Genet (2010) Kvasinková forma - morfologie - za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. - rotační elipsoid, kulaté, protáhlé - rod Dipodascus až 130 mikrometrů - 3-15 mikrometrů (bakterie30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) co o CM O in O CÖ OD C/3 0) >*> cc X cytokinese & transkripce (RNApol, mediator, SAGA) Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny -3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk rounded "i! buněčná stěna (a) o miss E miss V miss weak V long HP long LP long Br rounded stubby curved small skittle (b) 100 200 gene number - . stubby buněčná stěna a aktin krátké/tlusté 400 mikrotubuly co o CNI O in CL o co (/) X Pseudohyfy při nedostatku dusíku se diploidní buňky protahují a vytváří pseudohyfy/hyfy - vrůstají do agaru unipolární pučení, mateřské a dceřiné buňky zůstávají spojené (úplná přepážka, neoddělí se dceřiné buňky x pravé hyfy mají přepážky průtočné) chlamydospory - kulaté, silnostěnné, na koncích nebo po stranách hyf-spory nevykazují tak vysokou odolnost jako u bakterii na koncích (i mezi buňkami) mohou vznikat spory (blastospory), které se dále množí pučením (odlišení C. albicans od C. dubliniensis) Carbon Rich Poor Pseudohyphal Grow^ff pseudohypha \ chlamydospore \ V c yeast-like cells blastspore / Candida albicans] 50 Mm Spory při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace C. dubliniensis: nadbytek chlamydospor na koncích krátkých pseudohyf iMwiM.pgodoy.com C. albicans: na delších hyfách či pseudohyfách jen "á jedna terminálni chlamydospora Haploidní spory vřeckovýtrusných kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (pohlavní rozmnožování) kulatý ^ , . , s lineárním Schizosaccharomyces uspořádáním spor Metschnikowia protáhlý s rozpolcenou sporou rhomboedricky pytlovitý kloboukovitý saturn ovitý Saccharomyces Lipomyces Hanensula Nematospora vřetenovitý jehlovity Sporulace - při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace http://www.genetics.org/content/suppl/2015/10/02/201.2.403. DC1 Hoffmann a spol, Genetics, 2015 Glue. 0.5% imel A 2.0% WT ■ ade2 (červená barva) ukazuje haploidizaci heterozygotního diploida (některé hapl. bílé vs červené) šipky ukazují vřecka se čtyřmi sporami Spory - kolonie - při vyčerpání živin na misce mohou (krajní) buňky začít meiotické dělení (diploidní S. cerevisiae) - meiosa je indukovaná IME1 transkripčním faktorem (v imelA se meiosa neindukuje vs. v plME1 overexprimovaných buňkách je indukována meiosa i bez vyčerpání živin tj. 2% glukosa) -"DIFERENCIACE" Purnapatre a Honigberg, Curr Genet, 2002 Vertical colony section U cells U cells Fraction 3 cells kolonie -větší buňky (4jim) -malé mitochondrie a vakuoly -více lipidových váčků rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů -menší buňky (3jim) -velké mitochondrie i vakuoly (aktivnější respirace a více ROS) vertical transversal colony section centra ansversai colony a I part of the col Ion y Čáp etal.,Mol Cell, 2012 rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů Vertical colony section II aaIIa II jr*. , Alo3p Poxlp IcI2d ~'ble1 d Met17D InolD •.*/■. X * * ■. • j »• * *. • «.* t • «l 1 • • • < • . • . • j •j * * •». •* «í« i • Vi-•:' * * • * '»I ■ 1 ■'■:<■ • 20 um 20i.m 15d 15d 15d 15d 15d 15d vertical transversal colony section Čáp et al., Mol Cell, 2012 Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 U (upper) buňky - aktivní glutaminem-indukovanou TOR dráhu, sníženou respiraci (málo mitochondrii), AMK-sensing systém (Gcn4) a vyšší „turnover" AMK (souvisí s produkcí amoniaku), produkují amoniak pro komunikaci kolonii - využívají živiny uvolněné z L buněk (autofagie) - jsou odolnější vůči stresu -déle přežijí - schopné proliferovat (po 10 dnech)_ L (lower) buňky - podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Komunikace kolonií Kvasinkové kolonie spolu „komunikují" (i bez dotyku) pomocí amoniaku - inhibuje růst sousední kolonie (kolonie S. cerevisiae produkují amoniak po 10 dnech růstu) ■*----L Ctil----•■ Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny a GM-agar The arrow Indicates, the direction of the rone *— • ■ i. ant colony Ltd it----2.1 em-----m kolonie přesměrovává růst sousední kolonie -nekompetují o živiny - 2.9 cm- Pálková et al., Nature 390 (1997) - různé vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám (...hyfy) - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukózy) - naopak tvrdý agar (4%, + suchá) a UV záření indukuje „stopkování" (složená z kvasinkových nikoli pseudohyfálních buněk) - zvyšuje šanci na diseminaci Kolonie různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy" kolonie - kulaté a oválné buňky (S.c.) - není určující faktor - drsné kolonie - protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie - pouzdra (Lipomyceš) obvykle krémová barva -červený pigment (Rhodotorula, Sporidioboluš) černý pigment (melanin - Aureobasidium) Carbon Rich Poor 2 c CD U) O c G 0. Yeast Form Growth Colony Morphology Response 1 Pseudohyphal GrowjfT Sporulation OJ* Granekand Magwene, PLoS Genet (2010) Kolonie různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy" kolonie - kulaté a oválné buňky (S.c.) - není určující faktor - drsné kolonie - protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie - pouzdra (Lipomyces) obvykle krémová barva - Day of Growth červený pigment (Rhodotorula, Sporidioboluš) černý pigment (melanin - Aureobasidium) • • • • - využívá se např. pro odlišení Cd. od Ca. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) Carbon Rich Poor Yeast Form Growth Colony Morphology c o CL Pseudohyphal Growjff Sporulation op • • ® JÍ* # • # • # • CD fx 3 Cn CD O o =S CD Z3 -1 CD o' Granekand Magwene, PLoS Genet (2010) Morfologie kolonie - Candida Např. odlišení Cd. od Ca.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Extracelularní matrix wild type Mo11 Cl Ú- t - morfologie kolonie závisí na ECM (extracellular matrix tj. glykoproteiny) - ECM zachycuje vodu a chrání kolonii před vyschnutím - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) - závisí na FL011 (adhesin - glykoprotein -faktor důležitý pro flokulaci, biofilm, pseudohyfy) ECM Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010) Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C - Genotyp: MATa SUC2 gal2 mal mel flol flo8-1 hapl) Biofilm 8g> ccsiQ-^Scc^i surľace - tvořen EC matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - více rezistentní než planktonické buňky - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) - ECM a adhesiny/flokuliny FL01, FL011 jsou potřebné pro tvorbu biofilmu - váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky (C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci J matrix B S.c. kmen S1278b Invasivní růst Colony Before Wash A'lur Vv.i-'l WT • ■ *• • • • «; .* ♦ • Ca_tk>8ii □ ;>.;•• ■ Ca mfaJA,1 ■ ■ ■ ■ . • B Ps H ieudohyp • hal Grow • th • C Biofilm # • • • ODOLI • • • 33 ÍS^á • Phenotyi >ic Score oono Phenotypic Score -7 0 10 -26 0 26 - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, FI08, Mfg1 faktory jsou konzervovány ... a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans Ryan et al, Science (2012) Invasion 190 FL011 RIM101 RPD3 FLO8 SIN3 TEC1 RXT2 MSS11 MIT1 MFG1 SPE1 SPE2 "* SPE3 SPE4 Biofilm Pseudohyphal F ✓ A* wi E • • • • • • F sff/A • • □ • • • úig1L • • • i • • • sok2& □ 0 * • • • Scoro 10 -7 adhesin RelalíVfi fl.Oíípr-GFP expression o 0.3 o.$ o.u 1.2 1.5 i.a - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) Ryan et al, Science (2012) 1 ■ 1 ■ 1—1 reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, f loky); odpověď na stres flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci Diva) flol FLOl -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky ... - Flolp váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci -teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol Yeast surface display - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace GPMiir>/pMtcn (IOOjiM CuS04) - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 ...) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy ... posttranslační modifikace) - knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Pepperetal, CCHTS (2008) YSD - testy antigen/protilátka - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) - na kuličkách je navázán antigen - opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) Pseudohyfy, adhesiny ... a candidalysin Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů - Hwp1) - invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele - Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Killer toxiny - Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře - nepřerostou je cizorodé kmeny) - Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) - Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin ...) - Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles" (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) - kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci ...), transkripční sekvence a toxin - Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) - Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny ((3-1,6-glukany) -způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně - ztráta iontů, potenciálu ... buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens - lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenula mrakii... - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu (3-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) Table 2. Killer activity of P. membranifaciens CYC 1 086 and CYC 1106 against yeasts and fungi of biotechnological interest Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer activity 1086 1106 1086 1106 1086 1106 S. cerevisiae SGV — — B. bruxellensis 1D007 3 + — PUhia anomala 11141 — — S. cerevisiae CEG - - R bruxellensis DO 13 1 + - Pichia membranifaciens CYC 1070 2 + S. cerevisiae VRB — 3 + B. bruxellensis DO 14 1 + - Aspergillus spp. 27 - - S. cerevisiae NEM - - B. bruxellensis DO 15 1 + - A. carbonarius B MUM - S. cerevisiae 2056 — 2 + B. bruxellensis DO 17 2 + - A. orchraceus - - S. cerevisiae BM45 — 3 + B. bruxellensis DO 18 1 + - A. oryzae - - S. cerevisiae 2323 - - R bruxellensis DO 19 1 + - A. tubingensis - S. cerevisiae ALB — 3 + ft bruxellensis D027 1 + - Fusarium culmorum - - S. cerevisiae SLO - 4 + B. bruxellensis D028 1 + - F. graminearum NRRL 28525 - - S. cerevisiae VN - - B. bruxellensis D029 2 + - F. graminearum NRRL 29020 - S. cerevisiae 71B - 4 + B. bruxellensis D031 1 + - F. pone - S. cerevisiae CS2 - 1 + B. bruxellensis D032 1 + - F. proliferatutn MM 1-2 2 + S. cerevisiae CM - - B. bruxellensis D033 1 + - F. proliferatutn MM 3-1 2 + .S", cerevisiae 11AY - - R bruxellensis D035 2 + - F. proliferatutn MM 6-2 - S. cerevisiae FS - 3 + B. bruxellensis D036 14 - F. reticulloides MM 6-3 - - 5. cerewsiae 16 - - R bruxelletisis D038 1 + - F. reticulloides MM 7-3 - - S. cerevisiae 17 - 3 + Debaryomyces hansenii 1021 - - F. sporoirklwides ITEM 550 - S. cerevisiae 18 - 3 + D. hansenii 1244 - - Botrytis cinerea 20003 3 + S. cerevisiae 19 - - D. hansenii 10388 — - B. cinerea 20004 1 + S. cerevisiae SCI — 4 + D. hansenii 10386 - - B. cinerea 20005 2 + ■ ■ r i i i é i 4 4 f II ■ O V I ^ < - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena P.m. - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci - odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny Ca., C. podzolicus zabíjí C.n.) ' Santos et al., 2009, Microbiology Priony - epigenetická informace kvasinek Adhesivní vlastnosti mohou být ovlivněny přítomností prionů [PSI+] kódovaných Sup35 genem - jeho PrD doména spouští tvorbu amyloidových agregátů) [PSh] Cured Total growth Adhesive growth Sup35APrD Wash UCD824 fluconazole 40 60 80 Time (h) YPD controls Original isolate Cured derivative 100 GdHCI curing Sup35 je translační terminační faktor (zastavuje translaci na STOP kodonu) - pokud agreguje/nefunguje, dochází k read-through genů tj. vznikají proteiny s delší sekvencí a novými vlastnostmi (záleží na genomu dané kvasinky jaké) - mohou dát kvasince nové výhody (např. zvýšenou rezistenci k fluconazolu) Halfmann a kol., 2012, Nature