C9045 - Biologie kvasinek
prof. Augustin Svoboda
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant – A2, 214)
Hustopeče u Břeclavi
O čem se dozvíte?
• Význam – výskyt, využití, výzkum …
• Mikrobiologie - základní charakteristiky
• Biotechnologie - metody
• Genetika - metody
• Klinické aspekty – patogenní kmeny
• Buněčná biologie – buněčná stěna …
• Molekulární biologie – buněčný cyklus,
transkripce, chromosomy, evoluce
Průřez učivem pro státnice
Rozvrh přednášek
Přednášky – PPT budou na IS po přednášce
Cvičení – blokově
2-3 termíny zkoušení
test a přednáška
Osnova 1. přednášky
• Úvod
• Kvasinky – historie
• Výskyt a přenos
• Vztah k lidskému zdraví
• Význam pro biotechnologie a výzkum
Hustopeče u Břeclavi
Informační zdroje
Janderová & Bendová: Úvod do biologie kvasinek, nakladatelství Karolinum (1999)
Hinnebusch & kol: YeastBook (An Encyclopedia of the Reference Eukaryotic Cell,
2012-2016, Genetics: http://www.genetics.org/content/yeastbook)
F. Sherman: Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002):
http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/StartedYeast.html
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PNAS … vždy uvedeny na stránce
SGD databáze: http://www.yeastgenome.org/
http://wiki.yeastgenome.org/index.php/Commonly_used_strains
Cherry et al., NAR, 2012
Sheppard et al., NAR, 2016
Témata symposií a workshopů
Regulation of Gene Expression
RNA processing and regulation
Metabolism and stress response
Organelle dynamics
Cellular strategies of protein quality control
DNA replication, mutation and repair
Cell cycle, cytoskeleton and morphogenesis
Modern yeast biotechnology
New tools in yeast research - omics
Yeast population, comparative and evolutionary genomics
Systems biology and bioinformatics
Proteostasis, ageing and disease models
Yeast pathogens and host interaction
Kvasinkáři
• Brno – prof. Svoboda, … doc. Paleček
• Praha – prof. Pálková, Dr. Hašek, Dr. Valášek …
• SR - Bratislava – prof. Tomáška, prof. Nosek …
• UK – prof. Nurse, prof. Carr …
• USA –prof. Schekman, prof. Forsburg …
http://listserver.ebi.ac.uk/mailman/listinfo/pombelist - S. pombe
http://www.yeastgenome.org/cache/yeastLabs.html - S. cerevisiae
… trochu (pre)historie
- přirozeně v prostředí mohou fermentovat sladké šťávy (např. nektar …)
- lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 lety
(Čína), chleba před ~4000 lety
- ve středověku v Evropě kvasily slad – název yeast pochází z německého
Gischt/holandského Gist (název pro pěnu na povrchu kvasných produktů –
„Ale“ se svrchním kvašením - používaná pro re-inokulaci nového kvašení)
- v Čechách se vařilo pivo od 9.století (kníže Václav zakázal vývoz chmelu
pod trestem smrti)
- roku 1516 v Bavorsku poprvé definovali
co a kdy se smí použít pro vaření piva
(ječmen, voda a chmel – v období od 29.9. do 23.4.
kvasinky brali jako vedlejší produkt)
- v letním období skladováno v jeskyních na ledu
(skladování a chladné prostředí – kvasinky pro
“Lager“ se spodním kvašením)
Monerawela a Bond, Biotech Adv, 2017
dle NGS
původem z Číny
… trochu (experimentální) historie
- poprvé kvasinky pozoroval A. van Leeuwenhoek v roce 1680
- L. Pasteur prokázal aktivní účast při kvašení (polovina 19. století) – řešil
problém francouzských vinařů s „kažením vína“ – zjistil, že k fermentaci
dochází za anaerobních podmínek (Pasteurův efekt – lepší růst)
- název Zuckerpilz („cukerná houba“) tj. Saccharomyces od roku 1837
(Schwann)
- první čisté kultury S. pastorianus izolovány z piva (E.Ch.Hansen, Carlsberg)
a S.c. z vína (Muller-Thorgau) v 80.letech 19. století (cerevisiae = pivo v
latině, pombe = pivo ve swahili)
- Buchner připravil roku 1897 šťávu z rozdrcených
kvasnic, prostou buněk (cukr byl touto
„šťávou“ zkvašován – zymáza – základy
oboru biochemie) – Nobelova cena (1907)
- Harden zkoumal enzymy účastnící se
procesu kvašení a v roce 1906 objevil i
nebílkovinné složky kozymázy tzv. koenzymy
Monerawela a Bond, Biotech Adv, 2017
… trochu (vědecké) historie
- první systém pro klasifikaci (patogenních) kvasinek, založený na
morfologii buněk a několika fyziologických testech (fermentace
monosacharidů) vytvořil A. Guilliermond v roce 1912
- v Československu prof. Kratochvilová …
- v 70. letech 20. století se začaly kvasinky využívat jako modelový
eukaryotický organismus v molekulární biologii (navazoval na výzkum
bakterií a bakteriofágů)
- nejintenzivněji studovanou eukaryotní buňkou byly kvasinky
S.cerevisiae (USA) a S. pombe (UK, Japonsko)
- Nobelova cena: za výzkum buněčného cyklu - 2001 – Hartwell, Hunt,
Nurse; za sekreci – 2013 – Schekman, za autofagii – 2016 – Ohsumi)
- S. cerevisiae první kompletně osekvenovaný eukaryotní genom
(1996, S. pombe, 2002; v současnosti osekvenovány desítky druhů a
stovky kmenů kvasinek)
- v současnosti několik set laboratoří na světě využívá S. pombe …
Fantes a Hoffman, Genetics, 2016
Science272(1996),p.481+Nature458,(2009),p337
- savci pili alkoholický nektar miliony let
- Tana pestroocasá pije fermentovaný
nektar z květu Bertramovy palmy
- dlouhodobá konzumace
fermentovaných šťáv vedla k evoluční
adaptaci tohoto savce – zvýšená
exprese alkoholdehydrogenásy
- autoři spekulují o vlivu takovýchto
přírodních alkoholických nápojů na
evoluci … nastavení hladiny ADH u
člověka ;-)
- kvasinky Saccharomyces cerevisiae aj.
rostou na substrátech bohatých na cukr
- kvasinky fermentují sladký nektar z
Bertramovy palmy
A B
C
Wiens et al., PNAS, 2008
Přirozený výskyt
- ve vodě (dle čistoty – moře 10/l, jezera 100/l, odpadní až 108/l; v
arktických vodách Leucosporidium, v odpadních vodách Candida
parapsilosis, S. exiguus, fekální znečištění indikuje Hansenula anomala, C.
albicans, v olejem znečištěných vodách Candida (Yarrowia) lipolytica, C.
tropicalis, v planktonu v závislosti na řasách např. Rhodotorula
- v půdě (mnohem méně než bakterií, do 15cm hloubky –
Schwanniomyces, Lipomyces, Pichia, Cryptococcus, schopny hydrolyticky
štěpit celobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu)
Conell et al., Microb Ecol 56 (2008)
- naproti tomu v Antarktidě
jsou dominantní (méně
bakterii)
- výzkum v letech 2003-4:
Izolovány 2x asco- a 16x
basidiomyceta (7x nové druhy)
*
*
*
*
*
*
*
Nově objevené kvasinkové druhy*
Půda a kvasinky
● Typ vegetace → složení půdních mikrobiálních komunit
● Kvasinky jsou kosmopolitní (většinou autochtonní, kromě kmenů
výrobních)
● Množství a druhové složení kvasinek v půdách je nerovnoměrné (více v
asociaci s rostlinami) – ovlivňuje mnoho faktorů
● Nejsou primárními degradátory těžko rozložitelných látek (lignocelulóza),
ale degradátoři meziproduktů rozkladu rostlinného materiálu (aerobní
rozklad L-arabinózy, D-xylózy, celobiózy)
Botha, Soil Biol. Biochem., 2011
● Transformace živin
● Koloběhy C, N, S, P v ekosystému
● Aerobní respirace i fermentace živin
● Nitrifikace = přeměna amoniaku na dusičnany (rody Candida,
Geotrichum, Rhodotorula, Saccharomyces, Williopsis)
● Sulfurikace = oxidace síry na sírany, thiosírany (rody
Rhodotorula, Saccharomyces, Williopsis)
● Rozpouštění těžko rozložitelných fosforečnanů (rody
Rhodotorula a Williopsis) → podporuje růst rostlin
Yurkov a spol., Soil Biol. Biochem., 2012
Birkenhofr a spol., PLoS One, 2012
● Nerovnoměrné (komplexní) rozložení kvasinek
● Pokryv půdy má velký vliv na diverzitu a množství půdních kvasinek (lesy
x pastviny), stejně tak i lidská činnost (oblasti zemědělsky a lesnicky
využívané x přirozené)
Rostliny a kvasinky
- na listech rostlin, květech (nektar palmy
Bertramové … červené kvasinky rodu Rhodotorula,
Rhodosporidium, Sporobolomyces, černá Aureobasidium pullulans,)
- na kořenech
50 druhů z trávy A. elatius
Vandenkoornhuyseaspol,Science,2002
Rostliny a kvasinky
- především na kazících se plodech
(na spadlých rozkládajících se plodech … schopny hydrolyticky
štěpit celobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu zahnívající
kaktusy => pektolytické bakterie => kvasinky Pichia
cactophila, P. opuntiae => přenos a výživa drosofila)
Počet kvasinek, log
(CFU/g)
Měsíc
1
2
3
1 – listy
2 – květy
3 - hrabanka
Glushakova & Chernov, Microbiology, 2007
Sezónní dynamika kvasinek
● Rozpouští nerozpustné fosforečnany … → podpora růstu kořenů
(stimulátory růstu a biohnojiva)
● Symbionti nebo paraziti
● Interakce s houbami
● Exocelulární polymery (glykolipidy, glykoproteiny) s
fungicidními a fungistatickými účinky
● Extracelulární enzymy (glukanázy)
● Mykociny (proteiny)
● Kvasinky a jejich extracelulární polymery a jednoduché
metabolity → zdroj potravy pro jiné organismy
● Predátorské kvasinky Saccharomycopsis fermentans a
Saccharomycopsis javanensis
● Okyselování prostředí → regulace počtu některých
bezobratlých
Interakce s živočichy
Predátorská kvasinka
(Dactylellina candida)
napadající hlístici
(http://www.uoguelph.ca/~g
barron/2008/dactylel.htm)
Hmyz a kvasinky
- přenášeny hmyzem (opylovači) - včely, brouci, mouchy
Suh a spol., Mycol Res, 2006
druhy čmeláků
početkvasinkovýchdruhů
Hmyz a kvasinky
- kvasinky ve střevě mouchy Drosophila …
- askus chrání spory během průchodu trávicím traktem, ale
zároveň dochází k částečnému natrávení enzymy, čímž se
usnadňuje kontakt mezi nepříbuznými gametami
- bylo zjištěno, že průchod trávicím traktem 10x zvyšuje
frekvenci sexuálního rozmnožování s nepříbuznými
gametami
- hypotéza: hmyz slouží jako vektor umožňující kvasinkám
osidlovat nová prostředí, přičemž zvýšená rekombinace
zvyšuje šance na přežití a adaptaci na ně
Sandhu & Waraich, Microb. Ecol., 1985
- Tana pestroocasá pije fermentovaný nektar z květu Bertramovy palmy …
- i člověku se dostávají kvasinky do trávícího traktu např. při konzumaci
burčáku, nefiltrované pivo … neškodné pro zdravé jedince (! ale co pro
imunokompromintované jedince?)
- nejčastěji je z gastrointestinálního traktu izolována C. albicans (C. dubliensis)
- kvasinky tvoří jen malou část stálé mikroflóry ve střevě - méně než 0,1 %
mikroflóry
- kůže, ústní dutina, sputum, vaginální sekrety, výtěry zvukovodů, moč, stolice ...
Kvasinky a savci
-15 druhů je potenciálními lidskými patogeny (vyvolávají onemocnění u
oslabeného organismu – imunosupresiva, cukrovka … významným faktorem
virulence je schopnost tvorby biofilmu - antibiotika na eukaryota nezabírají)
-Kandidózy (C. albicans, dubliniensis, krusei, tropicalis, parapsilosis,
glabrata, utilis, lipolytica)
-Candida albicans – urogenitální a krevní infekce (vyskytuje se u
člověka přirozeně)
-Cryptococcus neoformans – 8% AIDS pacientů – plícní onemocnění
až do mozku - (přenáší švábi a holubi – kreatinin z trusu používají
jako zdroj dusíku)
-Malassezia – poruchy pigmentace kůže a lupy tzv. pityriázy (M.
furfur, globosa, japonica, obtusa, restricta, yamatoensis, dermatis,
slooffiae, sympodialis, nana, pachydermatis)
-3 druhy Trichosporon (kúže)
Malassezia furfur
pityriasis versicolor
Prof. A. Svoboda
Patogenní kvasinky
Findley et al, Nature, 2013
mikrobiom
- sekvenace vzorků od 10 zdravých jedinců
- ruce, nos, uši, záda, třísla … Malassezia
- zatímco na nohou velká diverzita
mezi
prsty
nehty
palce šlapky dlaň
předloktí Loketní
důlek
Nosní
dírky hruď
Čelo
dolní
za
ušima
třísla ušní
otvor
zátylek záda
Murzyn et al., 2010, FEMS Microbiol Lett.
- Saccharomyces boulardii – izolován z čínské švestičky
Lyči (1920, Henri Boulard) - používán jako probiotikum
při střevních potížích (Enterol, Salutil) - ochrana proti
patogenům (Salmonella typhimurium, C. albicans) –
modulují imunitní systém, inhibují účinky bakteriálních
toxinů a růst hyf …
- Pangamin – kvasinkové lyzáty – vitaminy, nenasycené mastné kyseliny,
minerály …
- ImmiFlex – obsahuje beta 1-3,1-6 glukany z buněčných stěn kvasinek S.c. –
aktivují imunitní systém (neutrofily) a zvyšují tak obranyschopnost organismu
Význam pro zdraví člověka
- exprese proteinů - příprava „hepatitis B core“ antigenu, insulin (S. cerevisiae), antithrombin
proti srážení krve (Pichia pastoris)
Murzyn et al., 2010, FEMS Microbiol Lett.
- Saccharomyces boulardii – izolován z čínské švestičky
Lyči (1920, Henri Boulard) - používán jako probiotikum
při střevních potížích (Enterol, Salutil) - ochrana proti
patogenům (Salmonella typhimurium, C. albicans) –
modulují imunitní systém, inhibují účinky bakteriálních
toxinů a růst hyf …
- Pangamin – kvasinkové lyzáty – vitaminy, nenasycené mastné kyseliny,
minerály …
- ImmiFlex – obsahuje beta 1-3,1-6 glukany z buněčných stěn kvasinek S.c. –
aktivují imunitní systém (neutrofily) a zvyšují tak obranyschopnost organismu
Význam pro zdraví člověka
• - exprese proteinů - příprava „hepatitis B core“ antigenu, anti-thrombin proti srážení
krve (Pichia pastoris) – farmaceutický průmysl (20% produktů v kvasinkách)
Průmyslový význam
- výroba piva, vína, etanolu a pekařského droždí (S.c.), různé
kmeny pro spodní (S. bayanus) a svrchní kvašení, vinařské a
lihovarské (hybridní kmeny např. S.c. + S.kudriavzevii)
- krmná biomasa (Candida utilis), příprava mléčných výrobků
(Candida kefyr, Klyuveromyces lactis), získávání ergosterolu
(prekurzor vitaminu D), zdroj komplexu vitamínů skupiny B …
- štěpení škrobu amylolytickými enzymy (Saccharmycopsis
fibuligera, Schwanniomyces occidentalis)
- štěpení dřevní hmoty – štěpí xylozu přímo na etanol za
aerobních podmínek (Aureobasidium, Candida utilis, Pachysolen
tannophilus, Candida shehatae a Pichia stipitis)
- odbourávání ropných produktů (Yarrowia lipolytica),
- sorpce těžkých kovů (odstranění znečištění)
- exprese proteinů - příprava hepatitis B core antigenu, antithrombin
proti srážení krve (Pichia pastoris)
- též v příští přednášce
Mgr. J. Kopecká
Mattanovich et al, Microbiol Cell Factories, 2014
- kvasinky byly po tisíciletí hlavním mikroorganismem „biotechnologií“
- v polovině 20. století nástup bakteriálních technologií
- kvasinky (díky detailnímu poznání …) opět nabývají na významu: produkce
metabolitů, produkce rekombinantních proteinů, in vivo biotransformace
- S. cerevisiae – hlavní metabolismus glukosy vede k produkci etanolu (jiné
druhy nejsou tak efektivní a užívají i jiné metabolické dráhy … v přírodě není
běžná vysoká konc. glukozy)
výhody kvasinek: vysoká rychlost
„pohlcování“ substrátů a metabolismu
velmi odolné vůči stresu
- butanol (lepší než etanol), kyselina
mléčná, isoprenoidy (Artemisinin
– antimalarikum)
sekvence genomů mnoha kvasinek
(vhled do jejich metabolismu – možnost
využití heterologních metabolických drah)
„platform strain“
Mattanovich et al, Microbiol Cell Factories, 2014
- kvasinky byly po tisíciletí hlavním mikroorganismem „biotechnologií“
- v polovině 20. století nástup bakteriálních technologií
- kvasinky (díky detailnímu poznání …) opět nabývají na významu: produkce
metabolitů, produkce rekombinantních proteinů, in vivo biotransformace
- S. cerevisiae – hlavní metabolismus glukosy vede k produkci etanolu (jiné
druhy nejsou tak efektivní a užívají i jiné metabolické dráhy … v přírodě není
běžná vysoká konc. glukozy)
výhody kvasinek: vysoká rychlost
„pohlcování“ substrátů a metabolismu
velmi odolné vůči stresu
Pichia pastoris (syn. Komagataella
pastoris), Hansenula polymorpha
(syn. Ogataea parapolymorpha),
Yarrowia lipolytica, Pichia stipitis
(syn. Scheffersomyces stipitis),
Kluyveromyces marxianus
„platform strain“
Využití S. cerevisae pro výrobu biopaliv
• Nemají přirozenou metabolickou dráhu pro odbourání celobiosy a xylozy
• Vloženy geny XYL1 and XYL2 kódující xylózovou reduktázu (XR) a xylitolovou
dehydrogenázu (XDH) z kvasinky Pichia stipitis
• Přednostní využívání glukózy (glukózová represe v dalších přednáškách)
• Transport celobiosy do buňky (cdt-1 integrován do genomu) a jeho přeměna na
glukózu uvnitř buňky (gh1-1 z Neurospora crassa na „multicopy“ plazmidu)
obešla represi
Ha et al, 2011, PNAS
- Více v dalších
přednáškách
Příprava monomerů pro výrobu plastů
– využití Candida tropicalis
Lu et al., JACS (2010)
• Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku
(acetyl-CoA)
• mutantní kmen (P450: POX4 …) není schopen -oxidace a přeměňuje je
oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992)
• další mutagenezí (pomocí flp rekombinasy – viz genetika) odstranili geny dalších oxidás
(alkohol oxidásy) a dehydrogenás (alkohol dehydrogenás) aby eliminovali
-oxidaci
• nový kmen je schopen produkovat
-hydroxymastné kyseliny, které
lze použít pro výrobu bio-polymerů
(plastů podobných polyetylenům,
bio-odbouratelné na bio-palivo)
• další modifikace kmene
(integrace genů pro lipásy)
by umožnilo přímé odbourávání
odpadních olejů …
Přednáška
o genetice
Dikarboxylové kyseliny
Lu et al., JACS (2010)
• Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku
(acetyl-CoA)
• mutantní kmen (POX4, POX5) není schopen -oxidace a přeměňuje je
oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992)
• další mutagenezí (pomocí flp rekombinasy – viz genetika) odstranili geny dalších oxidás
(alkohol oxidásy) a dehydrogenás (alkohol dehydrogenás) aby eliminovali
-oxidaci
• nový kmen je schopen produkovat
-hydroxymastné kyseliny, které
lze použít pro výrobu bio-polymerů
(plastů podobných polyetylenům,
bio-odbouratelné na bio-palivo)
• další modifikace kmene
(integrace genů pro lipásy)
by umožnilo přímé odbourávání
odpadních olejů …
Přednáška
o genetice
Dikarboxylové kyseliny
alcohol
dehydrogenase
Fatty
alcohol
oxidase
P450
Výzkum
- Je třeba kvasinkám rozumět (na molekulární úrovni), aby bylo možné je
využít např. pro biotechnologie, výzkum (od jednoduchých základních
mechanismů ke studiu složitějších … až k objasňování lidských nemocí)
- S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy
- jednoduchá eukaryontní buňka (základní procesy jako u vyšších eukar.)
- 1. osekvenovaný eukaryontní genom, 1. syntetický eukar. chromosom
(cca 3000 z 5000 genů je konservováno v eukaryotech)
- buněčný cyklus (sir P. Nurse)
- sekrece, endocytóza, buněčná stěna (prof. Schekman, prof. A. Svoboda)
- chromosomy a evoluce (např. projekt syntetického chromosomu)
- mechanismy opravy poškozené DNA (nádorové syndromy)
- Metody využívající kvasinek (např. 2-H, reporterové systémy)
-Vícevdalšíchpřednáškách
Srovnání 250 sekvencí lidských genů, jejichž mutace vedou
ke vzniku onemocnění – cca 90 genů má S.c. homology
Wood et al, Nature, 2002
Výzkum
- buněčný cyklus, … mechanismy opravy poškozené DNA
Wood et al, Nature, 2002
Výzkum
- Buněčné mechanismy …
Krobitsch&Lindquist,PNAS,2000
Analýza polyQ (glutaminové repetice) v kvasinkách
- polyglutaminové repetice (CAG triplet slipage) v proteinech (huntingtin - Ht) způsobují
závažné neurodegenrativní onemocnění (Huntigtonovu nemoc)
- Ht-GFP (s různě dlouhými polyQ) byly exprimovány v S. cerevisiae a sledován
vznik agregátů/nerozpustných proteinů – závislost na chaperonech (delece
Hsp104 snižovala agregaci a zvyšovala rozpustnost)
hsp104huntingtin