Proteomika Proteomické aplikace CG010 Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU NCBR, PřF MU zdrahal@sci.muni.cz Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU CEITEC_logo-text_cz_pos_RGB 1 nfsnf File:Metabolomics schema.png •http://en.wikipedia.org/wiki/File:Metabolomics_schema.png CG010 2 CG010 Proteomika - Proč? * z každého genu může vzniknout několik proteinů, resp. jejich forem, které nelze indikovat na základě analýzy DNA resp. mRNA * neexistuje přímá korelace mezi obsahem mRNA a výsledným obsahem proteinů * * funkční význam proteinu závisí velmi často na jeho interakci s jinými proteiny či DNA/RNA * * na úrovni proteinů lze zachytit epigenetické faktory regulace exprese genu * 3 Náročnost analýzy proteomu * proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat až 1 000 000 proteinů včetně všech forem (izoformy, PTMs) - proteoforms (Nature Methods, 10 (3), 186 (2013)) ~ 10 000 proteinů v buňce v každém okamžiku * široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA * široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností * analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů MM900282753[1] CG010 4 Přehled vybraných metod pro studium proteinů Charakterizace komplexních směsí proteinů •Hmotnostní spektrometrie včetně přípravy vzorku a separace • Proteinové čipy Struktura proteinů •Cirkulární dichroismus •Nukleární magnetická resonance • Rentgenová krystalografie • Kryoelektronová mikroskopie Interakce proteinů •Dvouhybridní systém (Y2H) •Surface plasmon resonance •Mikroskopické techniky Detekce/lokalizace proteinů • Imunochemické metody (westernový přenos, ELISA) •Mikroskopické techniky CG010 5 •Proteomické aplikace CG010 Charakterizace kvalitativních a kvantitativních změn celého proteomu * Hmotnostní spektrometrie (MS) nejrozšířenější technika pro charakterizaci proteinů a jejich modifikací (na základě primární struktury) 6 CG010 •kvantifikace proteinů • (pomocí „izotopických“ značek , label-free, MRM) •identifikace proteinů • (identifikace, proteinové komplexy, de novo sekvenování) •analýza intaktních molekul • (MW,kontrola produktů reakce, MALDI-MS profilování) •charakterizace proteinových modifikací • (fosforylace, acetylace,ubikvitinace aj. ) Sphos m/z D m/z = 167 Hmotnostní spektrometrie v proteomice •charakterizace 3D struktury proteinů •MALDI-MS zobrazování 7 Differenční (expresní) proteomika Kvalitativní a kvantitativní srovnání proteomů - určení změn v regulaci proteinů a jejich forem (PTMs), které nastaly v důsledku vnitřních či vnějších podnětů. kontrola stres Rhodotorula glutinis CG010 8 Cílená proteomika Sledování kvantitativních změn vybraných proteinů (např. biomarkerů) ve vzorcích. interní std real LC-MS/MS (MRM) MS MS/MS real is Stanovení enterotoxinu (S. aureus) CG010 9 Studium interakcí proteinů a jejich funkční význam. - interakce mezi proteiny - vznik a architektura proteinových komplexů - interakce proteinů s jinými molekulami (RNA, DNA metabolity aj.) Funkční proteomika K.G. Guruharsha et al., Cell, 147, 690–703 (2011) L. Kozakova et al., Cell Cycle, 14, 920-930 (2015) CG010 10 Studium vyšších úrovní proteinové struktury (terciární, kvarterní) a vztahu struktury k funkci proteinu. Strukturní proteomika http://swissmodel.expasy.org/course/gifs/1bmf.gif Strukturu formují různé typy vazeb – iontové interakce, vodíkové můstky, van der Waals síly nebo disulfidické můstky. CG010 11 12 •https://gold.jgi.doe.gov/ •Increase in knowledge of genomes Number of sequences in NCBIprot database (2002-2018) millions protein characterization by MS is in principle based on knowledge of primary sequence CG010 > Snímek11 • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ab/Zv%C3%ADkov_4.jpg 13 CG010 Kontrola produktů syntézy 14 >gi|3157976|gb|AAC17470.1| alpha actinin [Homo sapiens] MVDYHAANQSYQYGPSSAAMAWRRGSMGDYMAQEDDWDRDLLLDPAWEKQQRKTFTAWSNSHLRKAGTQI ENIDEDFRDGLKLMLLLEVISGERLPKPERGKMRVHKINNVNKALDFIASKGIKLDFHRAEEIVDGNAKM TLGMIWTIILRFAIQDISVEETSAKEGLLLWCQRKTAPYKNVNVQNFHISWKDGLAFNALIHRHRPELIE YDKLRKDDPVTNLNNAFEVAEKYLDIPKMLDAEDIVNTARPDEKAIMTYVSSFYHAFSGAQKAETETAAN RICKVLAVNQENCSTSMEDYEKLASDLLEWIRRTIPWLEDRVPQKTIQEMQQKLEDFRDYRRVHKPPKVQ EKCQLEINFNSVQTKLRLSNRPAFMPSEGKMVSDINNGWQHLEQAEKGYEEWLLNEIRRLERLDHLAEKF RQKASIHEAWTDGKEAMLKHRDYETATLSDIKALIRKHEAFESDLAAHQDRVEQIAASAQELNELDYYDS HNVNTRCQKICDQWDALGSLTHSRREALEKTEKQLEAIIDQLHLEYAKPAAPFNNWMESAMEDLQDMFIV HTIEEIEGLISAHDQFKSTLPDADREREAILHPQGGQRIAESNHIKLSGSNPYTTVTPQIINSKWEKVQQ LVPKRDHALLEEQSKQQQSNEHLRRQFASQANVVGPWIQTKMEEIAISIEMNGTLEDQLSHLKQYERSIV DYKPNLDLLEQQHQLIQEALIFDNKHTNYTMEHIRVGWEQLLTTIARTINEVENQILTRDAKGISQEQMQ EFRASFNHFDKDHGGALGRGVQGLPHQPGLRRGERPAGEAEFNRIMSLVDPNHSGLVTFQAFIDFMSRET TDTDTADQVITSFKVLAGDKNFITAEELRRELPPDQAEYCIARMAPYQGPDGVRGALDYKSFSTALYGES DL Western Blotting vs Hmotnostní spektrometrie jistota identifikace ~ citlivost instrumentální náročnost CG010 15 CG010 MW(adukt) = 250 Počet navázaných aduktů N = 12 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 m/z 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 a.i. /D=/Data/Zbynek/020205/BSA/2Lin/pdata/1 Administrator Fri Feb 22 13:59:04 2002 mass diff. cca 3 kDa MW(adukt) = 250 Počet navázaných aduktů N = 12 Kontrola výsledku reakce 16 CG010 vzorek extrakce peptidů/proteinů MALDI MS (3 – 20 kDa) PCA analýza databáze MALDI MS profilů BD18215_ MALDI-MS profilování * identifikace mikroorganizmů * třídění vzorků (kontrola kvality potravin) * diagnostika chorob 17 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. Alcaligenes faecalis Sphingomonas paucimobilis Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS CG010 18 CG010 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Acinetobacter nosocomialis NIPH 106 Acinetobacter nosocomialis NIPH 97 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2134 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2812 Acinetobacter nosocomialis NIPH 386 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2265 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2120 Acinetobacter nosocomialis NIPH 12 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2119T Acinetobacter nosocomialis NIPH 523 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2249 Acinetobacter pitii NIPH 14 Acinetobacter pitii NIPH 95 Acinetobacter pitii NIPH 336 Acinetobacter pitii NIPH 2256 Acinetobacter pitii NIPH 519T Acinetobacter pitii NIPH 76 Acinetobacter pitii NIPH 3678 Acinetobacter pitii NIPH 3870 Acinetobacter pitii NIPH 2133 Acinetobacter pitii NIPH 2258 Acinetobacter pitii NIPH 789 Acinetobacter baumannii NIPH 501T II Acinetobacter baumannii NIPH 501T III Acinetobacter baumannii NIPH 146 Acinetobacter baumannii NIPH 601 Acinetobacter baumannii NIPH 80 Acinetobacter baumannii NIPH 190 Acinetobacter baumannii NIPH 67 Acinetobacter baumannii NIPH 1669 Acinetobacter baumannii NIPH 70 Acinetobacter baumannii NIPH 2264 Acinetobacter baumannii NIPH 410 Acinetobacter baumannii NIPH 615 Acinetobacter baumannii NIPH 527 Acinetobacter baumannii NIPH 528 Acinetobacter baumannii NIPH 501T I Acinetobacter baumannii NIPH 1734 Acinetobacter baumannii NIPH 201 Acinetobacter baumannii NIPH 329 Acinetobacter baumannii NIPH 335 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 13 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2253 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2254 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2706 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2814 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2262 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3680 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3804 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2155 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2245T Distance Level 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Acinetobacter nosocomialis NIPH 106 Acinetobacter nosocomialis NIPH 97 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2134 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2812 Acinetobacter nosocomialis NIPH 386 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2265 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2120 Acinetobacter nosocomialis NIPH 12 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2119T Acinetobacter nosocomialis NIPH 523 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2249 Acinetobacter pitii NIPH 14 Acinetobacter pitii NIPH 95 Acinetobacter pitii NIPH 336 Acinetobacter pitii NIPH 2256 Acinetobacter pitii NIPH 519T Acinetobacter pitii NIPH 76 Acinetobacter pitii NIPH 3678 Acinetobacter pitii NIPH 3870 Acinetobacter pitii NIPH 2133 Acinetobacter pitii NIPH 2258 Acinetobacter pitii NIPH 789 Acinetobacter baumannii NIPH 501T II Acinetobacter baumannii NIPH 501T III Acinetobacter baumannii NIPH 146 Acinetobacter baumannii NIPH 601 Acinetobacter baumannii NIPH 80 Acinetobacter baumannii NIPH 190 Acinetobacter baumannii NIPH 67 Acinetobacter baumannii NIPH 1669 Acinetobacter baumannii NIPH 70 Acinetobacter baumannii NIPH 2264 Acinetobacter baumannii NIPH 410 Acinetobacter baumannii NIPH 615 Acinetobacter baumannii NIPH 527 Acinetobacter baumannii NIPH 528 Acinetobacter baumannii NIPH 501T I Acinetobacter baumannii NIPH 1734 Acinetobacter baumannii NIPH 201 Acinetobacter baumannii NIPH 329 Acinetobacter baumannii NIPH 335 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 13 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2253 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2254 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2706 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2814 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2262 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3680 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3804 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2155 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2245T Distance Level spolehlivá diferenciace na úrovni druhů (u většiny rodů) Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS identifikace na základě srovnání naměřeného profilu s profilem z databáze * uznaná metoda v klinické praxi Šedo O. et al., Syst. Appl. Microbiol., 36 (8), 572– 578 (2013) 19 20 cooperation with prof. Pekar, FS MU MALDI-MS profiling of spider venoms •evolution of food specialisation in spiders •species adaptations •ant-eating spiders Pekár S. et al., J. Anim. Ecol., 81 (4), 838-848 (2012) Bočánek O. et al., Toxicon, 133, 18-25 (2017) Pekár S. et al. Mol. Ecol., 27 (4), 1053-1064 (2018) Z. merlijni CG010 Analýza profilů –včasná detekce chorob (peptide profiling, pattern profiling) BD18215_ MALDI MS, SELDI MS (3 – 20 kDa) klastrová analýza žádná či minimální úprava vzorku (ionex, IMAC, afinitní sorbent) CG010 21 J. LaBaer et al., J. Proteome Res., 4 (4) 1053-1059 (2005). CG010 22 Glycan profiling and structural analysis of glycans •NSCLC - Bronchoalveolar Carcinoma •Bronchoalveolar Adenocarcinoma •Large Cell Carcinoma •0 •1 •2 •3 •4 •4 •x10 •2000 •2500 •3000 •3500 •4000 •m/z •0 •2 •4 •6 •4 •x10 •0 •0.5 •1.0 •1.5 •4 •x10 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •4x • • • • • • • • • • • • • •4x • • • • • • • • • • • • •6x • • • • • • • • • • • • •5x • • • • • • • • • • • • • •5x • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • •6x • • • • • • • • • • • • •4x • • • • • • • • • • • • •5x • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •5x • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •4x • • • • • • • • • • • • • • •3x • • • • • • • • • • • • • • • •4x • • • • • • • • • • • • • • • •5x • • • • • • • • • • • • • • •3x GlcNAc; Fuc Gal; Man; MALDI-TOF-MS spectra of N-glycans after desialylation 23 Lattová E., J. Proteome Res., 15 (8), 2777-2786 (2016) Využití MS pro vyhledávání biomarkerů Pattern profiling přímá MS analýza vzorků (MALDI MS, SELDI MS) srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného (bez identifikace, statistická analýza) včasná diagnostika chorob Identifikace biomarkerů Separace GE. LC srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného (analýza obrazu) MS MS/MS identifikace rozdílových proteinů specifická protilátka Imunodetekce MS/Protein arrays CG010 24 CG010 > Snímek27 • https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRScQs6mUqMmXlk5Ta3Bs2Xmj6fXfPwEPODoIEj-pnF0kF KWqdrsg 25 Proteomické aplikace využívající „pouze“ identifikace proteinů CG010 26 izolace proteinů proteinový extrakt (proteolytické štěpení) vícerozměrná frakcionace/separace gelová elektroforéza, kapalinová chromatografie kombinace separačních principů proteinové (peptidové) frakce MALDI-MS/MS LC-ESI-MS/MS identifikované proteiny Obecné schéma proteomického experimentu Analýza komplexních směsí CG010 zachování stavu vzorku zjednodušení komplexní směsi před vlastní detekcí 27 CG010 Separace proteinových izolátů na úrovni intaktních proteinů •Peptidy •HPLC - UV •Protein fraction •collection 1D (2D) gelová elektroforéza IEF (in-solution, in-gel) •Peptidy •Peptidy •Proteinové frakce in-solution digestion in-gel digestion jednotlivých bendů in-solution/ in-gel digestion 28 Separace proteinových izolátů na úrovni peptidů CG010 •Protein mixture •In-solution • digestion •Peptides •1D (2D) HPLC – on-line/off-line •IEF frakcionace •LC-MALDI vždy MS/MS analýza shotgun proteomics MuDPIT (Multi-Dimensional Protein Identification Technology) 29 CG010 Charakterizace proteomu Eyer L. et al.,Proteomics, 7 (1), 64-72 (2007) proteom stafylokokového fága 812, spolupráce s prof. Doškářem (ÚEB PřF MU) identifikace proteinů ve spotech, MS/MS techniky fag 812-Ag 2006-08-18 30 •A draft map of the human proteome • Min-Sik Kim et al., Nature 509, 575-581 doi:10.1038/nature13302 •293 000 non redundant peptides •corresponding to proteins encoded by 17294 genes CG010 31 8M slina pH3,9-5,1 13-2-09 CG010 Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů Obp3A Obp3B Obp2 Myodes glareolus * sliny * 2D gelová elektroforéza * MS/MS vybraných spotů Stopková R., Zdráhal Z., Ryba Š. et al, BMC Genomics 2010, 11:45 spolupráce s PřF UK Praha * není znám genom * nejsou protilátky 32 m/z 3079.4 DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR MALDI-MS/MS původní sekvence - QAELEGKWVTTAIAADNIDTIEEEGPMR (OBP3) DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR HAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů MALDI-MS/MS a LC-MS/MS manuální interpretace spekter CG010 33 * > 80% proteinů je funkčních až po začlenění do komplexu * ~ 10000 typů interakcí Aloy P., Russell R. B.: Nat. Biotechnol. 22 (10), 1317-1321 (2004) Charakterizace proteinových komplexů funkční proteomika purifikace komplexu vzorek (buněčná kultura) MS/MS analýza validace interakcí * vyhledávání nových interakcí * možnost studia „celého“ komplexu CG010 34 T. Köcher, G. Superti-Furga: Nat. Methods, 4(10), 807-815 (2007). Purifikace proteinových komplexů in vivo exprese proteinu se značkou vysoký stupeň čistoty komplexu ztráta slabě vázaných členů komplexu CG010 35 Gavin A.-C. et al.: Nature, 440, 631-636 (2006). • identifikace jednotlivých členů komplexu včetně posttranslačních modifikací • validace interakčních partnerů (odlišení nespecifických interakcí) • určení poměrů jednotlivých členů komplexu (stechiometrie) • určení prostorové struktury komplexu (cross-linking) Možnosti MS v analýze komplexů: CG010 36 > Snímek13 • https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRP_qhRoMQTDXD_QaxmH5Ag8-sHdiXCMwjor2j8CFvPxPM e5UFS 37 Charakterizace posttranslačních modifikací 38 ...Post-translational modifications (PTMs) occur on nearly all proteins. Many domains within proteins are modified on multiple amino acid sidechains by diverse enzymes to create a myriad of possible protein species. How these combinations of PTMs lead to distinct biological outcomes is only beginning to be understood... A. P. Lothrop, M. P. Torres, S. M. Fuchs, FEBS Letters. 587 (2013) 1247–1257 počet druhů PTMs > 400 počet PTMs ≈ 90 000 (experimentálne identifikovaných) ≈ 230 000 (predikce) (SwissProt, per ≈ 530 000 proteinů) G. A. Khoury et al., Sci. Rep. 1, 90; (2011); http://selene.princeton.edu/PTMCuration ...PTMs are known to act alone and in combination to regulate nearly all aspects of protein function... Proč? CG010 39 The panels show the phenotypic phosphoproteome comparison organized by GO biological process for mitotic (left) and S phase (right) cells. Proteins involved in metabolic processes have high-occupancy phosphorylation sites during mitosis, but low-occupancy sites during S phase (color scale: yellow, high overrepresentation; dark blue, high underrepresentation). Olsen J.V. et al., Sci. Signal., 3 (104) ra3 (2010) * * quantified 6027 proteins * quantified 20,443 unique phosphorylation sites Analýza fosfoproteomu změny během buněčného cyklu CG010 - HELA buňky - SILAC značení - TiO2 frakcionace - LC-MS/MS (Orbitrap) 40 35000 40000 45000 50000 m/z 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Daver = 1.2 kDa MALDI-MS celých proteinů CG010 41 P5_all_zz MALDI-MS tryptických digestů * rozdílový peptid * stejný protein CG010 42 2900 3100 3300 3500 3700 3900 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci PNGase A peptid 3966 zmizel objevil se peptid 2797, vedle peptidu 2795 * N-glykosylace * Daver = 1169 Da CG010 43 2770 2790 2810 m/z 100 150 200 250 300 350 400 450 500 a.i. Detail spekter digestů proteinu před a po deglykosylaci CG010 44 tryptický peptid 2796 Da …PHIFDYSGS… , kde D vzniká z N po deglykosylaci PNGasou A původní sekvence je tedy …PHIFNYSGS… (hmotnost 2795 Da) Peptid potvrzen také LC-MS/MS analýzou (v glykosylovaném vzorku digestu nebyl nalezen) Hmotnost glykanu 1170 Da odpovídá xylose+fucose+3*mannose+2*N-acetylglukosamin Nebyl dále potvrzen MS/MS technikami Shrnutí výsledků CG010 45 > Snímek20 • http://g.denik.cz/20/6f/2913579_hrad_okor_denik-380.jpg 46 Proteomické aplikace - kvantitativní studie 47 CG010 B Charakterizace změn proteomu diferenční proteomika P. Bouchal et al., Proteomics 2006, 6, 4278–4285. Acidithiobacilus ferrooxidans grown on ferrous iron (A) and elemental sulfur (B) analýza obrazu 2-D gelů LC-MS/MS vybraných spotů s rozdílnou intenzitou 48 CG010 relativní kvantifikace Obecné schéma proteomického experimentu Analýza komplexních směsí s cílem kvantifikovat jednotlivé komponenty pomocí izotopicky odlišných značek Vzorek A Vzorek B extrakt A společné proteolytické štěpení MS or MS/MS analýza izolace proteinů extrakt B SILAC ICAT, iTRAQ, ICPL, ... (separace) (separace) Vzorek A Vzorek B extrakt A proteolytické štěpení MS or MS/MS analýza izolace proteinů extrakt B směs peptidů směs peptidů iTRAQ TMT (separace) kvantifikace bez použití izotopicky odlišných značek „label free“ metody statistické zpracování naměřených MS nebo MS/MS dat počet vzorků bez omezení není třeba žádné derivatizační reakce menší přesnost 49 Charakterizace markerových proteinů u kuřat infikovaných salmonelou relativní kvantifikace CG010 kontrola po infekci vzorky stěny střeva proteinové izoláty digesce trypsinem reduktivní alkylace LC-MS/MS data processing 50 * identifikováno více než 2300 proteinů * kvantifikační údaj pro více než 1900 Accession Description 363741657 PREDICTED: syntenin-2-like [Gallus gallus] 41.032 118095649 PREDICTED: beta-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase 3 [Gallus gallus] 34.036 4927286 alpha enolase [Bos taurus] 33.575 112491068 Chain A, Crystal Structure Of A M-Loop Deletion Variant Of Ment In The Cleaved Conformation 30.221 56118294 ribonuclease homolog precursor [Gallus gallus] 25.497 363741459 PREDICTED: protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E [Gallus gallus] 24.786 CG010 ověřění pomocí real-time PCR objasnění molekulárních mechanizmů nalezení markerových proteinů pro časnou diagnostiku infikovaný/ kontrola •spolupráce s VÚVel Brno •Matulova M. et al., Vet. Res., 44:37 (2013) 51 Deep proteome coverage obtaining maximum information about proteome Direct analysis of complex protein mixture (tryptic digest) by LC-MS/MS 2000-5000 protein identifications Cells contain ~ 8 000 – 10 000 proteins Reasons •Wide dynamic concentration range •Time limitation of mass spectrometers (not enough time to measure all peptides eluting simultaneously from column) Solution To simplify the complex sample prior LC-MS/MS analysis by fractionation •organelle level •protein level •peptide level • •instrumentally (e.g. repeated analyses of the same sample with exclusion of already identified peptides, scheduled precursor list (SPL)) 52 Experimental design FASP reversed phase pH 10 . . . Data processing LC-MS/MS (Orbitrap Elite) RP - pH 3 Lysis SDT buffer [SDS+DTT+Tris] Data processing w/o and with SPL LC-MS/MS (Orbitrap Elite) Vita Bryja`s lab SPL – „scheduled precursor list“ analysis enables repeated analysis of sample with exclusion of already identified peptides in previous analysis 2-D LC-MS/MS off-line 53 Charakterizace proteomu a fosfoproteomu buněčné linie HEK293 lyze SDT pufr [SDS+DTT+Tris] HEK293 54 TiO2 frakcionace analýza fosfofrakcí LC-MS/MS (Orbitrap Elite) zpracování dat reverzní fáze pH 10 1D LC separace zpracování dat analýza frakcí LC-MS/MS (Orbitrap Elite) FASP TMT značení spolupráce s doc. V. Bryjou, PřF MU Wnt3a aktivace WT vs DVL KO 2 replikáty •10 000 proteinů •30 000 fosfopeptidů • •~100 změn na proteinové úrovni •~250 změněných fosforylovaných míst dosud nepublikováno 2-D LC-MS/MS off-line Data processing w/o and with SPL LC-MS/MS (Orbitrap Elite) SPL – „scheduled precursor list“ analysis enables repeated analysis of sample with exclusion of already identified peptides in previous analysis 55 • 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 High pH fractionation of whole proteome digest (1th D) 2-D LC-MS/MS off-line 56 17931 20395 86212 95781 Number of identified peptides Number of identified proteins 9013 3398 3098 5474 5140 1317 1126 8560 Fractionation three fold increase in number of identified proteins Higher sequence coverage for most proteins Cílená MS/MS analýza vybraných proteinů relativní /absolutní kvantifikace multiple reaction monitoring (MRM) CG010 vysoká citlivost screening – výběr kandidátního proteinu příprava metody (výběr MRM přechodů – peptid + vybraný fragment) •Protein mixture •In-solution • digestion •Peptides LC-MS/MS – MRM mode vlastní analýza a zpracování dat http://www.srmatlas.org 57 Kvantifikace enterotoxinů cílená analýza vybraného proteinu MRM * výběr peptidů vhodných pro kvantifikaci * absolutní kvantifikace pomocí AQUA peptidů výsledek - zjištěné množtví/koncentrace daného proteinu ve vzorku CG010 58 •SWATH MS •Q-TOF, MS/MS < 10 ppm •Retention time •m/z * klasické DB prohledávání nelze * srovnání s knihovnami ref. MS/MS spekter * Relativní i absolutní kvantifikace •celé MS/MS spektrum •Gillet et al, MCP, 11, 1-17 (2012) DIA – data independent acquisition 59 •základní předpoklad úspěchu – správná příprava vzorku •zachování původního proteinového složení •zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz) •odstranění kontaminant rušících koncovou MS analýzu •... CG010 Proces přípravy proteomických vzorků je složen z mnoha procedur, v každém z nich hrozí ztráta vzorku či jeho ovlivnění 60 _______7 a to je konec 61