Pírku lá rní dichroismus (CD) a CD spektroskopie Daniel Renčiuk BFU AV ČR, v.v.i. MU Brno 23.10.2018 Cirkulární dichroismus (CD) Rozdíl v absorpci levotočivě a pravotočivé kruhově polarizovaného světla molekulou • nutné podmínky: molekula je chirální, tedy i opticky aktivní a navíc absorbuje v dané oblasti měření - CD jen v oblasti kde molekula absorbuje • obvykle míněn elektronický CD, tj. v oblasti energií elektronových přechodů • obvykle měřeno celé spektrum v oblasti UV popř. VIS - CD spektroskopie CD je citlivé k vzájemné orientaci jednotlivých komponent (nukleobází, AMK -reprezentovaných tranzitními dipóly) v molekule - sekundární struktura • optická aktivita = schopnost molekuly reagovat rozdílně s vlevo a vpravo kruhově polarizovaným zářením • Optická rotační disperze (ORD) - stáčení roviny lineárně polarizovaného světla při průchodu opticky aktivní látkou - ORD v celém rozsahu vlnových délek - horší interpretace • Cottonův efekt - CD / ORD pás - pozitivní x negativní yyeffMumi^M3Bs (cd) - dna / rna VZÁJEMNÁ ORIENTACE BAZÍ 3 Elektrický dipólový přechodový moment Rozložení elektronové hustoty v základním stavu x v excitovaném stavu odlišné - směr a velikost posunu el. hustoty je charakterizován Elektrickým dipólovým přechodovým momentem - u, - velikost ~ množství absorbovaného světla směr ~ polarizace světla nutná pro maximální A Aměřená = Anukieosidů + vliv Jejich „interakce" V CD podstatně zvýrazněn vliv „interakce" íso íao řOO žao i<0 ?50 tV> W 11111 ,„ h« ™ 275 nm 248, 199 nm Adenine 265 nm i 177 rm o' / 2« 1S H Guanine ISO ZflQ Z?D Z« ZGD ZBO 300 Wavelength (nm) i'ŕu ifc í« ;?o ;ia aa na Wavelength (nm) Thymine Cytoslne Polarizace světla Linearly polarized light Right circularly polarized light Wave representation linear representation x Figure 6-10 Representations of different types of polarized light by an oscillating vector. Trie tip of the vector indicates the magnitude and direction of the electric field of the light as a function of time and space. On the left is shown linearly polarized light propagating in the Z direction. The polarization is along : the x axis (a), the v axis (b), 45° from the .t axis (x), and 30" from the x axis (d). On the right is shown right circularly polarized light propagating in the z direction. Panels (a) and ib) illustrate that circularly polarized light can be considered as a sum of two perpendicular vectors oscillating 90° out of phase. The resulting lip of the electric vector of the light produces a circle as seen by an observer moving with the light (c); it produces a helix as seen by a stationary observer (d). [Reprinted with permission from Kttger el. al., 1990. This figure is from Figures 2-2 and 2-3.) Andras Szilagyi - h 6 Cirkulární dichroismus (CD) • Rozdíl absorpce levotočivě a pravotočivé kruhově polarizovaného světla: AA = AL-A • Pokud známe koncentrace As = el - er = AA / Ic (Lambert-Beerův zákon) • Popřípadě, úhel stočení polarizovaného světla = elipticita tg [9] = (EL - ER) / (EL + ER) = 3298 * As — ER+EL Cirkulární dichroismus (CD) • Rozdíl absorpce levotočivě a pravotočivé kruhově polarizovaného světla: AA = AL-A • Pokud známe koncentrace As = el - er = AA / Ic (Lambert-Beerův zákon) • Popřípadě, úhel stočení polarizovaného světla = elipticita tg [9] = (EL - ER) / (EL + ER) = 3298 * As — ER+EL Optická rotace - optická rotační disperze (ORD) • Rozdílná rychlost průchodu L-CPL a R-CPL opticky aktivním prostředím: nL o nR • Dojde ke stočení roviny polarizace procházejícího světla - optická rotace - úhel a • Závislost optické rotace (a) na vlnové délce (A) světla - optická rotační disperze (ORD) • Téměř identická informace jako CD, avšak obtížněji interpretovatelná • ORD existuje při všech vlnových délkách, v místě absorpce anomální - Cottonův efekt A vs ORD vs CD Mimochodem, CD je ideální a velmi používaná metoda pro rozlišení enantiomerů malých molekul, např. léčiv. MJínaozeDaDaajíBiD sbd 230 MO 200 2Ů0 300 320 3* 393 330 (1 S)-{+)-Camphor-10-sulphoníc acid [1 R)-(-)-Carnprior-lO-sulphonic acid Výhody a nevýhody CD Citlivost - nízká koncentrace studovaných látek (DNA 20nt od cca 1 u.M x 50 u.M ID NMR x 1 mM 2D NMR/ X-ray) a široký rozsah koncentrací (DNA - 4 řády dle optické dráhy kyvety) - rozpustnost, cena materiálu atp. Snadná titrace a změny podmínek přímo v kyvetě během jednoho experimentu -koncentrace iontů, ligandů atpv změny pH - výhoda především ve srovnání s metodami strukturní analýzy (NMR, X-ray) Rozlišení kooperativních a nekooperativních změn Chybí explicitní vztah mezi CD a strukturou (vypočtená CD neodpovídají měřeným) Jednoduše nerozlišuje molekularitu konformací-nutná komplementární metoda (elektroforéza,...) Měření v roztoku tj. směs (v prostoru i čase) x výsledky single-molecule metod (smFRET) Kooperativita přechodu NEKOOPERATIVNÍ KOOPERATIVNÍ ZMĚNY ZMĚNY Výhody a nevýhody CD Citlivost - nízká koncentrace studovaných látek (DNA 20nt od cca 1 u.M x 50 u.M ID NMR x 1 mM 2D NMR/ X-ray) a široký rozsah koncentrací (DNA - 4 řády dle optické dráhy kyvety) - rozpustnost, cena materiálu atp. Snadná titrace a změny podmínek přímo v kyvetě během jednoho experimentu -koncentrace iontů, ligandů atp., změny pH - výhoda především ve srovnání s metodami strukturní analýzy (NMR, X-ray) Rozlišení kooperativních a nekooperativních změn Chybí explicitní vztah mezi CD a strukturou (vypočtená CD neodpovídají měřeným) Jednoduše nerozlišuje molekularitu konformací-nutná komplementární metoda (elektroforéza,...) Měření v roztoku tj. směs (v prostoru i čase) x výsledky single-molecule metod (smFRET) c -JO _cu 0 £ 1 (TJ i_ +-> .cu l£5 cu I o c o Paralelní kvadruplex Molekularita — Oct-22mer 220 260 300 X [nm] Dvoušroubovice (TJ C CU l/l ^(TJ -± CU U Q. ro -g c o < -c (CGG)8 (CGG)7 i r~ 220 260 300 X [nm] 15 Výhody a nevýhody CD Citlivost - nízká koncentrace studovaných látek (DNA 20nt od cca 1 u.M x 50 u.M ID NMR x 1 mM 2D NMR/ X-ray) a široký rozsah koncentrací (DNA - 4 řády dle optické dráhy kyvety) - rozpustnost, cena materiálu atp. Snadná titrace a změny podmínek přímo v kyvetě během jednoho experimentu -koncentrace iontů, ligandů atp., změny pH - výhoda především ve srovnání s metodami strukturní analýzy (NMR, X-ray) Rozlišení kooperativních a nekooperativních změn Chybí explicitní vztah mezi CD a strukturou (vypočtená CD neodpovídají měřeným) Jednoduše nerozlišuje molekularitu konformací-nutná komplementární metoda (elektroforéza,...) Měření v roztoku tj. směs (v prostoru i čase) x výsledky single-molecule metod (smFRET) CD spektrofotometr (Jacso J-815) i Uspořádání monochromátoru a optiky zajišťuje jednak výběr vlnové délky, jednak lineární polarizaci světla / Fotoelastický modulátor - piezokrystal -způsobuje střídavě + a - fázový posun mezi složkami lineárně polarizovaného světla í Fotonásobič - synchronizován s frekvencí 150 2O0 250 3O0 350 40 na modulátoru - rozlišení L a R Wavelerij polarizovaného světla I4J mi ijlJBlty Variabilní optická dráha umožňuje široké rozmezí měřených koncentrací látek. (Snížení vlivu absorpce pufru, srovnání podmínek s NMR experimenty,...) B-DNA - primární sekvence oly[d(G)].poly[d(C)] poly[d(AT)] _° O Sarcina Lutea - 71 % GC | calf thymus - 42 % GC < Bacillus Cereus - 33 % GC 270 300 [nm] B-A přechod 10 -i \ Kypr et al., 2009, Nucleic Acids Res Vorlíčková et al., 2012, Methods Vorlíčková et al., 2012, Chirality 0 - o co < -5 - 10 - 15 heteroduplex d(GCGGGCGACTGGTGAGTACGC 220 260 300 wavelength [nm] wavelength [nm] (GAC)4 o o - g o Š 3 g 3 § I s s o < o o 3 200 240 280 240 280 wavelength [nm] 240 280 240 280 320 Vorlíčkové M. et al., 2001, Eur Biophys J A-vlásenka (nízká iontová síla) B - paralelní duplex (protonace - nízké pH) C - antiparalelní duplex (vyšší iontová síla) D - Z-forma (velmi vysoká iontová síla) 22 ' ^ jJ^LUMtJiplex wavelength [nm] CD spektroskopie jako první předpověděla monomolekulární paralelní kvadruplex. Guaninový kvadruplex Antiparalelní - GGGGTT- Paralelní - TGGGGT 16 mM K+- 0' 16 mM K+- 10' 16 mM K+- 210' 16 mM K+- 24 h 20 15 10 - 200 240 280 320 -10 200 1 mM Na+ 10 mM Na+ 100 mM Na+ 500 mM Na+ 240 280 320 wavelength [nm] wavelength [nm] Guaninové kvadruplexy GGGNnGGGNnGGGNnGGG • regulace genové exprese • struktura telomer promoter gene transcriptional activation ] i ■ altered transcription (Huppert J.L., Chem Soc Rev, 2008) (Biffi G., et al., Nat Chem, 2013) (Brooks T. A., et al., FEBS J, 2010) Regions 25,747 13.909 28,239 26,321 24.963 21.838 20,613 20,882 SUľVeyed l*TSS .Poly-A ^7p (Maizels N. and Gray L.T., PloS Genet., 2013) Guaninový kvadruplex CD spektra je možné jednoduše numericky sčítat atp. - součet CD měřených nezávisle x směs x komplex • efekt vzájemného ovlivnění více struktur/oblastí v rámci molekuly Kvadruplex lidské telomerní DNA 220 260 300 wavelength [nm] Renčiuk et al., 2009, Nucleic Acids Res ^jgSgégí DNA Kvadruplex - G3T2G3T2G3T2G3 v K+ - různé koncentrace DNA 6 220 240 260 280 300 wavelength [nm] 320 CD 260 nm CD 290 nm A 297 nm 60 80 temperature [°C] 60 80 temperature [°C] 29 Tvorba kvadruplexu - detekce CD / stopped-flow 0 1 2 3 4 5 220 260 300 t [s] X [nm] 30 Cytosinový l-motiv H / R ,0..........H-N H 220 260 300 wavelength [nm] Lineární dichroismus (LD) Rozdíl v absorpci světla lineárně polarizovaného rovnoběžně a kolmo na orientaci molekuly • nutné podmínky: molekuly jsou orientované a navíc absorbuje v dané oblasti měření • orientace molekul: gel, elektrické pole, proud nebo rotace kapaliny • měří se jak v oblasti elektronových přechodů (UV / VIS), tak vibračních přechodů (IR) LD je citlivé k orientaci jednotlivých komponent vůči směru orientace molekul - např. inklinace bazí v DNA (úhel mezi osou dvojšroubovice a normálou roviny báze) polarized light molecules absorb light resulting LD spetf rum o vAAA propagation direction 230 260 230 320 wavelength / n m Bulheller et al., 2007, Phys Chem Chem Phys Rodger et al., 2006, Phys Chem Chem Phys Helix Axis Base Normal Inclination Axis LD DNA + ligand -0.07 400 450 500 Wavelength (nrn) 550 T 600 Bffl I -0.04 g -0.05 -0.06 -0,07 300 350 400 Wavelength (nm) Curnenl Opinion in Structural Biology LD of DNA and DNA-ligand systems, (a) LD of calf thymus DNA (1000 u.M base, dashed line) and the DNA plus an ethidium bromide intercalator (50 u.M, solid line), (b) LD of calf thymus DNA (1000 u.M base, dashed line) and the DNA plus a minor groove binder (diaminophenyl indole, 50 u.M, solid line) Dafforn et al., 2004, Curr Opin Struct Biol LOSCHMIDT LABORATORIES SPEKTROSKOPI E Cl RKULÁRNÍ HO DICHROISMU PROTEINŮ RADKA CHALOUPKOVÁ Loschmidtovy laboratoře Ústav experimentální biologie Masarykova Universita, Brno 1/39 Osnova □ struktura proteinů □ analýza sekundární s terciární struktury protei □ chiroptické techniky □ spektroskopie cirkulárního dichroismu - fyzikální podstata - spektra cirkulárního dichroismu proteinů - príprava vzorku proteinu pro mereni - příklady využití - výhody a limitace Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 2/39 Struktura proteinů ft TACCVACiGYKKrnQLIQVH o ^ VKCSTVQLnnAMQASLnMLr %LArLDVTGniAQTLLHLAKQb ,VtQGICQnTIKIQMGDPIITM*fr^ *CSnCTVGniLKMLCDQN CT Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 3/39 Analýza struktury proteinů □ spektroskopie cirkulárního dichroismu □ infračervená spektroskopie □ Ramanova spektroskopie □ fluorescenční spektroskopie □ NMR spektroskopie □ rentgenová krystalografie □ neutronová krystalografie Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 4/39 Chiroptické techniky Metoda Definice Vlnové délky Optická rotační Závislost úhlu stočení roviny lineárně 180-800 nm disperse ORD polarizovaného světla na vlnové délce procházejícího záření. Cirkulární dichroismus CD Závislost rozdílu absorbance pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření. 180-1000 nm Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 5/39 Chirální molekuly □ neztotožnitelné se svým zrcadlovým obrazem □ příčiny chirality - přítomnost stereogenního centra - vnitřní chiralita - kovalentní interakce achirální molekuly s chirální molekulou - inherentní chiralita struktury celé molekuly Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 6/39 Lineárně polarizované světlo □ konstantní směr (orientace), modulovaná amplituda □ úsečka o délce 2Amov Kruhově polarizované světlo □ konstantní amplituda, modulovaná orientace □ kruh s průměrem 2Amax Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 8/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 9/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 10/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 11/39 □ lineárně polarizovaný paprsek je vektorovým součtem dvou opačných kruhově polarizovaných paprsků (R a L) □ při průchodu opticky aktivním chromoforem jsou R a L paprsky rozdílně absorbovány □ výsledné záření je elipticky polarizované Equal proportions of right and left circular polarizations Right polarization preferentially absorbed Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 13/39 Jednotky cirkulárního dichroismu □ CD data prezentována elipticitou nebo absorbancí □ CD data normalizována na molární koncentraci chromoforu a počet opakujících se jednotek (peptidová vazba) Název Symbol Definice Jednotka rozdíl molárních extinčních koeficientů elipticita molární elipticita A£ A£* = £L - £R = LA IvV.crrr1 e obs tan 6>obs = - = b _EL-ER a EL + Efí e m = (c9obs.100) cl deg deg.cm2.dmoľ1 molární reziduálni elipticita e mre (0obs.M^AOO) deg.cm2.dmo MRE , a n.c.l -1 Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 14/39 Proteinové chromofory □ daleká UV oblast 180-250 nm chromoforem je peptidová vazba infromace o sekundární struktuře proteinu □ blízká UV oblast 260-320 nm chromofory jsou aromatické aminokyseliny a disulfidické můstky informace o průměrných změnách v terciální struktuře proteinů Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 15/39 Daleká UV oblast 190 200 210 220 230 240 vlnová délka (nm) Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 16/39 Blízká UV oblast 40000 20000 - 10000 z 5000: 2000- T—1 1 E 1000 = u — T—1 1 Z 500 E s—' - co 200 - 100 z 50 ! 20- 10- i-1-1 r 200 220 240 260 280 vlnová délka (nm) 300 Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 17/39 Příprava vzorků pro CD měření □ vysoká čistota - 95% (kontrola na SDS gelu) □ homogenní vzorek bez proteinových agregátů (filtrace proteinu) □ odstranění oligonukleotidových fragmentů (přídavek nukleasy před purifikací proteinu) □ odstranění imidazolu/NaCI po purifikací (dialýza, gelová filtrace) □ odstranění stabilizačních látek (EDTA, dithiotheitol) □ volba vhodného pufru pro měření v daleké UV oblasti □ množství proteinu pro měření v daleké UV oblasti 50-500 pg Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 18/39 Volba pufru pro CD měření Složka pufru Nulová Absorbance (10 mM roztok v 0.1 cm kyvetě) absorbance - nad: 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm NaCI 205 nm 0 0.02 > 0.5 > 0.5 NaR KF 170 nm 0 0 0 0 NaCI04 170 nm 0 0 0 0 Na2HP04 210 nm 0 0.05 0.3 > 0.5 NaH2P04 195 nm 0 0 0.01 0.15 NaOH 230 nm > 0.5 > 2 > 2 > 2 Boric acid 180 nm 0 0 0 0 Borate/Na+ (pH 9) 200 nm 0 0 0.09 0.3 Glycine 220 nm 0.03 0.1 > 0.5 > 0.5 Tris/H2S04(pH 8) 220 nm 0.02 0.13 0.24 > 0.5 Acetate/Na+ 220 nm 0.03 0.17 > 0.5 > 0.5 Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 19/39 Využití CD spektroskopie □ analýza sekundární struktury proteinů □ sledování konformačních změn - teplotní a pH stabilita, stabilita vůči denaturačním činidlům - porovnání struktury mutantních variant s divokým typem - vliv aditiv (solventy, soli) na strukturu a stabilitu proteinů □ kinetika „foldingu" a „refodingu" proteinů □ design nových peptidů a proteinů □ studium protein-ligandových interakcí, design léčiv (inhibitorů) □ studium protein-proteinových a protein-DNA interakcí Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 20/39 Příklady využití CD spektroskopi -8 H-1-1-1-1-r~ 180 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Analýza sekundární struktury 21/39 Příklady využití CD spektroskopi Home Input Data User Guide Background Information FAQ References Links Contact Us Terms and Conditions On-line analysis for protein Circular Dichroism spectra Apply for a user-account Analyse data (registered users only) Citing DichroWeb: If you use DichroWeb for your analysis you agree to cite the publications detailing the original methods and reference data used, as well as one of the specific DichroWeb papers: Whitmore, L. and Wallace, B.A. (2008) Biopolymers 89: 392400. (PDF) Whitmore, L. and Wallace, B.A. (2004) Nucleic Acids Research 32: W668-673. (PDF) DichroWeb News Analyses now possible using Membrane Protein data set SMP180. Abdul-Gader A, Miles AJ, Wallace BA. Biomformatics (2011) 27 1630-6. Video guide for Cleaning and Loading Circular Dichroism Cells Related Projects 2Struc: The Secondary Structure Server and the Protein Circular Dichroism Data Bank are now open for use. DichroWeb currently has 3600+ registered users and has performed over 375,000 deconvolutions. DichroWeb is produced by Dr. L. Whitmore, in the lab of Professor B.A. Wallace at the Department of Crystallography, Institute of Structural and Molecular Biology, Birkbeck College, Unversity of London, UK. © 2012. We are supported by a grant from the BBSRC. Analýza sekundární struktury 22/39 Příklady využití CD spektroskopi Protein a-helix(%) ß-list (%) smyčky(%) nepravidelná (%) DbeA 49 13 11 27 DbjA 48 13 10 29 DhaA 39 16 16 39 LinB 40 14 15 31 DmbA 42 15 12 31 DhlA 41 15 14 30 Analýza sekundární struktury 23/39 Příklady využití CD spektroskopi -20 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: pH stabilita 24/39 Příklady využití CD spektroskopi 7 255 275 295 315 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: pH stabilita 25/39 -8 H-1-1-1-1-r- 180 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: wt x mutant 26/39 Příklady využití CD spektroskopi Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 27/39 Příklady využití CD spektroskopi Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 28/39 Příklady využití CD spektroskopi Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 29/39 -12 -I-1-1-1 H-1-1-1 H-1-1-1 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: stabilita v přítomnosti organických rozpouštědel 30/39 12 -I-1-1-1 H-1-1-1 H-1-1-1 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) -12 H-1-1-1 H-1-1-1 H-1-1-1 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) Příklady využití CD spektroskopi Sledování konformačních změn: protein-DNA interakce 33/39 Příklady využití CD spektroskopi 5 190 210 230 250 270 290 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: protein-DNA interakce 34/39 Výhody a limitace CD spektroskopie □ snadnost a rychlost měření □ malé množství a nízká koncentrace vzorku □ nevyžaduje přítomnost značených molekul □ komplementární strukturní informace z různých oblastí spektra □ nedestruktivní technika □ strukturní informace s relativně nízkým rozlišením □ žádná informace o kvartérní struktuře proteinů Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 35/39 Výhody a limitace CD spektroskopie Spektroskopická Požadavky na vzorek Měřící čas Analýza dat Strukturní informace technika c [mg/ml] need daleká-UV CD 0.1-1.0 - 15-50 min 1-2 dny 2D struktura, konformační změny blízká-UV CD 0.5-5.0 - 15-50 min 2-4 hod 3D „otisk prstu" IR, Raman 10-20 2H 10-20 hod 1-2 dny 2D struktura fluorescence 0.005-0.5 - 10-30 min 2-4 hod změny ve 3D NMR 10-40 13Cj 15N 1-3 týdny 2-6 měsícQ 3D atomární úroveň, dynamika rentgenová krystalografie 5-50 krystal 10-30 min měsíce-roky 3D atomární úroveň, statická struktura neutronová krystalografie 5-50 krystal, 2H 1-4 týdny měsíce-roky 3D atomární úroveň, protonové interakce Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 36/39 T Výhody a limitace CD spektroskopi □ CD spektropolarimetr x synchrotron Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů Užitečné reference □ Fasman, G.D. (1996) Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Springer US □ Kelly, S.M. et al. (2005) How to Study Proteins by Circular Dichroism, Biochim. Biophys. Acta 1751: 119-139 □ Harding, S.E., Chowdhry, B.Z. (2001) Protein-Ligand Interactions: Structure and Spectroscopy, Oxford University Press □ DOTAZY? 38/39 LOSCHMIDT LABORATORIES J? m \ ■ i : 1 F