Příprava krevního roztěru Správně Příliš tlustý Moc krve Nerovnoměrný tah Třásla se ruka Krev se srážela Mastné sklíčko Barvení roztěrů  Standardním barvením pro krevní nátěry je tzv. panoptické barvení dle Pappenheima.  Postup barvení: 1. Celý nátěr na 3 minuty pokryjeme May-Grünwaldovým barvivem. 2. Opatrně přikapáváme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo nesmylo. Cílem je nechat působit takto naředěné barvivo (1:1) další 1 minutu. 3. Barvivo slijeme, můžeme opláchnout vodou. 4. Na nátěr naneseme Giemsa-Romanowského barvivo. Toto barvivo musí být před barvením vždy čerstvě naředěné přibližně 1:9 (na 10 ml destilované vody 10 - 15 kapek barviva). Necháme působit přibližně 15 minut (10 - 20 minut). 5. Barvivo slijeme a důkladně opláchneme pod tekoucí vodou. 6. Spodní stranu sklíčka očistíme utěrkou. 7. Je vhodné ihned zkontrolovat probarvenost krevních buněk a eventuelně preparát ještě dobarvit. Barvení pomocí hotových barvicích sad Výhody:  rychlé (cca 1 – 2 min)  roztoky již připraveny  vydrží dlouho (měsíce)  lze skladovat při pokojové teplotě  používají se opakovaně Nevýhody:  Neposkytují tak dobré výsledky jako klasické barvící techniky  Ve výzkumu nebo při hodnocení sporných patologických nálezu je lepší použít klasické techniky, přestože jsou časově náročnější Příklady: barvící sada Leukodif (Pliva Lachema) Diff-Quik ( Medion Diagnostics) Postup barvení : Roztěr musí být suchý 1. Fixační činidlo (metanol) 5 x 1 s 2. Eozin 5 x 1 s 3. Azur 5-6x 1 s 4. Oplach (fosfátový pufr pH 7,4 nebo dest. voda) Nechat zaschnout a pozorovat pod imerzí Mezi jednotlivými kroky neoplachujeme ani nesušíme Vyhodnocování krevního roztěru • Pozorujeme zásadně pod imerzí • Správná oblast pro hodnocení: kde se krvinky příliš nedotýkají • V této oblasti prohlížet preparát při tzv. meandrovitém pohybu (C) • Krevní diferenciál (dif): procentické zastoupení jednotlivých typů leukocytů • Krevní obraz: kompletní hodnocení počtu a morfologie formovaných krevních elementů • Orientační pomůcka: na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů Úkoly:  Připravit cvičný roztěr z myší krve (jeden nebo více)  Obarvit myší roztěr a orientačně prohlédnout – nevyhodnocovat !!!  Vyhodnotit učitelem dodaný roztěr lidské krve: Zakreslit jednotlivé typy krvinek (erytrocyt, trombocyty, 5 typů leukocytů) Vyhodnotit diferenciál (u 50 leukocytů určit typ a vypočíst z toho jejich procentické zastoupení). Srovnat určený diferenciál s fyziologickými hodnotami, které je nutné vyhledat v textu ve složce  V mezičase se seznámit s manipulací s automatickými pipetami Popis formovaných krevních elementů Granulocyty: v cytoplasmě mají granula, jádro bývá segmentované • Neutrofil: velikost 10 – 12 μm, cytoplasma se barví slabě růžově, jádro tmavě modré, segmentované (2 – 7 segmentů) Průměrný počet segmentů se vyjadřuje pomocí Hynkova čísla, které odráží stupeň zralosti neutrofilů. Granula se barví kyselým i zásaditým barvivem a mají proto nevýraznou narůžovělou barvu, jsou velmi malá, sotva rozlišitelná. Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza cizorodých částic a jejich rozklad pomocí lyzosomárních enzymů. • Eozinofil: velikost 12 – 14 μm, jádro ze dvou segmentů (brýlovité), granula větší než u neutrofilů, barví se cihlově červeně. Hlavní funkcí eozinofilů je obrana proti endoparazitům a mohou se účastnit i alergických reakcí • Bazofil: velikost 9 - 11 μm, jádro protáhlé, často esovité, granula tmavě modrá, velká, barví se stejně jako jádro, proto se jeví jakoby jádro překrývala. Bazofily se účastní alergických reakcí. Popis formovaných krevních elementů Agranulocyty: v cytoplasmě nemají granula, jádro není segmentované • Lymfocyt: velikost 6 – 12 μm podle stupně zralost (malé, střední a velké lymfocyty) , jádro okrouhlé hodně tmavé. Při diferenciaci (zrání) buňky přibývá cytoplasmy, jádro je stejné. Granula v cytoplasmě nejsou pouze drobná zrnitost. V roztěru nerozlišíme T a B lymfocyty, vetšina v periferní krvi jsou B lymfocyty. Hlavní funkce T lymfocytů je kooperace s dalšími imunitními buňkami při likvidaci cizorodých látek. Hlavní funkcí B lymfocytů je produkce protilátek.  Monocyt: velikost 14 – 20 μm, kulaté nebo oválně, jádro často ledvinovitého tvaru (záleží na směru pozorování). Chromatin je jemně zrnitý, jádro je vždy světlejší než u lymfocytů. Granula nejsou, cytoplasma se však může jevit jako mírně zrnitá. Hlavní funkcí je fagocytóza cizorodých částic za účelem jejího zpracování a předložení dalším buňkám imunitního systému. Popis formovaných krevních elementů  Erytrocyty: velikost: 7 μm. Savčí erytrocyty jsou bezjaderné, oblast kde jádro před dozráním bylo se jeví jako světlejší disk. Erytrocyty ostatních tříd obratlovců jsou většinou oválné a mají vždy jádro.  Trombocyty: krevní destičky, u savců jsou bezjaderné, jsou to vlastně odškrcené okrsky cytoplasmy z buněk, které se mazývají megakaryocyty a jsou trvale v kostní dřeni. Tyto okrsky cytoplasmy mají velikost asi 3 μm a často v roztěrech vytvářejí shluky. Trombocyty ostatních obratlovců jsou jaderné. Granulocyty neutrofil eozinofil bazofil Agranulocyty lymfocyt monocyt trombocyt erytrocyty Použité zdroje:  Atlas Hematologie zvířat: http://projekty.sosvet.cz/2006_hematologie/index.htm  Tichý a kol: Histologie, VFU Brno, 2000