RNDr. Vendula Pospíchalová, Ph.D. (pospich@sci.muni.cz) Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů Bi5599 Metody aplikované biochemie a buněčné biologie 2019-11-13 Aplikace in vivo modelů savců ve fyziologii Struktura dnešní přednášky 1. Etické a legislativní aspekty práce se zvířaty 2. Využití a výběr vhodného zvířecího modelu 3. Nejčastější (savčí) modely ve fyziologii (biomedicíně) 4. Laboratorní potkan 5. Laboratorní myš 6. Chov laboratorních myší 7. Experimenty s laboratorní myšmi 8. Genetická manipulace laboratorních myší 9. Souhrn a závěr Etické aspekty práce se zvířaty • Práce se zvířaty je výsada/privilegium, rozhodně ne právo 1. Musí být jasný přínos pro společnost, zdravotní či veterinární péči či získání unikátních poznatků, které jinak než za pomoci živých zvířecích modelů získat nelze 2. Je nutné, aby přínos získaných poznatků jednoznačně převážil případný „diskomfort“, bolest či utrpení zvířat během experimentů • Etický kodex: - pokud to lze, mají se použít organismy z co nejnižších pater fylogenetického stromu - raději bakterie než myši, raději myši než primáti - důkladně zvážit počet a zdroj organismů, plánované procedury (minimalizovat bolest a znehybňující prostředky, zajistit vhodnou pooperační péči, právo na euthanasii, …) – součástí projektů pokusů Zásady práce s pokusnými zvířaty „3+1R“ definováno v The Principles of Humane Experimental Technique - W.M.S. Russell and R.L. Burch (1959) • Refinement – zjemnění = dobrá obživa, adekvátní zacházení školenými pracovníky, prostor pro život, pokusy v anestézii • Reduction – zmenšení = počtu zvířat, délky pokusu, pokus se nesmí na stejném zvířeti znovu opakovat • Replacement – nahrazení = pokus se provádí na zvířeti jen tehdy, neznáme-li žádnou alternativu, jinak dáme přednost alternativě (tkáňové kultuře atd.) + Responsibility – zodpovědnost = dodržovat zákony, schválené protokoly a etický kodex • Při nedodržení závažné následky nejen pro jednotlivce, ale i pro skupinu, ústav (univerzitu) a celospolečenské vnímání využití laboratorních zvířat při biomedicínském výzkumu Legislativa upravující podmínky práce s modelovými organismy • Nutno dodržovat evropskou směrnici: DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL on the protection of animals used for scientific purposes“) • https://eur- lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriS erv.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:00 79:en:PDF • http://ec.europa.eu/environment/ch emicals/lab_animals/legislation_en .htm • a české právní normy http://eagri.cz/ public/web/mz e/ochrana- zvirat Legislativa v ČR 1) zákon České národní rady na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 ve znění platných úprav 2) vyhláška Ministerstva zemědělství o ochraně pokusných zvířat č. 419/2012 Sb. (ve znění vyhlášky č. 299/2014 Sb.) Důležité body: • Výzkumné zařízení musí získat akreditaci od Ústřední komise na ochranu zvířat • Každý projekt musí být schválen odbornou komisí daného zařízení a rezortní komisí MZe • § 3 a) zvířetem se rozumí každý živý obratlovec, kromě člověka, nikoliv však plod nebo embryo • Manipulovat s pokusným zvířetem a provádět zákroky vymezené projektem pokusů mohou pouze osoby, které získaly osvědčení o odborné způsobilosti [§ 15d]. „In vivo veritas“ Zvířecí modely ve fyziologii (biomedicíně) Využívají se pro: • základní výzkum mechanizmů onemocnění • vývoj nových terapeutických strategií • vývoj a objev léčiv • předklinické studie • testováni toxicity • vývoj nových zvířecích modelů dle potřeby a zájmu • Jsou intenzívně zkoumané organismy – cílem může být poznání jich samotných, ale především je to popis obecnějších jevů a vztahů platících i pro jiné modely a obzvláště pro člověka Bezobratlí: háďátko (Caenorhabditis elegans) octomilka (Drosophila melanogaster) Obratlovci: drápatka (Xenopus laevis) danio (Danio rerio), zebrafish kur (Gallus gallus domesticus) myš (Mus musculus) potkan (Ratus norvegicus) králík (Oryctolagus cuniculus) + psi, kočky, prasata, primáti Nejčastější modelové organismy ve fyziologii (biomedicíně) http://www.understandinganimalresearch.org.uk/animals/ numbers-animals/#International%20estimates Distribution of animals used in research in UK in 2017 Požadavky na (ideální) modelový organizmus a) biologické • dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách • relativní jednoduchost a nevýjimečnost ve zkoumané oblasti • nekomplikovaný životní cyklus • dostatečně rychlý vývoj • produkce většího množství potomků b) metodické • možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a cílená mutageneze, reverzní genetika) • velikost • dostupnost sekvenčních dat Výběr vhodného modelu ve fyziologii 1) vhodný na sledování zvoleného onemocnění 2) reaguje podobně jako člověk (založené na základě evidence, nebo biologické podobnosti, čím základnejší biologický proces tým vyšší předpoklad, že člověk a zvíře budou reagovat podobně) 3) správný design experimentu (demonstrace odpovědi, vhodná velikost, délka života, adekvátní kontroly, dostatečné množství zvířat - statistické vyhodnocení) 4) mnohé modely jsou vysoko specifické (např. primáti) 5) validace modelu (např. nové léčivo v preklinické studii) Laboratorní potkan (Rattus norvegicus) • větší než myš (více buněk, větší orgány) – výhodné pro operační přístupy (oblíbený GFP transgen pro transplantační imunologii) • Vhodné pro kardiovaskulární choroby, toxikologii, neurologii a behaviorální studie – mnohem více „společenské“ než myši a v chování více podobné člověku (viz outbreding) Example of fluorescence seen in EGFP rat strains. Images of SDTg(GEF)2BalRRRC(RRRC:0065) strain on right of each panel and wild type controls images. Upper images for each panel are under bright light, bottom images for each panel are under fluorescent light. Panel A: kidney; B: eye; http://www.rrrc.us/ Studium autismu pomocí hlodavců • 3 nt inzerce v genu FMR1 (fragile X mental retardation 1) vede k Syndromu fragilního X – jedné z nejčastějších genetických příčin mentálního postižení • Tato inzerce vede k metylaci promotoru genu Fmr1, což má za následek zablokování jeho exprese, čím méně proteinu gen produkuje, tím jsou příznaky onemocnění vážnější • Změny v genu FMR1 jsou jednou z mála známých genetických příčin poruch autistického spektra • Pokud vyřadíme gen Fmr1 u myší, dojde k posílení jejich sociálních interakcí • Pokud vyřadíme gen Fmr1 u potkanů, dojde ke snížení jejich sociálních interakcí a snížení hlasových projevů, což jsou podobné změny chování, jaké vidíme u pacientů s mutacemi v genu FMR1 • Potkani s vyřazeným genem Fmr1 vykazují také kompulzivní žvýkání • Kompulzivní a opakující se vzorce chování jsou typické symptomy poruch autistického spektra u lidí • V tomto případě je tedy potkan lepší model pro studium role genu Frm1 v rozvoji autismu než myš Upraveno z: Missouri Medicine | May/June 2013| 110:3 Myš domácí (laboratorní) Výhody tohoto modelového organismu: • Savec – z tradičních modelů nejblíže k člověku • Malá velikost – snadná manipulace a relativně levný chov • Velká vědecká komunita – spousta zdrojů (mutantní kmeny, know how) • Genetika – osekvenovaný genom (28 000 genů, 99% má ortology u lidí, divergence 75 milionů let), inbrední linie • Široká paleta experimentálních přístupů – včetně možnosti homologní rekombinace v embryonálních kmenových buňkách a transgeneze • Množství derivovaných buněčných linií pro in vitro kultivace Nevýhody • Relativně málo – např. neprůhlednost těla (x dánio), nepřístupné embryo, (příliš?) složitý organismus – genové rodiny – funkční zastupitelnost genů (Mus musculus) Nejčastěji používaný model v biomedicíně Myš jako laboratorní model Životní cyklus myši • Gestace – 19-21 dní • Odstav – 3-4 týdny • Pohlavní dospělost – 6-7 týdnů • Generační doba – 2-3 měsíce • Estrus – polyestrální, 4-5 dní • Počet mláďat ve vrhu 4-10 • Délka života – až 2 roky • „Jeden lidský rok = cca 14 myších dní“ Manipulace s laboratorní myší • Přenáší se uchopena za ocas • Pro fixaci myš uchopíme palcem a ukazovákem pevně za kůži za krkem a ocas fixujeme malíkem • Pro intraperitoneální injekci (i.p.) obrátíme zafixovanou myš bříškem vzhůru, hlavou dolů (pokles vnitřností) a druhou rukou aplikujeme injekci Manipulace s laboratorní myší Video – tradiční zacházení s myší Video – uchopování myší pomocí jen jedné ruky Chov laboratorních myší • Relativně nenáročný – v plastových nádobách (tzv. klíckách či nesprávně „akvárkách“) - podestýlka, voda + granule ad libitum, (buničina či jiný úkryt) • Teplota 22±2°C • Max. 6 myšek v jedné klícce (ale jen 1 chovný samec) • IVC – individually ventilated cages – brání rozšíření případné infekce do celého chovu IVCOtevřená klícka • Otevřený (konvenční) – vstup i výstup zvířat, osob i materiálu je bez bariéry, jen se zvýšenými hygienickými opatřeními - možno vylepšit IVC stojany a laminárními boxy na přestýlání myší • Bariérový – prostor pro zvířata je oddělen od vnějšího prostředí a vstup zvířat, osob i materiálu je možný jen přes bariéru - (sterilizace vody, potravy, podestýlky, zvýšená osobní hygiena ošetřovatelů) • Izolátorový – prostor pro zvířata je trvale oddělen bariérou od vnějšího prostředí a osob, které se zvířetem manipulují - gnotobiotické a imunodeficientní kmeny Systém chovu laboratorních myší Dělení podle mikrobiálního osídlení zvířat https://nanoed.tul.cz/pluginfile. php/6789/mod_resource/conte nt/0/14_In%20vivo%20testov% C3%A1n%C3%AD.pdf • konvenční – nedefinovaná mikroflóra, otevřený chov za dodržení základních hygienických podmínek • SPF – viz samostatný snímek • axenické (germ-free) - bez mikroflóry v trávicím traktu a na povrchu těla - mláďata hysterektomií do bezmikróbního prostředí izolátoru • gnotobiotické myši (definovaná mikroflóra) - první generace – očkování mikroflóry axenickým jedincům - monoasociované (monoxenické) kmeny - diasociované (dixenické) kmeny - polyasociované (polyxenické) kmeny Studium gnotobiotických myší v ČR Laboratoř gnotobiologie, Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. Pracoviště Nový Hrádek v Orlických horách https://mbucas.cz/vyzkum/detasovana-pracoviste/laborator-gnotobiologie/ SPF – „specified pathogen free“ zvířata • "specific pathogen free" – mikroflóra zvířat prokazatelně neobsahuje specifikované patogeny (salmonela, tuberkulóza, hepatitida…), jinak není přesně definována, proto je vhodnější název „specified pathogen free“ https://www.janvier-labs.com/421.html Archivace myších kmenů – kryoprezervace – embrya a spermie - rederivace, in vitro fertilizace (IVF) – pro „oživení“ kmene i pro „ozdravení“ (očištění od patogenů), ustanovení SPF linie, či izolátorového chovu • Chov je přísně bariérový a je podrobován pravidelným testům (~ 3 měsíce) na dané pathogeny (> 40), uvedeny v certifikátu ke zvířatům • Výběr se řídí doporučeními FELASA – Federation of Laboratory Animal Science Associations (http://www.felasa.eu/) Značení laboratorních myší • Jedinečné označení nutno u myší s různým genotypem v jedné klícce • Během odstavu od matky – rozdělení dle pohlaví a ustřižení špičky ocásku na genotypování 1) Ušní známky 3) Mikročipy 2) Značení uší nebo prstíků Software pro práci s laboratorními zvířaty • Pro správu myší i komunikaci s ošetřujícím personálem • Každá myš unikátní číslo (i třeba jen virtuální) • Databáze informací o každém zvířeti: „iniciály“, rodokmen, historie • Možnost filtrování při vyhledávání • Nevýhoda – pouze v AJ • - běžně užívané metody a zdroje - přirozené a indukované mutace - embryonální kmenové buňky (ESCs) - „knock-out a knock-in“ myši -Cre/loxP systém - nové metody „gene-targetingu“ - ZFN, TALEN a CRISPR/Cas9 - transgenní myši - myší kliniky II. „Experimental toolbox“ Genetika laboratorních zvířat 1. Isogenní = geneticky definované kmeny (isogenicita= genetická totožnost všech jedinců) - inbrední kmeny - vznik příbuzenskou plemenitbou po více než 20 generací (bratr a sestra nebo rodič a potomek) - koizogenní (=mutantní) kmeny - od původního kmene se liší jen v jednom genu, ve kterém došlo k mutaci - kongenní kmeny - vznik křížením dvou kmenů a následným zpětným křížením (minimálně 10, selekce sledovaného znaku), výskyt specifických genů jednoho kmene na pozadí kmene druhého - konsomické kmeny -na pozadí jednoho kmene přenesen zpětným křížením celý chromosom kmene druhého, obtížný proces 2. Neisogenní = geneticky nedefinované kmeny - outbrední linie - geneticky heterogenní populace, vyhýbáme se příbuzenskému křížení, tak aby koeficient inbreedingu zůstával co nejnižší - vhodné pro behaviorální pokusy 3. Kmeny geneticky částečně definované Nejčastější kmeny laboratorních myší • Inbrední kmen - všichni jedinci jsou odvozeni od jediného páru a jsou homozygotní ve všech alelách = geneticky identičtí jedinci • fenotypová uniformita (nízká variabilita reaktivity v experimentu) • Vytvořeny v 1. pol.20.stol. a udržovány (Jackson Lab,NIH,Charles River) • C57BL/6J – „black 6“ - nejpoužívanější kmen, první osekvenovaný myší genom, permisivní pro většinu mutací, resistentní vůči nádorům, možnost indukce obezity, DM II. typu i aterosklerózy dietou • 129 – pro „gene-targeting“ – vysoká frekvence produkce zárodečné linie, mnoho odvozených linií embryonálních kmenových buněk • BALB/c – produkce monoklonálních protilátek pomocí hybridomů • C3H/HeJ – používaný v mnoha odvětvích – výzkum infekčních chorob,.. • FVB/NJ - pro transgenezi – velký samčí pronukleus a velká mláďata Metody funkční genomiky Funkční genomika - cílem je určení funkce všech genů v genomu Dva hlavní přístupy: A) přímá (klasická) genetika (forward genetics) 1. fenotyp (znak) 2. gen - vychází z NÁHODNÉ mutageneze celého genomu B) reverzní genetika (reverse genetics) 1. sekvence DNA 2. Fenotyp - základem jsou CÍLENÉ mutace Přímá genetika – přirozené a indukované mutace 1. Kolekce přirozeně se vyskytujících mutací vzácný vznik, většinou ve velkých chovech př. Nahá („nude“, nu/nu, athymická, Foxn1nu) myš • 1966: vznik (Glasgow, UK), 1968: myši jsou imunodeficientní (nemají thymus), 1996: myši jsou mutantní v transkripčním faktoru Foxn1 2. Indukované mutace – a) chemická mutageneze nejčastěji N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) př. ApcMin myš – model vzniku kolorektálního karcinomu, mutace v genu Apc b) Genetické mutace – „gene-traps“ – inaktivace genu (SA-splice acceptor), exprese reportéru a DNA značka pro rychlé určení genu Reverzní genetika „Gene targeting“ – vnášení cílených mutací • Vnášení cílených mutací bylo dříve omezeno pouze na buňky s vysokou frekvencí homologní rekombinace, což jsou mimo kvasinek jen myší embryonální kmenové buňky • To bránilo vnášení cílených mutací u jiných organismů (uplatňovala se proto především transgeneze) • Zlom nastal se zavedením nových metod vnášení cílových mutací (ZNF, TALEN a především Crispr/Cas9), ty umožnily vnášet cílené mutace prakticky do všech buněk a organismů „Gene targeting“ dříve – homologní rekombinace cílového vektoru v embryonálních kmenových buňkách Jak získat z pozměněných embryonálních kmenových buněk myš A) Klasický (celkový, totální) knock-out – gen zcela vyřazen (dříve často nahrazen selekčním markerem), může vést ke smrti jedince již v prenatálním věku, což neumožňuje studium funkce v dospělém organismu B) Knock-in – do genového lokusu vložena mutace (záměna, inserce, delece,…) nebo např. reportérový gen či Cre rekombináza C) Podmíněný (kondicionální) knock-out – Cre/loxP systém místně a časově specifická inaktivace genu Genový „knock-out, knock-in“ C) FLOXED GENE B) GENE KNOCK-IN A) GENE KNOCK-OUT Více informací na: https://www.youtube.com/watch?v=oLPjiwM0G7A Cre/loxP systém – podmíněná delece genu • CreERT2 - Cre recombináza fúzovaná s estrogenovým receptorem je regulována hydroxytamox ifenem (aktivní až po injekci tamoxifenu) • CreERT2 – umožňuje místně i časově specifickou regulaci rekombinace DNA Babinet C., Cohen-Tannoudji M.; 2001loxP site (locus of X-ing over) Nové metody „gene targetingu“ DNA cleavage 1. Zinc finger nuclease (ZNF) technologie 2. TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases 3. CRISPR/Cas9 technologie https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8 • založeno na endogenních mechanismech opravy poškozené DNA • funkční v mnoha buněčných liniích a organismech • „knock-outové“ organismy připravené za měsíc či dva • Transgenní organismy - jejich genom obsahuje cizorodou DNA, jejíž místo integrace je však NÁHODNÉ • Příprava (pokusná myš) - injekce „nahé“ DNA (konstruktu) do zygoty • náhodná integrace do genomu (často ve formě „ tandem arrays“) • implantace do „náhradních“ (foster) matek (200-300 embryí) • genotypování potomstva na přítomnost transgenu (1-10%) • křížení „founderů“, analýza fenotypu Transgenní zvířata Transgeneze vs. Gene targeting Transgenní myši • Smysl pokusu - co se stane, dojde-li k expresi genu v jiné než původní tkáni • nadprodukce proteinu (v původní či jiné tkáni) • produkce změněného proteinu • studium regulačních oblastí genu nebo značení buněk in vivo (exprese „reportérových“ proteinů – GFP, β-galaktozidáza) • Výhody - rychlost a jednoduchost provedení • Nevýhody - náhodná integrace konstruktu – narušení genů v místě integrace • poziční efekt regulačních oblastí genů v místě integrace na expresi transgenu (umlčování transgenu, ovlivnění exprese trangenu atd.) • integrace více kopií konstruktu (efekt „genové dóze“) • Řešení - nutnost analýzy více „founders“ • použití DNA sekvencí eliminujících poziční efekt (inzulátory, Matrix Associated Regions; MAR) • použití velkých částí chromozomů (Bacterial Artificial Chromosome; BAC recombineering) International knock-out mouse consortium http://www.mousephenotype.org/about-ikmc • Cíl IKMC – připravit (kondiciovaný) knock-out pro každý myší gen • Pomoci tohoto přístupu zjistit funkci každého genu • Nutno systematicky studovat fenotyp myší tzv. myší kliniky (jedna i ve Vestci u Prahy) Jak lze geneticky upravené myši systematicky studovat? https://www.phenogenomics.cz/ Fenotypování (Phenotyping) • Komplexní fyziologické a morfologické posouzení myši v SPF prostředí pomocí standardizovaných testů dle IMPReSS (International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens), Shrnutí • Ochrana zvířat je etický imperativ nejen během experimentů s nimi • Myš je nejpoužívanější model pro biomedicínský výzkum • Chov konvenční vs. bariérový chov IVC, SPF, izolátorový chov • Výborný genetický model – inbrední kmeny, možnost manipulace genomu – gene targeting vs. transgeneze • Klasický vs. kondicionální knock-out (knock-in) + Cre/loxP systém • Databáze – www.jaxmice.org, www.komp.org, www.eucomm.org, www.informatics.jax.org, www.creline.org Děkuji za pozornost!