Analýza proteinových modifikací, proteinových komplexů, manipulace exprese proteinů a proteomika Post-translační modifikace (PTM) proteinů •Úpravy proteinů po nebo během jejich syntézy ribozómy (translaci) •Katalyzované enzymy •Většinou kovalentní připojení funkční skupiny na postranní řetězec aminokyselin, případně na N- nebo C- konec proteinu •Proteiny získavají nové vlastnosti (náboj, konformační změna...) • Post-translační modifikace (PTM) proteinů •Výrazně zvyšují komplexnost proteomu •Velký význam v signálních kaskádach (aktivace enzymů, změna interakčních partnerů...) • Typy PTM •Připojení chemické skupiny: •Fosforylace •Acetylace •Hydroxylace •Metylace • •Připojení komplexní skupiny: •Glykozylace •Lipidace •GPI kotva • •Připojení polypeptidu: •Ubiquitinace •SUMOylácia Změna aminokyseliny: •Deamidace • Vytvoření disulfidické vazby Štěpení proteinů: •Proteolýza Osnova: •Detekce modifikací na endogenních proteinech •Biochemické principy experimentálních systémů určených pro globální detekci post-translačních modifikací •Aplikace těchto postupů na biologické otázky •Analýza komplexních proteinových směsí (hmotnostní spektrometrie) • •„Vím, co hledám“ vs. „Nevím, co hledám (ale chci to najít)“ • • Fosforylace •Najčastěji : serin, treonin, tyrozin a histidin •Katalyzovaná enzymy: •Kinázy připojení fosfátu pomocí energie ze štěpení ATP na ADP •Fosfatázy odstranění fosfátu (defosforylace) Význam: •Regulace funkce enzymů (aktivace/deaktivace) •Nejčastější PTM, až 1/3 – 2/3 proteomu (u eukaryot) •Častá forma přenosu signálu v signálních kaskádach • Fosfo-specifické protilátky •Protilátky detekující proteiny fosforylované na specifickém místě •Studium aktivace signálních drah (pLRP6- aktivace Wnt/β-kateninové dráhy) •Aktivace/inaktivace enzymů (fosforylovaná Glycogen syntáz kináza 3β je neaktivní) •Umožnění vazby na jiné interakční partnery ( proteiny obsahující 14-3-3 doménu se váží na specifické fosfoserinové a fosfothreoninové motivy • • Fosforylace koreceptoru LRP6 a proteinu Dishevelled po aktivaci Wnt3a detekováno WB Fosforylace Dishevelled 3 (DVL3) S643 po přidání Casein kinázy 1ε (CK ε) detekovano Western Blottingem Acetylace •N- koncová acetylace •Ko-translační modifikace •Až 85% lidských proteinů •Vevnitř řetězce typicky na lyzinu •Katalyzovaná enzymy: •Acetyltransferázy připojení acetylové skupiny (potřebný acetyl-koenzým A) •Deacetylázy odstranění acetylové skupiny Význam: •Regulace funkce, stability a lokalizácie protenů •Remodelace chomatinu (H4K16Ac – HAC vs. HDAC)-histonový kód •Regulace cytoskeletu (acetylace tubulinu) • Protilátky proti acetylovaným formám proteinů •Specifické pro acetylované proteinů •Acetylace transkripční faktorů mění jejich schopnost vázat se na DNA (př. acetylovaný p53- v reakci na stres zvýšená vazba na DNA) •Acetylace může umožnit vazbu jiných interakčních partnerů (př. c-Jun) •Acetylace může regulovat lokalizaci proteinů (HNF-4 v jádře) • • Modifikace histonů-histonový kód •PTM histonů (metylace, fosforylace, acetylace, ubiquitinace a sumoylace •Ovlivňují náboj a tím mění sílu vazby mezi histony a DNA a interakce mezi histony a regulačními proteiny→ epigenetické regulace přepisu genů • Detekce modifikace histonů •Protilátky detekující modifikované formy histonů a následná analýza pomocí WB nebo fluorescenčních metod •Chromatinová Immunoprecipitace (ChIP)- izolace proteinu společně s navázanou DNA pomocí specifických protilátek a možnost lokalizace v rámci genomu (modifikace Chip on chip asssay •Detekce nových modifikací pomocí hmotností spektrometrie- umožňuje detekci, ale i charakterizaci modifikace (př. rozdíl mezi acetylací 42.0106 Da a trimetylací 42.0470 Da) • Chromatinová immunoprecipitace ChIP on chip Ubiktvitinace •Význam •stabilita proteinů •buněčná lokalizace •biologická aktivita •Připojení ubikvitinu na lyzin daného proteinu Detekce ubikvitinovaných proteinů •Využití anti-ubikvitin protilátek •His-ubikvitin pull down •Imunoprecipitace ubikvitinu • • Proteiny fungují v komplexech •Proteinové komplexy jsou skupiny proteinů, které spolu interagují v určitém čase a místě a hrají důležitou roli při regulaci buněčných procesů a signálních kaskád •Jsou dané proteiny ve vazbě? •Immunoprecipitace •Hmotností spektrometrie •BioID metody •Afinitní chromatografie •Tandemová afinitní chromatografie • •Jsou proteiny lokalizovány na stejném místě? •Immunocytochemie •Immunohistochemie • • Destrukční komplex Signalosom komplex Imunocytochemie-proteiny spolu nekolokalizují červeně Neuropilin, zeleně Dishevelled, modře jádro. Destrukční komplex fosforyluje β-katenin, který je následně rozložen v proteazomu. Po aktivace Wnt ligandem se destrukční komplex rozpadá a vzniká nový signalosom komplex na vnitřní straně membrány. Β-katenin může být translokován do jádra spustit trankripci cílových genů. Immunoprecipitace (IP) •Purifikace proteinu pomocí protilátky 1.Lyze buněk (v lyzačním pufru) 2.Odstranění nerozpustných častic centrifugácí 3.Inkubace s primárními protilátkami 4.Inkubace s kuličkami (agarózové, sefarózové, magnetické...), které na sebe naváží primární protilátku (typicky pomocí A/G proteinu) 5.Promývání (lyzačním pufrem) 6.Eluce (glycin, SDS nebo močovina) Immunoprecipitace složení pufrů Lyzační pufr: •Pufrovací systém – pro udržení požadovaného pH (např. 50mM Tris pH=8) •Soli – úprava iontové síly (např. 150mM NaCl) •Detergent – rozbití membránových struktur, při zachování proteinových komplexů (napr. 0,2% NP-40) •Chelatační činidlo – odstranění intů (Mg2+, Ca2+...), které jsou často kofaktorom proteáz (např. 1mM EDTA) •Redukční činidlo – prevence oxidačního poškození proteinů, redukce disulfidických vazeb (např. 1mM DTT) Eluční pufr: •Pufrovací systém (50mM Tris pH=8) •Detergent (2% SDS) •Redukční činidlo (5% β-Mercaptoethanol) • ChIP – chromatinová imunoprecipitace •Chromatinová Immunoprecipitace (ChIP)- izolace proteinu společně s navázanou DNA pomocí specifických protilátek a možnost lokalizace v rámci genomu (modifikace Chip on chip asssay •U proteinů vážících DNA •Možno zkombinovat s PTM-specifickýma protilátkama – např. histonový kód • Chromatinová immunoprecipitace ChIP on chip Afinitní purifikace •umožňuje oddělit z komplexní směsi skupinu příbuzných proteinů nebo jeden určitý protein •imobilizovaný ligand reagující specificky s proteinem našeho zájmu a tvoří silnou vazbu, zbytek směsi protéká kolonou beze změny, navázaný protein se následně eluuje z imobilizovaného ligandu pomocí vysoce koncentrovaného roztoku solí nebo i roztokem s rozpustnou formou ligandu •Časté využití proteinových tagů •Peptidové sekvence přidané k rekombinantním proteinům •Často mohou být z proteinů odstraněny chemicky nebo enzymaticky • • • Hlavní typy tagů •Afinitní tagy- využívané při AC, proteiny s tímto typem tagů mohou být jednoduše purifikovány pomocí AC •Strep-tag- (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)- vazba na Biotin •glutathione-S-transferase (GST)- vazba na glutathion •poly(His) tag – alespoň 6 His zbytků, afinita ke kovové matrice (př. Nikl) •Tagy upravující rozpustnost proteinů- důležité při produkci rekombinantních porteinů •thioredoxin (TRX) •Chromatografické tagy- využivané při chromatografických metodách •FLAG-tag •Epitope tagy- jsou krátké peptidové sekvence, které jsou velmi dobře detekovatelné komerčními protilátkami- často odvozené z virových genů, proto jejich silná imunoreaktivita, často využívané při WB a IF metodách •V5-tag-GKPIPNPLLGLDST •Myc-tag-EQKLISEEDL •HA-tag-YPYDVPDYA •FLAG-tag - DYKDDDDK •Fluorescenční tagy •GFP •RFP, BFP a další • (GFP)-tagged microtubules (GFP-MAP4) Tandemová afinitní purifikace •Studium protein-proteinových interakcí •Fůzní protein, který má na svém konci dva tagy • V prvním kroku purifikace se náš protein vypurifikuje díky prvnímu tagu, který je po eluci enzymaticky odštěpen a následuje druhá purifikace využívající následující tag • BioID •Unikátní metoda pro studium fyziologicky relevantních protein-proteinových interakcí v živých buňkách •Tvorba fúzního proteinu s promiskuitní bakteriální biotin ligázou (BirA)- biotinyluje všechny proteiny v její bezprostřední blízkosti. Po expresi BirA-fúzního proteinu v buňkách se biotinylují všechny proteiny, které s BirA-fúzním proteinem interagovaly. Biotinylované proteiny mají vysokou afinitu, ke streptavidinu→detekce pomocí WB nebo hmotností spektrometrie •Detekují se i dynamické vazby mezi proteiny Po purifikaci …. následuje detekce •Western blotting (pokud vím, co chci detekovat a mám na to protilátku) •Hmotnostní spektrometrie (MS/MS) – analytický přístup pro určení složení komplexních proteinových směsí Hmotnostní spektrometrie (Mass spectrometry MS) •Umožňuje zanalyzovat všechny proteiny a jejich PTM v určitém čase a místě • •Rozdělení častic podle jejich hmotnosti a náboje (m/z) • 1.Příprava vstupního materiálu (proteiny po IP, SDS PAGE...) 2.Štěpení na oligopeptidy (např. pomocí trypsinu) 3.Ionizacia peptidů (paprsek elektronů, elektrosprej, laser...) 4.Rozdělení podle m/z (sektorový magnetický analyzátor, orbitrap, TOF...) 5.Detektor částic Při MS/MS: 5.Fragmentace peptidů 6.Rozdělení podla m/z (orbitrap, TOF...) 7.Detektor částic 8. 8. • Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) 1. •Odseparované častice je možné použít na „další kolo“ hmotnostní spektorometrie •Separované častice jsou fragmentované – například pomocí kolize s neutrálními molekulami (He, N...) po jejich urychlení (Collision-induced dissociation - CID) •Fragmentované častice jsou znovu separované podle m/z a detekované detektorem • Výsledek obrázku pro ms/ms fragmentation Analýza MS spektra 1. • (Z. Zdráhal) BioID WB analýza BioID experimentu Výstup z analýzy hmotností spektrometrií BioID experimentu- až několik stovek interakčních partnerů UpSet Plot/Volcano plot Statistická analýza: FC – fold change p value – statistická významnost FRET (Förster Resonance Energy Transfer) •Principem je přenos neradiační energie mezi dvěma na světlo senzitivními molekulami •Intramolekulární FRET •Měření vzdálenosti mezi dvěma proteiny •Intermolekulární FRET •Měření vzdálenosti mezi dvěma místy uvnitř jedné molekuly • • Experimentální buněčné systému pro studium funkce proteinů •Dva základní principy: • •1. „gain-of-function“ (GOF) • •2. „loss-of-function“ (LOF) • •3. Možno kombinovat v tzv. „rescue“ esejích GOF: Konstitutivní vs. inducibilní exprese •Konstitutivní exprese genu-stálá a průběžná exprese daného genu (přirozeně housekeeping geny), stabilní buněčné linie, silné promotory: CMV, RSV, SV40, LTR MoMULV • •Inducibilní exprese genu- exprese genu je aktivovaná pouze za určitých podmínek (světlo, antibiotika, živiny, kyslík atd..), inducibilní buněčné linie • •Tkáňově nebo vývojově specifická exprese genu Tvorba stabilních buněčných linií •Transfekce buněk plazmidem kodující gen našeho zájmu a obsahující antibiotikovou rezistenci •Selekce daným antibiotikem •Izolace jednotlivých single cell klonů •Napěstovat a ověřit expresi daného genu Inducibilních buněčné linie •TetON systém •Exprese genu po přidání tetracyklinu do média •přítomnost tetracyklinu na reverse Tet represoru (rTre)→vazba na TRE (Tet Response Element) spouští transkripci genu nacházejícího se za TRE •TetOFF sytém •Tetracyklin se váže na tetracycline-controlled transactivator (rTA)→ zánik vazby na TRE → transkripce genu je zastavena • • • • • (J. Doškař) Tvorba inducibilních buněčných linií •Tvorba transgenu obsahující TRE, gen našeho zájmu a gen pro antibotikovou rezistenci •Transfekce buněk plazmidem s transgenem •Selekce daným antibiotikem •Izolace jednotlivých single cell klonů •Napěstovat a ověřit expresi daného genu • •Nebo speciální buněčné linie př. T-REx™ buněčné linie stabilně exprimující TRE • Přechodná vs. stabilní exprese genu •Přechodná (transientní) exprese genu •Gen je exprimován pouze v řádu dnů •Transfekce •PEI transfekce •Transfekce lipofektaminem •Nukleofekce •Elektroporace • • •Stabilní exprese genu •Gen je neustále průběžně exprimován •Viz. stabilní buněčné linie LOF: CRISPR/Cas9 •Metoda umožňující jednoduše, rychle a efektivně modifikovat sekvenci jakéhokoliv genu •2 komponenty •Cas9- endonukleáza •gRNA- RNA komplementární k sekvenci genu, který chceme modifikovat •Využití •Delece genu •Změna sekvence genu (př. oprava mutace-využití při léčbě nemocí) •Vložení genu (gene knock-in) •Označení specifické sekvence (dCas9) • CRISPR/Cas9 hands on •All in one systém (Cas9+ gRNA) •Plazmid kodující Cas9, fluorescenční tag +restrikční místa pro jednoduché vkolonování gRNA (komerční př. Addgene) •Možnost transfekovat a targetovat několik genu najednou (různé fluorescenční tagy) • •Postup •Design gRNA- Broad gRNA design tool navrhne nejlepší gRNA pro námi zvolený protein https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design •Vklonovaní gRNA do plazmidu-ověření sekvenací •Transfekce plazmidu s naší gRNA do buněk •Další den natrasfekované buňky flouroscenční svítí- sorting jednotlivých natresfekovanách buněk na 96 jamkovou misku •Nechat klony růst zhruba dva až tři týdny •Otestovat kolonie- WB analýza, RE analýza a sekvenace • • • • 3dny+sekvenace 2dny 2-3 týdny Validace CRISPR/Cas9 •Tvorba TREX buněk, které jsou knockout pro proteiny DVL1, DVL2 a Dvl3 •Vyseto 5x96 jednotlivých buněk •Cca 30 jednotlivých kolnů narostlo •5 klonů LRP5/6 dKO (ověřeno RE a WB) ostatní buď single KO nebo cca 5 klonů WT RE Restrikční štěpení Validace Western blotting Sekvenace Exprese na pozadí endogenních proteinů vs. rescue systém •Overexpresní systémy •Exogenní exprese daného genu a jeho následné studium •+ protein je přirozeně málo abundatní •+overexprimovaný protein obsahuje tag-lépe se detekuje a analyzuje •-interference s endogením proteinem •-nefyziologické podmínky (to, co funguje v overeprimovaném systému nemusí fungovat za přirozených podmínek) •Rescue systémy •Exprese proteinů v systému, kde byl různými metodami (CRISPR, siRNA) gen deletován a jeho následné studium (rescue) •+ není interference s endogenními proteinem •+více fyziologické •-nutnost tvorby KO linie Exprese na pozadí endogenních proteinů vs. rescue systém •Overexpresní systém •DEP doména proteinu Dishevelled není potřebná pro Wnt/β-cateninovou signalizaci • •Rescue systém •CRISPR/Cas9 editovaná linie Dvl1/2/3 KO HEK •DEP doména je potřebná pro Wnt/β-cateninovou signalizaci • • • • • • • •Rescue jednotlivými formami proteinu DVL- jsou redundantní? (nelze studovat ve WT buňkách-interference s endogeně exprimovanými DVL proteiny, ale rescue musí být, co nejblíže endogením podmínkám • •CRISPR/Cas9 editované linie •Vždy dvě ze tří isoforem genu Dvl jsou deletované- umožńuje nejpřirozenější možnoou formu studia jednotlivých isoforem proteinu DVL- žádná interference s endogenními formami DVL porteinů a jednotlivé DVL isoformy jsou exprimovány fyziologicky • • • • • • •