RNDr. Miroslav Ciganek, Ph.D.
RNDr. Jiří Neča
Ing. Josef Slavík
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Brno; 7.11.2018, 9-17 hod.
ciganek@vri.cz
Vybrané separační techniky a detekční
principy (GC, HPLC a MS)
Bi5599 Metody aplikované biochemie a buněčné biologie
Obsah přednášky:
1. část – separační techniky, hmotnostní spektrometrie (45 min.)
(velká zasedací místnost VÚVeL Brno)
2. část – praktická ukázka v laboratoři (3 x 15 min.)
GC/MS (M. Ciganek) – Bio-aplikace
LC/MS-MS (J. Neča) - Metabolomika
LC/Hybrid-MS (J. Slavík) - Lipidomika
Analytická chemie
Analýza vzorků
Postup analýzy vzorků
(SOP – standardní operační postup)
Postup analýzy (komplexní proces – správný výsledek)
Sekvence kroků (izolace analytu(ů) z matrice vzorku):
- odběr vzorku
- doprava a skladování vzorku
- zpracování vzorku
- analytická koncovka
(identifikace a kvantifikace analytu)
Vyjádření výsledků analýzy (koncentrace nebo obsah analytu)
cDHA = (5,02 ± 0,12) nmol/106 buněk (číslo následující za znakem ± představuje
číselnou hodnotu rozšířené nejistoty měření)
Hodnota nejistoty měření se vždy uvádí na 2 platné cifry.
Počet platných cifer:
řízen nejmenším počtem platných cifer v postupu analýzy
Např. vážení vzorku na úrovni 10,5 mg pak počet platných cifer výsledku
je 3
ne 5,021869 ale 5,02
!!! Detaily se dají dostudovat na internetu
Kombinace SEPARACE sloučenin a molekulární
asemblerů s následnou identifikací a kvantifikací
technikou MS
LC/MS-MS
GC/MS
Separační techniky
GC(plynová chromatografie), HPLC(kapalinová chromatografie), TLC(tenkovrstvá chromatografie),
CE(kapilární elektroforéza), FFF(frakcionace tokem v poli)
GPC (gelová permeační chromatografie), PC (chromatografie na papíře)
TLC (tenkovrstvá chromatografie)
Princip separace v koloně (vymezený prostor, ve kterém dochází k
oddělování jednotlivých složek komplexního vzorku (lipidy, peptidy, proteiny, ...))
Mezi separační techniky patří:
- separace sloučenin ve sloupci křemeliny
- kapalinová chromatografie
- kapilární elektroforéza
- konfokální mikroskopie
Mezi separační techniky nepatří:
- plynová chromatografie
- frakcionace tokem v poli (FFF)
- proteomika
- spektrofotometrie
HPLC (High-performance (High-pressure) LC); Částice: 3 – 10 μm; Tlak: do 400 bar
RRLC (Rapid Resolution LC); Částice: 1,8 μm (porézní směsné); Tlak: do 600 bar
UPLC (Ultra Performance LC); Částice: 1,7 μm (porézní uniformní); Tlak: do 1000 bar (1200 bar)
Rozdělení kapalinové chromatografie podle velikosti a typu částic v koloně:
Co především rozhoduje o účinnosti
separace v HPLC koloně:
- délka kolony
- náplň kolony
- teplota kolony
- použitá mobilní fáze
Které parametry rozhodují o separační účinnosti
kapilární kolony používané v plynové chromatografii:
- typ vnějšího pokrytí kolony
- délka kolony
- materiál kolony
- vnitřní průměr kolony
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
In his book, “Rays of Positive Electricity” (1913), J.J.Thomson
remarked:
“I feel sure that there are many problems in chemistry which could be
solved with far greater ease by this than by any other method.
The method is surprisingly sensitive, ……..requires an infinitesimal
amount of material and does not require this to be specially purified.”
Základní pojmy:
 Hmotnostní spektrometrie (analytická instrumentální metoda)
 Hmotnostní spektrometr (přístroj určený k provádění MS)
 Hmotnostní spektrum (finální produkt metody)
Základní princip:
• tvorba iontů ve vakuu z anorganických a organických sloučenin nebo
prvků některou z vhodných ionizačních technik
• separace iontů podle m/z
• kvalitativní a kvantitativní detekce iontů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
MS detekuje hmotnost jednotlivých molekul nebo jejich
stabilních částí (fragmentů), které musí existovat ve formě iontů.
Separace a detekce těchto iontů je možná pouze ve vakuu.
Vzhledem k tomu, že molekuly jsou velice malé, nemůžeme pro určení jejich
hmotnosti použít konvenční jednotky hmotnosti (kg nebo g), protože
hmotnost např. 1 atomu vodíku je asi 1,66x10-24 g.
Proto byla zavedena konvence pro určování hmotnosti jednotlivých molekul,
kterou je hmotnostní jednotka (v biochemii označovaná jako 1 Dalton (Da)).
Bylo určeno, že izotop uhlíku 12C má hmotnost 12.00000000
(12 hmotnostních jednotek přesně).
Hmotnostní spektrometrie je přístrojová technika, která umožňuje:
- stanovit množství stabilních izotopů prvků v molekule
- určit molekulovou hmotnost sloučeniny
- stanovit stáří hornin
- zjistit absorbanci organické sloučeniny
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Hmotnostní spektrometrie v kombinaci se separační technikou
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM - Záznam iontů vzniklých ze zkoumaného vzorku,
uspořádaný podle vzrůstajícího poměru hmotnosti k náboji (m/z), vynesený proti
absolutnímu nebo relativnímu zastoupení jednotlivých iontů.
nízké rozlišení - lze stanovit hmotnost iontu s přesností jednotky
hmotnostní škály - LRMS
vysoké rozlišení - lze stanovit hmotnost iontu s přesností dostatečnou pro
„jednoznačné“ stanovení jeho elementárního složení. Hmotnost se stanovuje
s přesností na deseti- až sto-tisíciny hmotnostní jednotky v závislosti na
typů použitého hmotnostního spektrometru - HRMS
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Přesné hmotnosti stabilních izotopů
Prvek Izotop Hmotnost
vodík 1 1,0078252
vodík 2 2,0140100
uhlík 12 12,0000000
uhlík 13 13,003354
dusík 14 14,003074
dusík 15 15,000110
kyslík 16 15,99491415
fluor 19 18,998405
křemík 28 27,976927
fosfor 31 30,973763
síra 32 31,972074
prvek izotop zastoupení [%]
Jod 127
I 100
Bor 10
B 19,6
11
B 80,4
Dusík 14
N 99,63
15
N 0,37
Fluor 19
F 100
Sodík 23
Na 100
Křemík 28
Si 92,21
29
Si 4,70
30
Si 3,09
Síra 32
S 95,0
33
S 0,76
34
S 4,22
36
S 0,014
Prvky typu : A
Prvky typu : A + 1
Prvky typu : A + 2
Stabilní (neradioaktivní) prvky:
UHLÍK (C) : stabilní izotopy – 12C(98.9%) a 13C(1.1%)
CH4 : 12CH4 (16), 13CH4(17)
počet atomů
v molekule
Superpozice izotopů v molekule ionty intenzita [%] intenzita norm. int. [%]
1 C : 12
C M 98.9 100 M M+1
13
C M+1 1.1 1.11 100% 1.11%
2 C : 12
C
12
C M 98.9 x 98.9 9781.21 100
12
C
13
C M+1 98.9 x 1.1 108.79 1.11 M M+1 M+2
13
C
12
C M+1 1.1 x 98.9 108.79 1.11 100% 2.22% 0.01%
13
C 13
C M+2 1.1 x 1.1 1.21 0.0124
3 C : 12
C
12
C
12
C M 98.9 x 98.9 x 98.9 967362 100
12
C 12
C 13
C M+1 98.9 x 98.9 x 1.1 10759 1.11
12
C 13
C 12
C 98.9 x 1.1 x 98.9 10759 1.11
13
C 12
C 12
C 1.1 x 98.9 x 98.9 10759 1.11 M M+1 M+2 M+3
12
C 13
C 13
C M+2 98.9 x 1.1 x 1.1 119.7 0.0124 100% 3.33% 0.037% 0.00014%
13
C
12
C
13
C 1.1 x 98.9 x 1.1 119.7 0.0124
13
C 13
C 12
C 1.1 x 1.1 x 98.9 119.7 0.0124
13
C 13
C 13
C M+3 1.1 x 1.1 x 1.1 1.331 0.000138
4 C : 12
C
12
C
12
C
12
C M 98.9 x 98.9 x 98.9 x 98.9 95749458 100
12
C
12
C
12
C
13
C M+1 98.9 x 98.9 x 98.9 x 1.1 1064098 1.11
12
C 12
C 13
C 12
C 98.9 x 98.9 x 1.1 x 98.9 1064098 1.11
12
C
13
C
12
C
12
C 98.9 x 1.1 x 98.9 x 98.9 1064098 1.11
13
C
12
C
12
C
12
C 1.1 x 98.9 x 98.9 x 98.9 1064098 1.11
12
C
12
C
13
C
13
C M+2 98.9 x 98.9 x 1.1 x 1.1 11835 0.0124
12
C
13
C
12
C
13
C 98.9 x 1.1 x 98.9 x 1.1 11835 0.0124 M M+1 M+2 M+3 M+4
13
C
12
C
12
C
13
C 1.1 x 98.9 x 98.9 x 1.1 11835 0.0124 100% 4.44% 0.049% 0.00055% 0.0000015%
13
C
13
C
12
C
12
C 1.1 x 1.1 x 98.9 x 98.9 11835 0.0124
12
C
13
C
13
C
13
C M+3 98.9 x 1.1 x 1.1 x 1.1 132 0.00014
13
C
12
C
13
C
13
C 1.1 x 98.9 x 1.1 x 1.1 132 0.00014
13
C
13
C
12
C
13
C 1.1 x 1.1 x 98.9 x 1.1 132 0.00014
13
C
13
C
13
C
12
C 1.1 x 1.1 x 1.1 x 98.9 132 0.00014
13
C
13
C
13
C
13
C M+4 1.1 x 1.1 x 1.1 x 1.1 1.46 0.00000153
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Spektrum LRMS
Spektrum HRMS
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Hmotnostní spektrometr
princip a konstrukce
Komerčně vyráběné hmotnostní spektrometry – různé konstrukční
principy, různá výkonnost a použitelnost a tomu odpovídající ceny.
 nízkorozlišovací, vysokorozlišovací
 jako detektory pro GC, LC a elektromigrační techniky
Interface – zařízení pro připojení jiných technik k MS
kapilární plynové chromatografie – jednoduché připojení
kapalinové chromatografie – komplikace
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Detekce – pouze stabilních analytů,
nedochází k jejich transformaci v průběhu odběru, uchovávání a zpracování
vzorků a při jejich kvalitativní a kvantitativní (koncové) analýze
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Hmotnostní spektrometr
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
VAKUOVÝ SYSTÉM (tlak 10-3 - 10-8 Pa)
Dvoustupňový systém :
– rotační pumpa (hrubé vakuum)
– difúzní a turbo-molekulární pumpy (vývěva) (hluboké vakuum)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
IONTOVÝ ZDROJ - Ionizace
Vznik iontů z molekul nebo jejich částí
ANALYZÁTOR - Separace iontů
Separace iontů podle jejich poměru hmotnosti k náboji (m/z)
- iontů s jednotkovým nábojem m/1 = m
- násobně nabité ionty (např. proteiny) m/z, např. 10 000/20 = 500
DETEKTOR - Detekce iontů
Detekce a stanovení intenzity separovaných iontů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
IONIZACE
- elektronová ionizace (EI)
- chemická ionizace (CI)
- ionizace elektrickým polem (FI a FD)
- ionizace nenabitými urychlenými částicemi (FAB)
- desorpční chemická ionizace (DCI)
Ionizace velkých molekul
(biologické a biochemické aplikace)
- elektrosprejová ionizace (ESI)
- ionizace za atmosférického tlaku (APCI)
- desorpce a ionizace laserem (LDI, MALDI)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
ANALÝZA (separace) iontů
Režimy akvizice (analýzy) iontů:
 full scan (opakovaná detekce hmotnostních spekter v nastaveném rozsahu m/z
v čase) – získání spekter pro tentativní identifikaci analytů
 detekce vybraných iontů (sledování intenzity jednoho nebo několika iontů)
(single ion monitoring – SIM, single ion recording - SIR, multiple ion detection – MID) –
sledování složek s nižší mezí detekce
 techniky MS-MS (další štěpení iontů v kolizní cele nebo trapu), techniky
produktových iontů, MRM, NL, MSn
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Základní typy analyzátorů
 magnetický analyzátor (B)
 elektrostatický analyzátor (E)
 sektorové analyzátory (analyzátory s dvojitou fokusací (HRMS))
 kvadrupólový analyzátor (filtr) (Q)
 iontová past (IT)
 lineární (kvadrupólová) iontová past (LIT)
 analyzátor doby letu (TOF)
 elektrostatická orbitální past - orbitrap
 iontová cyklotronová rezonance s FT (FT-ICR)
Horní limit měřitelné hmotnosti – nejvyšší hodnoty m/z, které mohou být
detekovány (mnohonásobně nabité ionty snižují tuto hodnotu v případě velkých molekul)
Rozlišení – odlišení poměrů signálů iontů s podobným m/z
Transmise – poměr iontů, které dopadnou na detektor
Cena – od 1 do 50 mil. Kč
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Kvadrupólový analyzátor (Q)
V MS technice 1 nebo 3 kvadrupóly (TripleQuad)
TripleQuad
3 Q: 1. skenovací,
2. kolizní cela /reakce iontů s kolizním plynem (dusík nebo argon),
3. skenovací
Možno nastavit různé režimy akvizice iontů – Selektivita a Citlivost:
Scan 1. nebo 3. Q
Scan Produktových iontů
Scan Prekurzorových iontů
MRM (Multireaction monitoring)
Scan neutrálních ztrát (odštěpení vody, ...)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Iontová past (IT), 3D past
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Lineární (kvadrupólová) iontová past (LIT)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Analyzátor doby letu (TOF)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Elektrostatická orbitální past - orbitrap
Nejnovější typ hmotnostního analyzátoru, princip popsán ruským fyzikem Makarovem,
komerčně dostupný od roku 2005. Rozlišení 100 000 – 240 000.
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Iontová cyklotronová rezonance s Furierovou transformací
(FT-ICR)
Nejvýkonnější typ hmotnostního analyzátoru.
Rozlišení 750 000 – 2 500 000.
Parametry ICR vybočují z rámce všech ostatních MS analyzátorů
(rozlišení, vakuum, provoz (nutné kapalné He), cena).
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Parametry hmotnostních analyzátorů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Detekce iontů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Elektronový násobič:
Fotonásobič:
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
Hybridní hmotnostní spektrometry
Q - TOF
Orbitrap Elite Hybrid MS:
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
LC/Q-ICR
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
LC/NMR-MS
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
OMICs
Genomics
Transcriptomics
Addomics (adukty na DNA)
Proteomics
Lipidomics
Cellomics
Metabolomics
Foodomics
Mircobiomics
Psychogenomics
Stem cell genomics
...
NIST Libraries of Peptide Tandem Mass Spectra
http://chemdata.nist.gov/dokuwiki/doku.php?id=peptidew:start
Currently, there are > 3.8 million spectra in the libraries, representing 1.26 million
different entities (derivative-peptide sequence-fragmentation mode). Several of the
largest libraries resulted from data collected by laboratories collaborating in the
National Cancer Institutes Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium
(CPTAC)[http://proteomics.cancer.gov/].
CPTAC laboratories conducted more than 6,000 2D-LC/MS/MS runs of human
tumor and human-mouse xenograft samples producing >91 million MS/MS
spectra.
Proteomics
Liver Mitochondria Proteomics: Protein Quantitation
J. Ho,1 L. Dayon,2 J. Corthésy,2 U. De Marchi,2 A. Núńez,2 R. Viner,3 M. Blank,3 S. Danielson,3 M. Oppermann,1 M.
Hornshaw,1 M. Kussmann,2,4,5 A. Wiederkehr2
1Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, UK;
2Nestlé Institute of Health Sciences, Lausanne, Switzerland;
3Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA;
4Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne (EPFL), Lausanne, Switzerland;
5Faculty of Sciences, Aarhus University, Aarhus, Denmark
Lipidomics
LIPID MAPS (Lipid Metabolites And Pathways Strategy)
Each cell plasma membrane is made of ~200 million lipids. However, each
cell also has a nuclear membrane, mitochondrial membranes, membranes
of Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, etc.
Collectively, the number of lipids is ~109 per cell.
Each person is made of ~1014 (3.72x1013) cells, or 109 lipids/cell x 1014
cells/person = ~1023 lipids/person!
LIPID MAPS Structure Database (LMSD)
http://www.lipidmaps.org
Number of lipids per category
Fatty acyls 6954
Glycerolipids 7542
Glycerophospholipids 9387
Sphingolipids 4352
Sterol lipids 2833
Prenol lipids 1257
Sacccharolipids 1293
Polyketides 6742
TOTAL 40,360 structures
Děkuji Vám za pozornost