Průtoková cytometrie
flow cytometry (FCM)
Bi6589 Laboratorní a bioinformatické metody rostlinné
biosystematiky
Průtoková cytometrie
Měření optických vlastností malých částic, které jsou uvedeny do
pohybu.
Fluorescence
(Excitace/emise)
Zástin paprsku;
Rozptýlené světlo =
Forward scater
Odraz paprsku;
Boční světlo =
Side scater
Optické vlastnosti částic
Částice: pylová zrna, mikroorganismy, buňky, buněčná jádra, apod.
Průtoková cytometrie
Black box
Informace
Průtokový cytometr
Průtoková cytometrie
Black box
Informace
Srdce cytometru = průtoková kyveta
Funkce průtokové kyvety
• Separace částic v proudu unášecí kapaliny
• Počátek měření optických vlastností částic
• Velikost částic: 0,2-200µm
zesilovač
laser
detektor
fluorescence
zapisovač
značená jádra vzorku a standardu
unášecí tekutina
vzorková
tryska
menší částice
větší částice
pozice vzorku x hmotnost jader standardu (pg)
hmotnost jádra vzorku (pg) = ---------------------------------------------------------------------
pozice standardu
pozice
standardu
pozice
vzorku
Osa x ≈ intenzita
flurescence
Co se děje v průtokové kyveta?
Základní výhoda cytometru: rychlá analýza velkého množství částic
hydrodynamická
fokusace
fluorescence
Pojmy
Osa X = optické vlastnosti částic
OsaY=početčástic
Přesnost měření je stanovená pomocí variačního koeficientu (CV).
směrodatná odchylka
CV = x 100
průměrná pozice píku
Standard = organismus
se známou velikostí
stanovovaných hodnot
(velikost genomu, GC
obsah, atd.)
Fluorescenční barvy
Způsob navázání: neselektivní (PI, EB); selektivní na AT báze (DAPI, DIPI,
Hoechst); preferující GC báze (některá antibiotika)
Excitační a emisní vlnová délka
Pojmy
Excitation: green laser
536 nm
Propidium iodide (PI)
617 nm
Fluorescence
Day Factor (DF)
Důležitý pro výpočet GC obsahu; poměr poměrů (vzorek/standard(DAPI) ku
vzorek/standard(PI))
Hodnoty velikosti genomu
Holoploidní velikost genomu
1C – v buňkách s n chromozomy (mechorosty, pyl)
2C – v buňkách s 2n chromozomy (somatické buňky)
Monoploidní velikost genomu
1Cx – průměrná velikost jedné chromozomové sady
Jednotky: 1pg = 978 Mpb
Pojmy
Standardy
Druh 2C (Mbp) 2C (pg) GC %
Carex acutiformis 799,9 0,817 36,4
Bellis perennis 3089,8 3,159 39,5
Pisum sativum 'Ctirad' 7841,2 8,017 41,7
Vicia faba 'Inovec' 23272,8 23,796 41,1
Jak se připravuje vzorek pro cytometrické
stanovení velikosti genomu?
Co odebírat
Živý materiál (nejčastěji list)
Semena
Vzorky ze silikagelu/herbáře
Pyl
K čemu přihlížet při odběru
ontogenetické stáří
intenzita oslunění a množství sekundárních metabolitů
způsob uchování vzorku (semena vs. pletivo)
Volitelné
Extrakční pufr
Standard
Příprava rostlinného materiálu k měření
4. přidáme fluorochrom3. zfiltrujeme do zkumavky1. pufr + kousek listu 2. posekáme žiletkou
5. zkumavku zasuneme do stroje
Velikost genomu – příprava vzorku
Doba přípravy a měření vzorku: 10 minut
Cena měření: 15 Kč
Jak hmotnost DNA v jádře změřit?
Sekvenace celého
genomu
Průtoková
cytometrie
zdlouhavá rychlá
levnádrahá
jednoduchásložitá
živý materiálživý/sušený/zamražený
materiál
K čemu je to dobré?
Průtoková cytometrie
Měření optických vlastností malých částic, které jsou uvedeny do
pohybu.
Fluorescence
(Excitace/emise)
Zástin paprsku;
Rozptýlené světlo =
Forward scater
Odraz paprsku;
Boční světlo =
Side scater
Optické vlastnosti částic
Částice: pylová zrna, mikroorganismy, buňky, buněčná jádra, apod.
Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní
chromozomy)
Velikost genomu
GC obsah
Ploidní úroveň (cca karyotyp)
Endopolyploidizace (zásobní orgány)
Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení
chromozomů)
Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů
K čemu je to dobré?
půdní měňavka
Chaos chaos
půdní měňavka
Chaos chaos
Jádro váží
0,0023 pg
Jádro váží
1400 pg
Jádra se liší 600 000 krát !!!
Diverzita genomů
Střevní parazit
Encephalitozoon intestinalis
Slunce a Země se hmotnostně liší
„jen“ 330 000 krát !
Země
Slunce
Trpaslík
Obr
Archilochus alexandri 0,9 pg
kolibřík černobradý
Struthio camelus 2,2 pg
pštros dvouprstý
2,4x
U mnohobuněčných organizmů rozdíly často menší
Ptáci
Existují i opačné případy – extrémních rozdílů
300 pg
Paris japonica
Genlisea
aurea
0,1 pg
3000x
krytosemenné rostliny
Holocentrické chromozomy
Monocentrické chromozomy
Rostoucí nestresovaná rostlina
UV záření
Holocentrický vs. mononocentrický chromozom?
Rozrůznily se velikosti genomu náhodně
nebo adaptivní evolucí?
velké jádro se do malé buňky nevejde velké průduchy se nemohou rychle zavřít
velký pyl se se hůř transportuje velká jádra se pomalu dělí
Velikost genomu ovlivňuje vlastnosti organizmů
Proč se Mendelův hrách nestal modelem
současných genetiků ?
Má genom moc velký !!! 9 pg
Druh s malým genomem = ideální model pro
genetiku !
Znalost velikosti genomu má i metodické důsledky
Arabidopsis thaliana
1C = 0,32 pg
Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní
chromozomy)
Velikost genomu
GC obsah
Ploidní úroveň (cca karyotyp)
Endoreduplikace (zásobní orgány)
Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení
chromozomů)
Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů
Souvislosti
Ekologické (odolnost k mrazu, rychlost ontogeneze, pravděpodobnost invazibility)
Fenologické (nástup kvetení)
Fyziologické (velikost buněk)
Metodické (vytypování organizmů pro sekvenování)
K čemu je to dobré?
SEX? Koho to zajímá?!
Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní
chromozomy)
Velikost genomu
GC obsah
Ploidní úroveň (cca karyotyp)
Endoreduplikace (zásobní orgány)
Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení
chromozomů)
Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů
Souvislosti
Ekologické (odolnost k mrazu, rychlost ontogeneze, pravděpodobnost invazibility)
Fenologické (nástup kvetení)
Fyziologické (velikost buněk)
Metodické (vytipování organizmů pro sekvenování)
Sex
Způsob rozmnožování (sexuálové vs. apomikti)
Mezidruhová hybridizace (identifikace hybridů; rozdíl mezi rodiči >10%)
Šlechtění (experimentální hybridizace a polyploidizace; výběr a pěstování
hybridních jedinců)
K čemu je to dobré?
Způsob rozmnožování
Apomixie = nepohlavní rozmnožování
pomocí semen
Mezidruhová hybridizace a polyploidizace
R1
R2
F1
Šmarda et al. 2018; Ginkgo biloba
Další aplikace průtokové cytometrie
– třídění spermií
– diagnostika leukémie a jiných
hematologických chorob
– diagnostika AIDS
– pylová viabilita