Alois Kozubík
SIGNALIZACE A LIPIDOVÝ METABOLISMUS
Obecnější principy a jejich aplikace
v buněčné fyziologii;
Spolupůsobení látek různé chemické povahy
Buněčné signalizace obecněji s důrazem na úlohu
fosfolipidů a jejich metabolitů
-
-
1
Shrnutí a doplnění
probraného učiva
(obecnější východiska a modely)
2
Které faktory, a jak mohou modulovat
dělení, diferenciaci a zánik buněk?
???Dochází k tomu změnami
- exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu (transdukci)
signálů přímo regulujících proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt
včetně exprese protoonkogenů a nádorově-supresorových genů,
- signálů, které tyto funkce ovlivňují do určité míry nepřímo,
jako jsou posttranslační změny, inhibice mezibuněčných spojení,
ovlivnění funkce enzymů reparujících DNA, metylace DNA,
metabolismus apod.
(na různých úrovních organizace
buněčných systémů)
3
Buněčný metabolismus
složitost vs. jednoduchost
speciální vs. obecnější
4
???
Čtyři nejdůležitější skupiny
malých organických molekul v buňkách
V buňce (buněčných signalizacích a metabolismu)
spolupůsobí látky různé chemické povahy
+ ionty atd..
5
Buňky prostoupeny membránovými systémy
tvořenými z velké části
fosfolipidy
Golgiho komplex slouží
k transportu, přechovávání a
posttranslační modifikaci proteinů,
navazování a odstraňování nebílkovinných
(zejména cukerných) složek, syntéze
polysacharidů a imunoglobulinů, tvorbě
váčků využívaných při exocytóze.
Drsné endoplazmatické retikulum:
syntéza některých bílkovin, oligomerizace
proteinů, rozklad poškozených bílkovin.
Hladké endoplazmatickém retikulum:
odstraňování toxických látek, některé části
metabolismu lipidů a metabolismu hemu,
regulované uvolňování Ca2+ iontů.
Cytoplazmatická membrána: semipermeabilní obal
ohraničující vnitřek buněk od vnějšího prostředí a kontrolující
pohyb látek do buňky a ven z buňky. Je selektivně permeabilní
pro ionty a organické molekuly.
Chrání buňku před vnějšími vlivy.
Podílí na různých buněčných procesech jako buněčná adheze,
výměna iontů, buněčných signalizacích.
Skládá se z lipidové dvouvrstvy se zakotvenými
proteiny, glykoproteiny, cholesterolem, sfingolipidy.
6
MEMBRANOVÉ
SYSTÉMY
a buněčné
kompartmenty
protientropické
důsledky
STRUKTURNÍ ÚLOHA
FOSFOPIDŮ v BUŇKÁCH
a BUNĚČNÉ FUNKCE
7
Funkčně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek).
Důsledkem je kompartmentalizace – vznik a existence kompartmentů.
V důsledku toho jsou prvky (složky), např. látky, buňky atd.,
nerovnoměrně rozmístěny.
Příklady
Všechny membránami ohraničené struktury mají své „vnitřní prostředí“.
Selektivně jsou v nich zadržovány určité molekuly proti koncentračnímu spádu.
Některé reakce tak proběhnout mohou, jiným může být zabráněno.
Tato protientropická distribuce molekul a buněčných struktur,
směřující proti neuspořádanosti, má velký význam pro buněčný metabolismus
a regulace.
Základem pro tento stav je existence buněčných membrán,
jeden ze základů existence biologických systémů.
Kompartmenty
8
PC - fosfatidylcholin
diC 16 – k. palmitová
diC 18:2 – k. linoleová
chol - cholesterol
Dynamický charakter biologických membrán - model
Znázorněna je dynamika „samoorganizačních schopností“
modelového systému (v µs) vytvářet membránové
struktury ve vodném prostředí, jsou-li dodány prekursory:
9
Dynamický charakter biologických membrán
(model) a lipidové rafty
Zajištění většiny biologických funkcí
se neobejde bez unikátních interakcí
lipidových komponent jako jsou VNMK,
fosfolipidy s dalšími biologicky
významnými molekulami.
VNMK jsou součástí
lipidových raftů:
membránových mikrodomén
obohacených o glykosfingolipidy +
cholesterol
Jejich modulace mohou významně měnit
intenzitu a také směr signálové transdukce
PC - fosfatidylcholin
diC 16 – k. palmitová
diC 18:2 – k. linoleová
chol - cholesterol
Červená – nenasycené lipidy
Zelená - nasycené lipidy
B, D, E - planární rozložení
C - liposom
10
Prerkursory:
Struktura fosfolipidů a jejich orientace v plasmatické membráně
11
Mastné kyseliny - struktura
C-16
(k. palmitová)
12
Phospholipases (PL)
Estery - Kyselina + alkohol (-OH skupina karboxylové kyseliny nahrazena organickým zbytkem
vzniklým z alkoholu po odštěpení vodíku z OH skupiny).
Amidy - náhradou skupiny OH karboxylové skupiny za amidovou skupinu NH2.
PLA-2
PLA-1
PLC
PLD
Složení fosfolipidů a jejich
štěpení fosfolipázami (PL)
13Molecular Biology of the cell, 4th Edition
14
No phosphate
Fyzikálně-chemické vlastnosti
fosfo- a glykolipidů dovolují
ve vodném prostředí vzniknout
strukturám membránového
charakteru na samoorganizačním
„self-sealking“ principu.
Další formy lipidů
Molecular Biology of the cell, 4th Edition
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
15
Efekt koncentrace mastných kyselin (VNMK)
na proliferaci krvetvorných nádorových buněk
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
16
Efekty koncentrace mastných kyselin na proliferaci
krvetvorných nádorových buněk (vliv peroxidace lipidů)
17
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
Efekty koncentrace mastných kyselin na proliferaci
krvetvorných nádorových buněk (vliv prostaglandinů)
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
VLIV KONCENTRACE NENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN (VNMK)
NA PROLIFERACI NÁDOROVÝCH BUNĚK – shrnutí (do r. 1985)
(„FATTY ACID PARADOXES“ )
Efekty závisí na koncentraci
U modelových krvetvornývh (nádorových) populací
mohou VNMK generovat jak + , tak – signál na proliferaci
18
Spektrum eikosanoisů
19
N-6 (CH3)
Čtyři cesty přeměny AA na své metabolity eikosanoidy
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
20
MEMBRÁNOVÉ POSFOLIPIDY
CYCLOOXYGENÁZY EPOXYGENÁZY
(P450)
LIPOXYGENÁZY
CH2
CH CO NH CH2
COOH
NH
COCH2CH2CHCOOH
NH2
C5H11
OH
S
COOH
COOH
LTA4
LTF4
LTE4
LTD4
LTC4LTB4
EPOXYKYSELINY,
DIOLY, etc.
TXB2
TXA2 PGI2 PGD2 PGE2
PGH2
PGG2
LTC4:
PLA2
O
OH
COOH
OH
PGE2:
METABOLISMUS KYSELINY ARACHIDONOVÉ
21
Hlavní osy biosyntézy
eikosanoidů.
Metabolity hlavních směrů
přeměny jsou barevně odlišeny:
COX (fialově),
5-LOX (oranžově),
15-LOX (zeleně),
12-LOX (žlutě),
CYP epoxygenázy (červeně),
CYP ω-hydroxylázy (modře),
nenzymatická oxidace (šedě)
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
22
Rozšířené schéma hlavních směrů biosyntézy eikosanoidů.
PG nomenclature and structure. Arachidonic acid carbons are numbered 1–20,
starting from the carboxylate. The prostaglandin letter indicates composition of the
prostane ring, with PGH2 as an example.
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
23
STRUKTURY METABOLITŮ KYSELINY ARACHIDONOVÉ (AA)
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktury metabolitů AA, jejichž vznik je katalyzován cytochromy P450
24
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktury metabolitů AA, jejichž vznik je katalyzován 12-lipoxygenázou
25
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
(cystein)
LTC4
(peptidoleukotrieny)
Struktura metabolitů AA (peptidoleukotrien C4 a Lipoxin (LXA4)
26
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktura metabolitů AA (peptidoleukotrien C4 a Eoxinoxin (EXC4)
27
Examples of LTB4 metabolism by β-oxidation, CYP ω-hydrolases, and
glucuronidation.
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Příklad metabolismu LTB4
CYP ω – hydrolasa
CYP ω – hydrolasa
β - oxidace
glucuronidace
Glukuronidace - konjugace s kyselinou glukuronovou (glukosiduronovou).
Je to děj lokalizovaný v největším počtu tkání a orgánů.
Má největší spektrum xenobiotik, se kterými vytváří konjugáty.
To zvyšuje polárnost a rozpustnost substrátu ve vodě, což ulehčuje detoxikaci
a vylučování. 28
receptory
růstové signály
molekuly
signálové
transdukce
molekuly
zesilovací
kaskády
regulátory
transkripce
cykliny
CDKs
p27
p21
p16
p15
+
Transdukce
(přenos) signálů
„klasické“ schéma s. transdukce
29
Transdukce (přenos) signálů
Membránové
receptory
Růstové signály
hygrofilní povahy
(proteiny, katecholaminy, apod.)
molekuly
signálové
transdukce
molekuly
zesilovací
kaskády
regulátory
transkripce
cykliny
CDKs
p27
p21
p16
p15
Lipofilní regulátory
Jaderné
receptory
Způsob signalizace odvislý od chemické podstaty ligandů
30
Představuje zákonitě koordinovanou (a nesmírně rychlou) souslednost dějů
(reakcí) vedoucích od vnější plasmatické membrány (návázání regulátoru
-ligandu- na plasmatickou membránu anebo průchod regulátoru touto membránou)
přes cytosol k jádru (expresi genetické informace).
Jedná se o PŘENOS INFORMACE.
Výsledkem je zabezpečení všech fyziologických funkcí buněk a organismu
včetně regulace cytokinetiky (proliferace, diferenciace a smrti buněk v čase).
Procesu se účastní řada regulátorů různé chemické povahy.
Charakter přenosu signálu se odvíjí se od specifické chemické struktury
jednotlivých komponent dané signální dráhy.
Podstatou je změna konformace molekul (souslednost změn konformací).
Jeden z principiálních rozdílů způsobu signalizace spočívá zejména v tom,
zda má daný regulátor povahu hygrofilní (lipofóbní) anebo hygrofóbní (lipofilní).
Transdukce (přenos) signálů - podstata
31
Receptorem zprostředkovaná dráha aktivace
(naznačení sousledností konformačních změn)
32
PŘÍKLADY - ENZYMY
33
Podstatou je
změna konformace
Substrát přesně zapadne do lůžka v molekule enzymu.
V tomto lůžku ho poutají různé typy sil:
hydrofobní (modrá), přitahování opačně nabitých
skupin (zelená v substrátu a červená v lůžku),
vodíkové můstky. Štěpená vazba se tím dostane mezi
„nůžky“ silně polárních skupin (např. karboxylů).
Při „vyvolaném přizpůsobení“ je
enzym teprve domodelován silami, které
poutají substrát k jeho lůžku.
Jak vzniká komplex substrát – enzym
Substrát Enzym
34
Alosterická aktivace enzymu.
Enzym sám
není schopen rozštěpit
substrát, neboť jeho
molekula nemá
správný tvar.
Teprve naváže-li se
na jiné místo regulační
molekula (hnědá
zprava),
než se váže substrát,
získá funkční formu.
regulační
molekula
substrát
enzym
35
Regulační molekula se připojuje opět na jiném místě molekuly enzymu,
než kam se váže substrát.
Tím se liší od pouhého blokování lůžka, které může způsobit látka podobná
substrátu (soutěživá čili kompetitivní inhibice).
Alosterická inaktivace patří k regulačním pochodům. Může ji vyvolat jen
zcela určitá látka, ta, která svými vlastnostmi přesně odpovídá místu, na
které se váže.
enzym
Regulační molekula
Alosterická inaktivace enzymu.
36
A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993
37
Struktura izoforem protein kinázy C (PKC) - schéma
A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993
Model aktivace protein kinázy C
38
Buněčné signalizace
obecněji
s důrazem na
metabolismus fosfolipidů
39
P. Cohen: TIBS, 17 (10), 408–413, 1992
Pět základních signálních systémů, které fungují
v eukaryotických buňkách – základní schéma
40
41
Pět mezibuněčných paralelních signálních drah
aktivovaných receptory svázanými s G-proteiny,
tyrozin kinázovými receptory nebo oběma typy
CSF-1
c-fms
PKC?
e.g.u-PA, JE, KC
β actin,
fibronectin R (β)
hck, frg, fos, jun,
myc G1 cyclins
DNAsynthesis
mRNA
nucleus
?
Glucose
?
K+
Na+
Na+
H+
PKC
tyr tyr-P
receptor substrates
e.g. PI-3 kinase
G proteins
(ras/GAP?)
other effectors e.g.
RAF-1 kinase
Fluid-phase
pinocytosis
phospholipids phospholipases
DAG
? ?
42
Growth factor
Receptor
DNA synthesis
Transducer
Effector
2nd messenger
Target
Regulatory proteins
RNA/protein synthesis
Tyrosine kinase
abl
erb
B2/neu
fes/fps
fgr
fyn
kit
lck
met
ret
sea
src
trk
yes
Nuclear
fos
jun
myb
myc
ski
Serine kinase
mil/raf
mos
pim-1
pks
raf
rel
G protein
rab
ral
ras
Receptor
bek
erb B
fkg
fms
mas
ros
Growth factor
fgf-5
hst
sis
int-2
MEMBRANECYTOSOLNUCLEUS
Receptor Receptor Receptor Receptor
Receptor
tyrosine
kinase
G protein
PLCγ
G protein G protein
PLA2 Adenylyl-
cyclase
Na+/H-
antiport
[pH]i
?
cAMP
PKA
Arachidonate
PG TX
Calmodulin
DG IP3
PKC PK (?)
[Ca2+]i
Oncogenes
podle: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991
43
Jednotlivé úrovně signálních kaskád s naznačením zapojení
fosfolipidových komponent
Kaskáda proteinových kináz v přenosu signálů
v propojení se složkami fosfolipidového metabolismu
Ca 2+ Ca 2+
Ca 2+
ATPase
PIP2
DAG
Ca 2+
PLC
RSRS
G
PKC
sm
ACTIVATIVACE CÍLOVÝCH PROCESů
protein
phosphorylation
kináza
kináza kináza
kinázakinázakinázakináza
PKC
Zesílení signálu
44
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROS
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
mRNA
RE
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFAn-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonovákyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROSROS
lipidová
peroxidace
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
(stresory)
Změny
metabolismu,
buněčného růstu
diferenciace
a apoptózy
lipidové
rafty
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení ω-3 a ω-6 VNMK
(mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě)
45
PLA 2
PLA 2
P
receptor
growth factors
hormones
AA
- ion channel activity
- guanylate cyclase
- adenylate cyclase
protein kinase C
protein kinase A
tyrosine kinase
MAP kinase
G-proteins
cyclooxygenases lipoxygenases
CP450 monooxygenases
eicosanoid
s
transcription factors
gene expression cell
growth
+
According to: A. Sellmayer et al.:
Prostaglandins, Leukotrienes and
Essential Fatty Acids ;
57: 353 - 357, 1997.
46
Zjednodušené schéma úlohy eikosanoidů v buněčných signalizacích
Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy
(Shrnutí)
Fosfolipidy a zejména jejich složky
vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetně jejich metabolitů eikosanoidů,
patří mezi významné epigeneticky působící faktory schopné ovlivnit
jak dělení a zánik normálních,
ale i transformovaných buněčných populací,
tak proces maligní transformace.
Hlavní mechanismy působení PUFAs
1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů
významných z hlediska cytokinetiky
2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových regulátorů,
cytokinů a imunitní systém
3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů vznikajících peroxidací lipidů.
47
VŠECHNY HLAVNÍ
KOMPONENTY SPOLUPŮSOBÍ
Otázkou je charakter interakcí
48
Časové hledisko: efekt je závislý na délce působení
doba působení
49
V reálném prostředí jednotlivé faktory spolupůsobí
v různých koncentracích
(Použita vlastní data z: Eur. J. Pharmacol. 316, 349–357, 1996)
Příklad interakce dvou faktorů
inhibujících proliferaci
epiteliálních buněk CCL64 (%)
(Esculetin = Faktor 1) a (TGF-β1= faktor 2)
Synergické působení a nelineární
charakter odpovědi jsou zjevné po
kombinaci vyšších koncentrací obou
faktorů.
50
Interakce závisí na
koncentraci látek a mohou
mít různý charakter
(antagonistický, aditivní,
synergický)
Jednotlivé signální dráhy
bývají mezi sebou propojeny.
Mohou interagovat, „spolupůsobit“.
51
Obecné schéma aktivace rec. TKs
(zde na příkladu EGFR)
1. ligand se specificky váže
na receptor
2. receptor dimerizuje
3. tyrosin-kinázové domény
se navzájem fosforylují
4. autofosforylace vede k
navázání (recruitment)
adaptérových proteinů
(zde Grb2)
5. v závislosti na receptoru
se aktivují „downstream“
signální dráhy – zde
např.
Ras/Raf1/MEK/MAPK
kinázová dráha,
6. která vede k regulaci
transkripce
52
https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_signaling
Ukázka propojení některých klíčových signálních drah
Key components of a signal transduction pathway (MAPK/ERK pathway shown)
Zpětnovazebná
inhibice proliferace
EGF ?
53
EGF: epidermální růstový faktor, PLA2: fosfolipáza A2, AA: kyselina arachidonová, 5-LOX: 5-lipoxygenáza, 5HETE: 5 hydroxykyselina,
LTA4, C4: leukotrien A4, C4, PKC: protein kináza C, DAG: diacylglycerol, PIP2: fosfoinositoldifosfát, PLC: fosfolipáza C,
Tyr K: tyrosin kináza
Ca 2+
Ca 2+
Ca 2+
Ca 2+
AA 5HETE LTC4LTA4 PIP2DAG
Tyr-K Tyr-K
PLA2 5-LOX
PKC PLC
+
Nuclear responses
EGF EGF
Přenos signálu Epidermálního Růstového Faktoru (EGF)
modulovaný metabolity kyseliny arachidonové (AA)
Podle:Peppelenbosh et al.:Cell, Vol. 69, 2, 1992, 295-303
54
55
Příklad propojení (Wnt dráha a její modulace eikosanoidy)
Propojení
signálních drah
Nadměrná produkce PGE2 podporuje v žaludku a kolonu vznik nádorů
Lze ovlivnit
56
NSAIDs mohou účinkovat i na jiné typy nádorových buněk
Vlastní výsledky - Příklad praktického využití NSAIDs
Působení NSAIDs na
nádorové buňky in vivo
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Doba přežití (týdny)
% Přežití
Kontrola
Dicloph 0.15 mg p<0,01
Dicloph 0.5 mg p<0,05
Ibuprof 0.5 mg
Ibuprof 0.15 mg p<0,01
Flurbiprof 0.5 mg
Flurbiprof 0.15 mg p<0,05
NSAIDs inhibují COX2 a působí protizánětlivě
PŘEŽÍVÁNÍ ZVÍŘAT
s nádorem
(fibrosarkom G:5:113)
PO TERAPII INHIBITORY COX-2
57
Inhibitory COX-2
tlumí zánět a inhibují proliferaci
některých typů nádorových buněk
K zamyšlení
strukturu biologických membrán a co jsou tzv. lipidové rafty?
Co je „transdukce signálů“ (molekulární podstata) a jakým způsobem
dochází k multiplikaci signálů? Obecné principy.
Úlohu lipidů a fosfolipidů obecněji, jejich význam pro regulaci
buněčných procesů a pro organismus (včetně úlohy v energetickém
a intermediárním metabolismu)?
Metabolismus kyseliny arachidonové (AA) a hlavní dráhy přeměny?
Co můžete odvodit z její struktury a ze struktury jejich metabolitů?
Nakreslit tyto struktury (AA, LTC4, PGE atd.)? Nakreslit schéma
libovolného fosfolipidu a vyznačit místa jeho štěpení fosfolipázami
s uvedením jejich názvů?
Molekulární mechanismy působení konkrétních vysoce nenasycených
mastných kyselin (n-3, n-6) a eikosanoidů, jejich fyziologickou úlohu?
Spolupůsobení látek různé chemické povahy a propojení jednotlivých
signálních drah? Uveď příklady.
58
Dovedeš popsat a vysvětlit
Děkuji za pozornost
59