Buněčná smrt Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot 21.11.2019 Jan Šmarda Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU 2 Umírání je přirozené • každý den v našem těle odumírají desítky miliard buněk • každý rok odumře a vymění se tolik buněk, kolik odpovídá zhruba počtu buněk v celému těle • zdravá buňka je vždy připravena zemřít, sebedestrukční mechanismus se spustí pouhou absencí signálů „pro-survival“ 3 Buněčná smrt • přirozený jev, jehož výsledkem je nevratné ukončení funkcí buňky, jako jsou růst, dělení a metabolická homeostáze Programovaná • zprostředkovaná specifickým signálním systémem • prospěšná pro organismus, jehož je umírající buňka součástí • popsána u rostlin i mnohobuněčných živočichů Neprogramovaná (nekróza) • nastává neregulovaně z vnějších příčin • otok a rozpad buňky • zánět 4 Typy buněčné smrti • apoptóza: zprostředkovaná kaspázami během vývoje, stárnutí nebo jako odezva na specifické podněty • autofagie: rozklad buněčných složek v lysosomech • excitotoxicita: smrt nervových buněk v důsledku přílišné aktivace receptorů pro nervové přenašeče • anoikis: důsledek poruchy interakcí, které buňku ukotvují v matrix • nekróza: indukovaná nespecifickým traumatem • nekroptóza: nekróza s prvky regulace indukovaná specifickým stimulem, bez účasti kaspáz, spoluúčast kináz RIP, pomoc při obraně proti patogenům 5 Apoptóza: • přirozená a programovaná eliminace nepotřebných nebo poškozených buněk • postihuje jednotlivé buňky • vyžaduje energii • zmenšení buňky • mitochondrie dlouho intaktní • integrita membrán nepoškozena • postupný rozklad buněčných struktur • kondenzace chromatinu • fragmentace jádra • odbourání cytoskeletu • fragmentace DNA mezi nukleozomy • pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami Nekróza: • nepřirozený proces • obvykle důsledek zranění • postihuje současně soubory buněk • bez požadavků na energii • zvětšení buňky • poškození mitochondrií • poškození membrán • celková dezintegrace • uvolnění nitrobuněčných komponent • fagocytóza odumřelých buněk neutrofily a makrofágy • vznik zánětu 6 7 Historie objevu buněčné smrti • objevitelem principu je německý vědec Karl Vogt (1842) studující metamorfózu obojživelníků • přesnější vhled: Walther Flemming (1882) zdůrazňuje fyziologickou povahu buněčné smrti • strukturní změny doprovázející apoptózu a odlišnosti od nekrózy popisuje australský patolog John Kerr (1972) • molekulární mechanismus odhalují Sydney Brenner, Robert Horvitz a John Sulston (Nobelova cena 2002) John Kerr (*1934) 8 Význam apoptózy • embryonální vývoj • tvorba nervových spojení • formování orgánů („sculpting“) • udržování homeostáze • fyziologické funkce u dospělých orgánů (retrakce mléčné žlázy) • eliminace poškozených nebo geneticky aberantních buněk (reakce na silné, neopravitelné poškození genomové DNA, extrémní kyslíková deprivace, významná signální nerovnováha, apod.) 9 Apoptóza a formování orgánů • apoptózou jsou během morfogeneze odstraňovány nežádoucí buňky – tvorba funkčních tkání a orgánů • geneticky pozměněné myši, které postrádají klíčové složky apoptotického aparátu vykazují typické vývojové poruchy: nadbytek neuronů v mozku, obličejové abnormality, poruchy formování prstů, atd. 10 Apoptóza a likvidace nežádoucích buněk nežádoucí jsou všechny buňky představující riziko pro integritu organismu: • buňky infikované viry • buňky s poškozenou DNA • buňky s nahromaděnými chybně složenými proteiny • nádorové buňky 11 Nežádoucí procesy spojené s deregulovanou apoptózou • přílišná apoptóza poškozuje tkáně (degenerativní procesy) • nedostatečná apoptóza buňky predisponuje k hromadění genetických poruch a tvorbě nádorů 12 Induktory programované buněčné smrti • vývojové signály • nedostatek základních růstových faktorů a živin • vysoký stupeň poškození DNA • teplotní šok, ionizující záření a jiné stresové podněty • infekce virem • buňky imunitního systému, které splnily svou úlohu • ztráta přichycení k substrátu (anoikis) • útok cytotoxickým lymfocytem 13 Průběh apoptózy https://www.youtube.com/watch?v=NwkHcwIoBRg https://vimeo.com/173473536 14 Průběh apoptózy • jádro: zahuštění a fragmentace • plazmatická membrána: vychlípeniny 15 Průběh apoptózy • chromozomová DNA: štěpení mezi nukleozomy • snadná detekce agarózovou elektroforézou Intaktní DNA „Žebříček“ fragmentované DNA 16 Markery apoptózy • aktivace DNázy - internukleozomální fragmentace DNA • dimerizace proteinů rodiny Bcl-2 • uvolnění cytochromu c • aktivace kaspáz • translokace fosfatidylserinu • přetrvávající produkce ATP • absence zánětu 17 Detekce apoptózy Fragmentaci DNA např. technikou TUNEL (Terminal deoxynucleotide transferase dUTP Nick End Labeling) • připojení značených „bromovaných“ nukleotidů Br-dUTP k volným 3´OH koncům fragmentované DNA terminální deoxynukleotidyl transferázou • detekce nukleotidů Br-dUTP začleněných do DNA značenou monoklonální protilátkou • detekce průtokovou cytometrií nebo imunohistochemicky 18 Detekce apoptózy Změna pozice fosfolipidu fosfatidylserinu • složka buněčných membrán • nese záporný náboj • v plazmatické membráně není rozložen rovnoměrně, ale jen ve vnitřní vrstvě • umístění ve vnější vrstvě membrány nastává u apoptotických buněk a představuje signál pro makrofágy, aby je pozřely • detekce pomocí Annexinu V (který se na PS váže) konjugovaného s fluorescenční značkou fluorescenční mikroskopií nebo průtokovou cytometrií 19 Zakončení apoptózy apoptotická tělíska pohlcena fagocytózou 20 Objev mechanismu apoptózy v 80. letech 20. stol. na modelu C. elegans (Háďátko obecné) Robert Horvitz, John Sulston, Sydney Brenner Nobelova cena 2002 21 Objev mechanismu apoptózy Horvitz a kol. • odhalení mutace ced-1 u vyvíjející se larvy, která brání odstranění mrtvých buněk • následuje objev mutace ced-3 u mutantů ced-1, která brání buněčné smrti • gen ced-3 kóduje kaspázu - klíčový enzym apoptózy 22 V apoptotické signalizaci se uplatňují tři skupiny proteinů • regulátory • adaptéry • efektory 23 Kaspázyvýkonné složky apoptózy • cysteinyl aspartát-specifické proteázy (cystein je přítomen v aktivním místě enzymu; kyselina asparagová je přítomna v cílovém místě štěpeného substrátu) • syntetizovány jako inaktivní zymogeny – prokaspázy • obsahují N-koncovou pro-doménu, malou a velkou podjednotku • aktivují se odštěpením pro-domény 24 Kaspázy • degradují klíčové buněčné struktury • mohou se uplatnit jako iniciátory i efektory • dosud známo 13 členů rodiny kaspáz, které se dělí na iniciační, exekuční a zánětové 25 Iniciační kaspázy 2, 8, 9, 10 • velká pro-doména na N-konci pro meziproteinové interakce • fungují jako iniciátory procesů buněčné smrti – aktivují exekuční kaspázy • v inaktivní formě monomerní • při aktivaci pomocí adaptérových molekul dimerizují 26 Exekuční kaspázy 3, 6, 7 • malá pro-doména na N-konci • aktivují se štěpením ve specifických místech – vytvoří se přístupné aktivní místo • štěpí různé substráty, které přímo způsobují morfologické a biochemické změny v apoptotických buňkách 27 Příklady substrátů exekučních kaspáz • FAK (focal adhesion kinase): stimuluje adhezi buněk • jaderná lamina (kondenzace chromatinu a pyknóza jádra) • aktin, plektin, vimentin, gelsolin (intermediární filamenta): kolaps cytoskeletu a tvorba vychlípenin plazmatické membrány: tvorba apoptotických tělísek • inhibitor kaspázou-aktivované DNázy (ICAD) uvolňuje DNázu CAD (caspase-activated DNase), která pak fragmentuje DNA • proteiny související s regulací buněčného cyklu (Wee1, cyklin A), replikací (topoizomeráza I), transkripcí (Sp-1), signalizací (kináza C) • enzymy zapojené do opravy DNA 28 Jak jsou kaspázy aktivovány? specifickými induktory: • vnitřními podněty: abnormalitami ve struktuře DNA, nitrobuněčným stresem • vnějšími podněty: absencí růstových faktorů, přítomností specifických cytokinů aktivujících receptory smrti (TNF, ligand Fas) • vysokou teplotou, zářením, chemickými látkami geneticky naprogramovanými jevy v průběhu embryogeneze 29 Dvě signální dráhy apoptózy: vnitřní a vnější vnitřní dráha vnější dráha cytochrom c receptory smrti kaspázy kaspázy buněčná smrt buněčná smrt 30 Signální dráhy apoptózy • mitochondriální (vnitřní) aktivovaná změnou permeability vnější mitochondriální membrány • receptorová (vnější) aktivovaná vazbou ligandů smrti na příslušné membránové receptory 31 Vnitřní signální dráha • jádrem jsou mitochondrie a cytochrom c obsažený v prostoru mezi vnější a vnitřní membránou • kritická je translokace cytochromu c do cytozolu 32 Cytochrom c • mitochondriální protein zapojený do dýchacího řetězce jako elektronový přenašeč • permeabilizovanou vnější membránou mitochondrie proniká z mezimembránového prostoru do cytozolu • váže se na Apaf-1 („Apoptotic protease activating factor“) • Apaf-1 mění konformaci - vazba dATP • vazbou dATP se konformace Apaf-1 mění znovu, obnaží oligomerizační doménu 33 Cytochrom c • 7 molekul Apaf-1 se spojuje do komplexu - apoptozomu • apoptozom váže iniciační prokaspázu 9 • molekuly prokaspázy 9 se v apoptozomu dostávají do těsné blízkosti, následkem je jejich aktivace • aktivovaná kaspáza 9 aktivuje exekuční kaspázy (kaspázy 3 a 7) • štěpením svých substrátů navodí běžné morfologické a biochemické znaky apoptózy 34 Co rozhoduje o uvolnění cytochromu c? • proteiny rodiny Bcl-2 (první z nich objeven u lymfomu B-buněk) • 6 anti-apoptotických („pro-survival“) členů • 18 pro-apoptotických členů 35 Proteiny Bcl-2 tvoří dimery • pomocí domény BH3 homo- nebo heterodimerizují • homodimery Bax indukují apoptózu • heterodimery Bcl-2/Bax inhibují apoptózu • poměry faktorů „pro-death“ a „pro-survival“ rodiny Bcl-2 rozhodují o životě a smrti buněk 36 Vnitřní signální dráha • apoptotický signál způsobí změnu permeability vnější mitochondriální membrány pomocí proteinů rodiny Bcl-2 • proteiny Bcl-2 se účastní tvorby pórů v mitochondriální membráně • antiapoptotické proteiny rodiny Bcl-2 brání zvýšení permeability mitochondriální membrány, proapoptotické proteiny Bcl-2 (Bax, Bak) ji stimulují • cytochrom c permeabilizovanou membránou proniká do cytozolu 37 O smrti rozhodují proa anti-apoptotické proteiny • o tom, zda cytochrom c bude uvolněn rozhodují relativní hladiny pro- a antiapoptotických proteinů Bcl-2 na mitochondriální membráně • různé stimuly ovlivňují různé proteiny rodiny Bcl-2 • ústředními členy rodiny jsou pro- a antiapoptotické proteiny Bax a Bak • každý pro-apoptotický protein má svého opačně působícího partnera, který může jeho účinky neutralizovat 38 Vnější dráha apoptózy • aktivovaná vnějšími („death“) ligandy • registrace ligandů povrchovými receptory (rodina receptorů pro TNF) – Fas a TRAIL • receptory po aktivaci tvoří trimery • dva nebo tři trimery se prostřednictvím ligandů propojují • nitrobuněčné domény smrti těchto receptorů se tak aktivují – jsou schopny interakce s dalšími proteiny – např. adaptérovým proteinem FADD • FADD je následně schopen interakce s monomery prokaspázy 8 a zajistí jejich dimerizaci a aktivaci • iniciační kaspáza 8 aktivuje exekuční kaspázy 39 Receptory smrti • transmembránové proteiny schopné vyvolat apoptózu • napojují se na kaspázovou signalizaci 40 Apoptóza a p53 • poškození DNA, nedostatek růstových faktorů a další podněty mohou indukovat apoptózu zprostředkovanou p53 p53 se podílí na: • aktivaci exprese bax, kódujícího pro-apoptotický protein schopný uvolnit cytochrom c z mitochondrií a zajistit tak aktivaci kaspáz 9 a 3 • aktivaci exprese genu kódujícího receptor Fas, tím zvyšuje citlivost buňky k FasL • aktivaci exprese genu kódujícího IGF-binding protein 3 a jeho uvolnění do mimobuněčného prostoru, kde vychytává anti-apoptotické ligandy IGF-1 a IGF-2 41 42 Propojení vnitřní a vnější dráhy apoptózy 43 Apoptóza vyvolaná perforinem a granzymem B • oba proteiny jsou uvolňovány cytotoxickými T-buňkami Perforin • tvorba transmembránových pórů pro zajištění průniku granzymu do buňky Granzym B • štěpení efektorových prokaspáz (kaspáza 3) • štěpení inhibitoru DNázy CAD 44 Apoptóza: neurodegenerativní onemocnění • neurony jsou v postmitotickém stavu – nemohou se obnovovat, diferenciace z neuronálních kmenových buněk je neúčinná Indukce apoptózy neuronů • ztráta růstových faktorů (např. NGF) • ztráta správných spojení • poškození (zvláště oxidativní) Důsledky neuronální dysfunkce/poškození • ztráta synapsí • ztráta buněk Projevy • Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc, Huntigtonova nemoc, atd. 45 Apoptóza a rakovina • apoptóza eliminuje poškozené buňky (prevence rakoviny) • nádorový supresor p53 indukuje apoptózu v reakci na poškození buněk • většina nádorových buněk má díky mutacím narušenou schopnost vyvolat apoptózu poškozených buněk Riziko zvyšuje • vysoká hladina anti-apoptotických proteinů • nízká hladina pro-apoptotických proteinů 46 Apoptóza a rakovina leukemie B buněk a lymfomy • vysoká exprese Bcl-2 • důsledek translokace přenášející gen bcl-2 z chromozomu 18 do oblasti kódující těžké imunoglobulinové řetězce chromozomu 14 melanom • v kožních buňkách inhibována exprese genu kódujícího Apaf-1 47 Apoptóza a rakovina rakovina plic a střeva • některé nádorové buňky ve vysoké míře sekretují rozpustné návnadové molekuly, které se vážou k FasL, takže ztratí schopnost vazby na Fas receptor • schopnost indukce apoptózy slábne 48 Apoptóza a rakovina indukovaná viry lidské papilomaviry • zvyšují riziko rakovinu děložního čípku • důsledek přítomnosti virového proteinu E6, který váže a inaktivuje p53 virus Epstain Barrové (herpetický virus) • způsobuje mononukleózu a zvyšuje riziko některých lymfomů • kóduje protein podobný Bcl-2 • indukuje infikovanou buňku ke zvýšení produkce vlastního proteinu Bcl-2 49 Apoptóza - video • http://www.dnatube.com/video/1188/Apoptosis-animation • http://www.dnatube.com/video/4137/Apoptosis-process 50