Bi7090 Molekulární biologie eukaryot Akademický rok 2019/2020 Jan Šmarda & Jana Šmardová Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Obsah kurzu • kompartmentalizace buňky a intracelulární transport • molekulární biologie cytoskeletu • molekulární biologie extracelulární matrix • buněčný cyklus • interakce mezi buňkami a matrix • principy buněčné signalizace • řízená degradace proteinů v buňce • struktura chromatinu • mechanismy buněčné smrti • molekulární podstata nádorotvorných procesů 2 Doporučená literatura Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology Palgrave Macmillan Publ, 2016 3 Doporučená literatura Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell Taylor & Francis, Publ., 2015 4 1. přednáška: Kompartmentalizace buňky a intracelulární transport 19.9.2019 Osnova • význam kompartmentalizace eukaryontní buňky • transport proteinů jadernými póry • translokace proteinů přes membrány • vezikulární transport a sekreční dráha • endocytóza 6 Význam kompartmentalizace eukaryontní buňky soustředění specifických aktivit do vzájemně oddělených mikroprostředí podmínka funkce velkých eukaryontních buněk 7 Kompartmenty eukaryotických buněk 8 • specifická funkce vyžaduje specifické složení • nutnost zajištění správné distribuce nově tvořených proteinů – buněčný dopravní systém Výstavba organel 9 • kotranslační oddělení proteinů pro ER, Golgiho aparát, lysosomy, plazmatickou membránu a sekreci mimo buňku • proteosyntéza probíhá na ribozomech hrubého ER • pro transport využita sekreční vezikulární dráha • průběžné posttranslační úpravy První křižovatka - ER 10 • konečné umístění: cytozol, jádro, mitochondrie, chloroplasty, peroxisomy • translokace probíhá posttranslačně • využití adresových sekvencí Syntéza proteinů na volných ribozomech 11 • obousměrný Jaderný pór • komplex proteinů propojující obě vrstvy jaderné membrány • aktivní přenos specifických makromolekul • volná difúze menších molekul Transport jadernými póry 12 13 14 • komplex více než 100 proteinů • specifické stavební podjednotky: prstencová, sloupcová, luminální, anulární • laterální části: fibrily (cytoplazma), jaderný koš Struktura jaderného póru 15 • malé molekuly (<20 kDa) prostupují pórem pasivní difúzí • makromolekuly jsou přenášeny selektivně a vyžadují dodání energie Energetické nároky translokace do jádra 16 1. fáze • bez nároků na energii (ATP/GTP) • navázání proteinů obsahujících NLS k jadernému póru • rozpoznání NLS importinem - cytoplazmatickým receptorem, který se váže k jadernému póru • importin (karyopherin) – 2 podjednotky: importin α : vazba na NLS importin β : vazba k jadernému póru Transport do jádra (nuclear import) 17 2. fáze • závisí na dodání energie (ATP/GTP) • vlastní průchod jaderným pórem • rozdělení molekuly importinu na podjednotky • uvnitř jádra se k importinu váže malý G-protein Ran, který vyvolá jeho disociaci od nákladu Transport do jádra (nuclear import) Transport do jádra (nuclear import) 19 jeden ze způsobů řízení aktivity jaderných proteinů transkripční faktory fungují jen v jádře, zabránění importu jim nedovolí řádně fungovat Transkripční faktory NFκB řídí expresi genů důležitých pro imunitu, zánětlivou odpověď, buněčný růst, apoptózu, embryonální vývoj, atd. v cytoplazmě se tyto faktory spojují s regulačními proteiny, které jim pokryjí NLS za přítomnosti regulačního proteinu zůstává protein NFκB v cytoplazmě Regulace transportu do jádra 20 kvasinkový transkripční faktor SWI5 se podílí na regulaci buněčného cyklu: po většinu cyklu je SWI5 udržován v cytoplazmě díky fosforylaci aminokyseliny, která bezprostředně sousedí s NLS import do jádra ve specifické fázi buněčného cyklu je provázen jeho defosforylací Regulace transportu do jádra 21 Regulace transportu do jádra 22 podmínka úspěšné genové exprese u eukaryot aktivní proces vyžadující energii a závislý na G-proteinu Ran RNA se translokují v komplexu s proteiny (hnRNPs – heterogenous nuclear ribonucleoproteins) alespoň jeden z nich obsahuje signál pro export z jádra rRNA – sestavování ribozomových podjednotek v jadérku, následný export do cytoplazmy pomocí exportního signálu na ribozomových proteinech Transport z jádra (nuclear export) 23 malé jaderné RNA (snRNAs) určené pro sestřih RNA se nejprve exportují z jádra do cytoplazmy signál pro export nese protein vážoucí čepičku v cytoplazmě se spojí s proteiny za vzniku snRNPs následuje opětný návrat do jádra signál pro import nese jeden z proteinů snRNP Export/import snRNA 24 syntéza na volných ribosomech v cytoplazmě (omezená proteosyntéza uvnitř mitochondrií a chloroplastů) Podmínka importu do organel: adresová sekvence (délka 15-60 aminokyselin) určující cílovou organelu pro příslušný protein absence adresové/signální sekvence: protein zůstává v cytoplazmě Transport přes membrány 25 místa zúžení membrány cílových organel určená pro přenos proteinů adresovou sekvenci rozeznávají receptory ve vnější membráně přenos zajistí translokátory a chaperonové proteiny adresová sekvence je odštěpena signální peptidázou Proteinové translokátory 26 změna konformace přenášeného proteinu je podmínkou jeho translokace zajištěno chaperony Konformace a translokace 27 zajišťují správné skládání nově syntetizovaných nebo denaturovaných proteinů za spotřeby energie nesložené proteiny jsou pro buňku toxické – snadno tvoří agregáty, které se obtížně degradují nesložené/agregované proteiny řádně neplní svou funkci; následkem jsou patologické stavy jako např. neurodegenerativní onemocnění Hlavní třídy chaperonů: Hsp70 chaperoniny Hsp60 Hsp90 Chaperony 28 29 Chaperony vážou hydrofobní části právě vznikajících nebo nesprávně sbalených proteinů brání agregacím opakovanými cykly navázání a uvolnění (za spotřeby ATP) usnadňují správné složení proteinů a jejich translokaci stimulují export proteinů z buněk 30 Mitochondriální genom kruhová molekula DNA, několik kopií různá velikost u různých organismů: 16 kb - lidská/živočišná mitochondrie 80 kb – kvasinková 200 – 2000 kb rostlinná větší velikost dána nekódujícími sekvencemi kóduje jen malou část proteinů pro oxidativní fosforylaci kóduje rRNA a většinu tRNA pro mitochondriální translaci žádné geny kódující proteiny replikace, transkripce a translace např. cytochrom c a mt DNA polymeráza se syntetizují v cytozolu 31 Translokace do mitochondriální matrix proteosyntéza na volných ribozomech transport proteinů do mitochondrie do matrix: nutnost překonat vnější i vnitřní membránu navádění proteinů k mitochondriím zajišťuje presekvence (15-30 AA na N-konci, kladný náboj) s afinitou k receptorům na mitochondriální membráně podmínkou translokace je rozvinutí proteinů (účast chaperonů) 32 Translokace do mitochondriální matrix chaperony Hsp70 udržují proteiny rozvinuté na cytozolické i matrixové straně membrány a podporují translokaci začlenění presekvence do membránového translokačního komplexu translokaci přes vnitřní membránu napomáhá její elektrochemický potenciál vzniká během transportu elektronů při oxidativní fosforylaci negativní náboj na vnitřní straně membrány napomáhá translokaci kladně nabité presekvence 33 Translokace do mitochondriální matrix odstranění presekvence matrixovou proteázou konečné poskládání proteinu uvnitř mitochondrie chaperoninem Hsp 60 vazba chaperoninu a poskládání proteinu vyžadují energii ATP 34 Translokace do mezimembránového prostoru Konzervativní model: translokace do matrix odstraněním presekvence se zpřístupní hydrofobní sekvence, která protein směruje do mezimembránového prostoru (zpět přes vnitřní membránu) proces dokončuje odstranění hydrofobní sekvence 35 Translokace do mezimembránového prostoru Jiné proteiny používají alternativní způsoby: I. přímá translokace pouze přes vnější membránu (cytochrom c) II. translokace přes vnější membránu a začlenění do vnitřní membrány III. přenos vnější membránou, začlenění do vnitřní membrány a uvolnění do mezimembránového prostoru 36 Membrány chloroplastů vnější dvojvrstevná membrána vnitřní membránový systém – thylakoidní membrána Membrány v chloroplastech vymezují tři prostory: mezimembránový prostor mezi obalovými membránami stroma – uvnitř organely, vně thylakoidní membrány lumen thylakoidu 37 Translokace do stroma chloroplastů určena N-koncovou sekvencí 30-100 AK – signálním peptidem (zajištění přechodu obou membrán, následné odštěpení) účast chaperonů na obou membránách podobně jako u mitochondrií signální peptidy nemají kladný náboj a nevyžadují elektrochemický potenciál vnitřní membrány 38 Translokace do lumen thylakoidů přenos do stroma standardní cestou odštěpení signálního peptidu, obnažení hydrofobní signální sekvence translokace přes thylakoidní membránu odštěpení hydrofobní signální sekvence uvnitř lumen thylakoidu • 60. léta 20. stol. • George Palade (1912-2008) • první nositel Nobelovy ceny narozený v Rumunsku Identifikace sekreční dráhy 39 • sledování osudu nově syntetizovaných proteinů v buňkách sleziny sekretujících rozkladné enzymy do malého střeva • označení nově syntetizovaných proteinů radioaktivními aminokyselinami • autoradigrafie Identifikace sekreční dráhy 40 • týká se sekrečních proteinů, proteinů ER, Golgiho aparátu, lysosomů a plazmatické membrány • translokace probíhá zároveň se syntézou na ribozomech vázaných na ER • proteosyntéza zahájena na volných ribozomech v cytozolu • přesun na membránu ER nastává po dokončení syntézy signální sekvence na N-konci Translokace do endoplazmatického retikula 41 David Sabatini a Gunter Blobel (1971) • translace mRNA kódujících sekreční proteiny na volný ribozomech in vitro • výsledek: protein s vyšší molekulovou hmotností než protein vzniklý v buněčném systému Důkaz signální sekvence 42 • po přidání mikrozomů se protein přenesl do jejich vnitřního prostoru a štěpením se zmenšil na obvyklou velikost • mikrozom: preparát hrubého ER získaný z buněčných extraktů centrifugací v hustotním gradientu • potvrzení signální hypotézy: N-koncová sekvence rozhoduje o umístění proteinu na ER a je odštěpena mikrozomální proteázou Následně potvrzeno rekombinantní DNA: přidání signální sekvence navozuje translokaci do hrubého ER Důkaz signální sekvence • délka 20 AK, bohatě zastoupeny hydrofobní AK, umístění na N-konci • rozeznávána částicí SRP (signalrecognition particle) • SRP obsahuje 6 polypeptidů a malé RNA (7S RNA) • navázání SRP na signální sekvenci pozastaví translaci a navede komplex SRP/ribozom/vznikající peptid na receptor pro SRP v membráně ER Struktura a využití signální sekvence • po vazbě na receptor se uvolňuje SRP • receptor se váže na proteinový translokační komplex (translokon) • signální sekvence otevírá transmembránový kanálek • translace se obnovuje • rostoucí polypeptid proniká do lumen ER • signální sekvence odštěpena signální peptidázou • translokovaný protein se skládá za pomoci chaperonů • týká se proteinů určených k sekreci nebo k umístění v lumen ER, Golgiho aparátu, lysosomů Translokace volných proteinů membránou ER • netranslokují se úplně, ale zůstávají součástí membrány • určeny k umístění v membránách ER, Golgiho aparátu, lysosomů nebo plasmatické membrány • do konečné destinace unášeny podobně jako proteiny rozpustné sekreční drahou • ukotvení v membráně zajišťuje hydrofobní doména interagující s membránovými fosfolipidy • ukotvující doménu tvoří 20-25 hydrofobních AK uspořádaných do alfa šroubovice Translokace ukotvených proteinů membránou ER 46 • různá, do cytozolu může směřovat C-konec i N-konec • některé proteiny mají větší počet hydrofobních domén a membránou prostupují několikrát Orientace membránových proteinů 47 • ustanovena během translokace rostoucího řetězce • nemění se (ER, Golgi, lysosom, plasmatická membrána) • lumen ER topologicky odpovídá mimobuněčnému prostoru Orientace membránových proteinů 48 Syntéza transmembránového proteinu s C-koncem v cytozolu • N-koncová signální sekvence odštěpena signální peptidázou • zakotvení v membráně vnitřní sekvencí zastavující přenos zablokování další translokace • ribozom se uvolňuje od translokačního aparátu • syntéza C-koncové oblasti proteinu dokončena v cytozolu 49 Vnitřní signální sekvence • rozeznávaná SRP • umístěná uvnitř proteinu • kotví protein v membráně • není štěpena signální peptidázou • možné obě orientace proteinu • orientace proteinu závisí na orientaci signální sekvence 50 Proteiny procházející membránou opakovaně • střídavý výskyt vnitřní signální sekvence a sekvence zastavující přenos 51 Proteiny procházející membránou opakovaně 52 Sekreční dráha a vezikulární transport Sekreční dráha • transport proteinů určených k sekreci mimo buňku a proteinů plazmatické membrány • využití i pro transport proteinů ER, GA a lysosomů Vezikulární transport • „kyvadlová doprava“ mezi organelami zajišťovaná různými typy váčků (specifický protein pro specifickou organelu) 53 Transportní váčky • drobné měchýřky vymezené membránou, které zajišťují intracelulární transport membránových lipidů a proteinů • základem je fúze membrán váčku a organely 54 Konstitutivní a regulovaná sekrece 55 • skládání translokovaných proteinů (chaperony) • nesprávně složené proteiny zůstávají v komplexu s chaperony a jsou zadržovány v ER nebo degradovány • správně složené proteiny uvolněny z chaperonů a připraveny k transportu sekreční drahou Počátek sekreční dráhy: ER • skládání a sestavování proteinů v ER je doprovázeno tvorbou disulfidických můstků mezi zbytky cysteinu • můstky se netvoří v redukujícím prostředí cytozolu • reakci usnadňuje enzym disulfid izomeráza přítomný v lumen ER • další modifikace: připojení oligosacharidu k asparaginu rostoucího polypeptidu oligosacharyltransferázou Modifikace proteinů v ER 57 • zprostředkován váčky pučícími z membrány • fúze s membránou Golgiho aparátu • umístění v lumen nebo membráně se zachovává Export proteinů z ER 58 • chaperony, signální peptidáza, disulfid izomeráza jsou potřebné v ER • retenci v lumen ER zajišťuje adresová sekvence KDEL Lys-Asp-Glu-Leu na C-konci • pokud je sekvence KDEL odstraněna, protein je transportován do GA a vyloučen mimo buňku • KDEL nebrání transportu z ER do GA • z GA se ale proteiny označené KDEL do ER vrací Zadržování proteinů v ER 59 • zpracování, třídění a modifikace proteinů z ER (glykosylace) • syntéza glykolipidů a sfingomyelinu • rostlinné buňky: syntéza polysacharidů buněčné stěny • morfologie: systém membránami ohraničených váčků (cisteren) • rozlišení na oblast cis (vstup) a trans (výstup) Golgiho aparát 60 61 62 • třídění proteinů do různých transportních váčků podle signálních sekvencí • pučení z membrán GA v oblasti trans • absence signální sekvence: transport hlavním tokem sekreční dráhy k plazmatické membráně • regulovaná sekrece z buněk žláz (hormony, nervové přenašeče, trávicí enzymy) v reakci na specifické podněty • transportní váčky se zvětšují na sekreční váčky • signál je zachycen receptorem a vyvolá exocytózu Export z Golgiho aparátu 63 • klíčová je specifita vezikulárního transportu • specifita nákladu a specifita cílové membrány • specifita membrán je dána typickým zastoupením proteinů • opláštěné váčky: proteinový obal vně membrány clathrin + adaptin 1: transport z GA do lysosomů clathrin + adaptin 2: transport z plazmatické membrány do endozomů proteiny COP: z ER do GA, z GA do GA, z GA do ER (nutná přítomnost faktoru ARF) Funkce pláště: • pučení váčku (tvarování membrány) • zajištění specifity nákladu Mechanismus vezikulárního transportu 64 Klathrinové váčky 65 • proteiny určené pro lysosomy značené manoso-6P • vazba manoso-6P na receptory specifické lokalizované v membráně oblasti trans GA • receptory slouží jako vazebná místa pro adaptiny • adaptiny přitahují klathrin • vznik komplexu: receptor pro manoso-6P – adaptin 1 – klathrin • klathrin vytváří prostorovou síť, formuje váček s nákladem lysosomálního proteinu Naložení lysosomálních proteinů do klathrinového váčku 66 Naložení lysosomálních proteinů do klathrinového váčku 67 • zapojen malý G-protein ARF • ARF s vázaným GTP váže membrány trans GA a je podmínkou vazby dalších složek pláště: indukuje vznik váčku • hydrolýza GTP na GDP: rozpad pláště (podmínka fúze s cílovou membránou) • opětnou vazbu GDP na ARF zajišťuje membránový protein GA Váčky COP 1. rozeznání správné cílové membrány • zprostředkováno interakcí specifických membránových proteinů SNARE: Soluble N-ethylmaleimid-sensitive Fusion-protein Attachmentprotein Receptor v-SNARE (vesikulární) má afinitu k t-SNARE (target) cílové organely 2. vlastní fúze: • komplex proteinů SNARE přitahuje proteiny indukující fúzi membrán (NSF a SNAP) Fúze váčků s cílovou membránou 69 1. Rozpoznání 2. Fúze Fúze váčků s cílovou membránou 70 Fúze váčků s cílovou membránou 71 Endocytóza • pohlcení mimobuněčného materiálu a jeho přenos do lysosomu • odškrcení membrány → vznik endocytického váčku (endosomu) • transport endocytovaného materiálu do lysosomu, degradace • lysosomy vznikají z transportních váčků vytvořených pučením z trans GA: křižovatka mezi sekreční a endocytickou drahou • příjem kapalin a malých molekul, váčky < 150 nm • průběžné vytváření pinocytických váčků a jejich recyklace • velmi rychlý průběh • nejde o selektivní proces • makrofág pohltí cca 3% své membrány za minutu Pinocitóza 73 • vazba cizorodé pevné částice k povrchu fagocytující buňky • aktivace povrchového receptoru • vytváření pseudopodií (polymerace aktinu) • fúze koncových částí pseudopodií: fagosom • fagosom + lysosom: fagolysosom (degradace fagocytovaného materiálu hydrolázami) Fagocytóza 74 Fagocytóza bakterie NK buňka 75 • rozklad vlastních komponent buňkou • obklopení částice/organely membránami ER: autofagosom - autolysosom Autofagie 76 • vazba endocytovaných molekul na příslušné receptory na povrchu buňky • komplexy molekula/receptor vstupují do buňky v membránových váčcích obalených klathrinem • např: cholesterol – vazba na LDL (low-density lipoproteins) • vazba LDL na membránové receptory • komplexy LDL s receptory jsou pohlceny endocytózou a dodány endosomům • uvolnění LDL z receptoru (nízké pH) • recyklace receptorů zpět do plazmatické membrány (transportní váčky) Endocytóza zprostředkovaná receptory 77 Příklad endocytózy: LDL 78 79