Molekulární biologie
cytoskeletu
Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot
26.9.2019
Jana Šmardová
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Morfologické / strukturní
• tvar buněk včetně cytoplazmatických protruzí
• odolnost vůči vnějším mechanickým vlivům
• vnitřní organizace buňky
Pohybové
• intracelulární transport
• pohyb chromosomů v anafázi
• pohyb buněk po substrátu
• pohyb buněk pomocí kinocilií
• svalová kontrakce
Funkce cytoskeletu
• vystavěn ze tří typů proteinových vláken
 střední (intermediární) filamenta: 10 nm
 mikrotubuly: 25 nm
 aktinová vlákna: 7 nm
• každý typ vlákna je tvořen jiným typem proteinu
Struktura cytoskeletu
Tři typy proteinových vláken tvořících cytoskelet
střední filamenta
(10 nm)
mikrotubuly
(25 nm)
aktinová filamenta
(7 nm)
(jen u živočichů)
Osnova přednášky
• mikrotubuly
• aktinová filamenta (= mikrofilamenta)
• střední (intermediární) filamenta
• jaderný skelet
• cytoskeletální toxiny
Mikrotubuly
Tubulin
• heterodimer:  a  podjednotky
-tubulin - pouze v MTOC
• -tubulin: 450 AA, 56 kDa
• -tubulin: 445 AA, 54 kDa
• konzervativní protein, několik
izoforem; četné posttranslační
modifikace
• v mikrotubulu po obvodu 13
protofilament (pravidelné střídání 
a  podjednotky)
• polarizace mikrotubulů: + a – konec
Stavba mikrotubulů (MT)
Struktura a sestavování mikrotubulu
1. nukleace (MTOCs)
2. elongace
+
+
- -tubulinový
prstenec
nukleační místo
Dynamická nestabilita MT (GTP-GDP)
Dynamická nestabilita MT (GTP-GDP)
• v typickém fibroblastu je asi 50% tubulinu
v mikrotubulech, 50% volně v cytosolu
Mikrotubulární struktury v buňkách
A. cytoplazmatické mikrotubuly, které mají
hlavně organizující úlohu, vyrůstají z
centrozomu, směrem k periferii buňky
B. během mitózy se cytoplazmatické mikrotubuly
rozpadají a tvoří se dělící vřeténko
C. bičíky a řasinky - stálé struktury, které jsou
schopny pohybu
D. MTOC - mikrotubuly organizující centrum
(centrozom, bazální tělíska)
Funkce mikrotubulů:
• intracelulární transport buněčných struktur
• pohyb chromozomů při mitóze (meióze)
• pohyb buněk pomocí kinocilií
• tvorba axonů a axonový transport
Transport podél mikrotubulů v axonu nervové buňky/
+ polarizace buňky
Posttranslační modifikace tubulinu
Strukturní heterogenita MT
1. izoformy: 9 genů pro -tubulin, 9 pro -tubulin; 2 pro -tubulin
2. posttranslační modifikace
 „tubulinový kód“
Gadadhar S et al., J Cell Sci 130: 1347–1353, 2017
Funkční heterogenita MT
Prassanawar SS et Panda D., Biochem J 476: 1359–1376, 2019
Mikrotubuly v různých typech eukaryontních
buněk
buňka drozofily
-tubulin / DNA
lidská buňka Schizosaccharomyce
s pombe
Buněčná linie CV-1
(Normal African Green Monkey Kidney Fibroblast Cells)
-tubulin / DNA
Buněčná linie Ptk 2
(Rat Kangaroo Kidney)
-tubulin / DNA
• kontrolují počet mikrotubulů, jejich umístění a orientaci v cytoplazmě
• živočišná buňka – centrozom:
2 centrioly + PCM (pericentriolární materiál)
stovky nukleačních míst tvořených -tubulinem
• struktura centriolu:
9 fibril (svazky 3MT: A, B, C), 1 centrální MT
MTOCs (mikrotubuly organizující centra)
+
+
- -tubulinový
prstenec
nukleační místo
Struktura centrozomu
• mateřská a dceřiná centriola (ortogonální uspořádání)
• distální a subdistální přívěsky (DP  a SDP) na mateřské centriole
Struktura centrozomu v S fázi buněčného cyklu
Uzbekov R et Alieva I. Open Biol 8: 1180062, 2018
Duplikace centrozomu během buněčného cyklu
• koordinace a synchronizace duplikace
centrozomu s buněčným cyklem je zajištěna
komplexy cyklin E/Cdk2 a cyklin A/Cdk2
Duplikace centrozomu během buněčného cyklu
• S-M spoj brání formování další nežádoucí centrioly
• díky utvořenému prostoru pomocí G1-G2 poutka je naopak umožněn
nový duplikační cyklus, ale i zachování kompaktnosti centrozomu
• obě centrioly těsně spojeny SM
spojem až do konečné fáze
mitózy, kdy dojde k rozvolnění;
dále zůstávají u sebe díky G1G2
spojům
• bazální tělísko primární řasinky
interagující s plazmatickou
membránou PM ()
• deuterozomy (D) se tvoří u
multiciliárních buněk: dojde k
mnohonásobné amplifikaci
centriol, které následně slouží
jako bazální tělíska řasinek
Nigg EA et Stearn T. Nat Cell Biol 13 (10): 1154–1160, 2011
Buněčná linie NRK (Normal Rat Kidney)
-tubulin / DNA
Struktura vřeténka u různých typů eukaryontních
buněk
Struktura kinetochorů:
• vnitřní kinetochor interaguje s
centromerickou DNA, která funguje
jako nukleační místo pro sestavení
kinetochoru
• vnější kinetochor je dynamický - po
většinu doby interaguje s mikrotubuly,
během anafáze je spojen s jejich
depolymerizací
Napojení kinetochorů
 Funkce kinetochorů:
• kinetochory fungují nejenom jako strukturní platforma
spojující chromozomy s mikrotubuly, ale také jako
hlavní mitotické signální centrum s úkolem
koordinovat připojení mikrotubulů s aktivitou
kontrolního bodu mitotického vřeténka
Dou Z et al., Cells 8: 278;doi:10.3390/cells8030278, 2019
 struktura kinetochorů před a po (A)
připojení k MT
Motorové
• ATP-ázová aktivita
• dyneiny (pohyb od + konce k - konci)
• kinesiny (pohyb od - konce k + konci)
Proteiny asociované s mikrotubuly
Dyneiny a kinesiny
• dvě globulární hlavičky, které vážou
ATP, a konec
• hlavičky interagují s MT prostorově
specificky – mohou se navázat pouze
jedním směrem
• konec se pevně váže k některé
organele nebo váčku – tím je určen typ
nákladu (kinesiny – ER, dyneiny –
Golgiho ap.)
• hlavičky mají ATPázovou aktivitu –
hydrolýza ATP poskytuje energii pro
cyklicky se opakující změny
konformace, to umožňuje pohyb po MT
Motorové proteiny asociované s MT
Nemotorové
Microtubule Associated Proteins = MAPs
• (MAP-1, MAP-2, …), regulace fosforylací
• většina v mozkové tkáni, MAP-4 u savců v ostatních
tkáních
• příčná propojení mezi MT, stabilizace MT
Tau-protein
• podélná stabilizace MT
• změny u některých neurodegenerativních poruch
Proteiny asociované s mikrotubuly
Tautopatie
• tau-protein kódovaný genem MAPT (17q21.31)
• ve fosforylované formě stabilizuje MT (axony)
• abnormální depozity hyperfosforylovaného tau-
proteinu
• tělo neuronu a dendrity (Alezheimerova choroba)
• neurony i gliové buňky (ostatní tautopatie)
 Pickova nemoc (Pick´s Disease)
 frontotemporální demence (with Parkinsonism Linked
to Chromosome 17; FTDP-17)
 kortikobazální degenerace
 progresivní supranukleární paralýza
 Alzheimerova Choroba (AD)
Tautopatie
Alzheimerova choroba
• jeden z typů stařecké demence
• 7-10% nad 65 let, 40% nad 80 let
• ztráta paměti (nejprve krátkodobá), dezorientace
(prostorová, časová), halucinace, upoutání na
lůžko, smrt
• histologická diagnostika post mortem:
 senilní plaky (-amyloid) – extracelulárně
 neurofibrilární vřeténka (hyperfosforylovaný tauprotein)
- intracelulárně
• komplexní onemocnění (genetické predispozice,
vlivy prostředí – například hliník, věk)
Onemocnění myší a člověka způsobená
aberacemi posttranslačních modifikací tubulinu
Magiera MM et al., Cell 173: 1323-1327, 2018
• vyrůstají z bazálního tělíska
• tvořeny devíti dvojicemi MT a uprostřed další dva MT (9 + 2)
• vše propojeno dyneinem, který dodává energii k ohybu
Řasinky a bičíky
uspořádání mikrotubulů v řasince a bičíku
Aktinová filamenta
(mikrofilamenta, AF)
Aktin:
• každé vlákno
představuje stočený
řetězec sestávající ze
stejných globulárních
proteinů G-aktinu
• vlákno (F-aktin) má
polaritu (vycházející z
polarity G-aktinu) 
má plus (+) a minus
(-) konec (barbed -
pointed)
Aktin:
• ~5% všech proteinů u většiny buněčných typů
 svalové buňky (průkaz aktinu – 1940)
aktin + myosin: 60% všech buněčných proteinů
 nesvalové buňky (průkaz aktinu – 1960)
aktin: do 15% všech buněčných proteinů
(asociované proteiny: 10% všech buněčných
proteinů)
• AF tenčí, pružnější, kratší (ve srovnání s MT)
• celková délka AF v buňce ~30x větší (ve srovnání s
MT)
G-aktin: 375 AA, 43 kDa
Polymerace aktinu
• přidáváním aktinových monomerů na obou koncích (rychleji
na plus/barbed-konci); také rozpadat se může na obou
koncích
• polymerovaný aktin : monomery ~ 50:50
• monomer váže ATP, který je hydrolyzován při zapojení
• účast aktin-vázajících proteinů
Hlavní třídy aktin-vázajících proteinů
 vyšší polymeraci zabraňují aktin-vázající proteiny
• např. thymosin,
profilin: vážou
monomery a blokují
jejich polymeraci
 další proteiny se
vážou na
aktinová vlákna
(F-aktin);
stabilizují,
vytvářejí další
struktury,
ovlivňují funkci…
Arp2/3
EPS8
tropomodulin
fimbrin, -actinin, spectrin,
filamin, ABP120, fascin, vilin
thymosin,
profilin
myosin
Geny pro aktin
• 30 genů u savců včetně člověka, 60 genů u rostlin (část
nefunkční pseudogeny)
•  90% homologie
• patrně mechanismus endogenní duplikace
• člověk – 6 funkčních genů pro aktin
 1 gen pro aktin příčně pruhovaných svalů (skeletal)
 1 gen pro aktin srdečního svalu (cardiac)
 2 geny pro aktin hladkých svalů (smooth, smooth)
 2 geny pro cytoplazmatický aktin (cyto, cyto)
• posttranslační modifikace:
acetylace N-konce, methylace His68
Aktinová filamenta v rostlinných buňkách:
kořenový meristém kukuřice
F-aktin
F-aktin
Aktinová filamenta v živočišné buňce:
Indian Muntjac
• cytokineze (kontraktilní prstenec = ring)
• fagocytóza
• lokomoce (stresová vlákna, lamellipodia)
• interakce buněk se substrátem (fokální adheze)
• změny tvaru buňky (lamellipodia, filopodia)
• růst axonů při vytváření nervových synapsí
• zvětšení buněčného povrchu
mikroklky (microvilli) – střevní epitel
světločivné výběžky – tyčinky sítnice
stereocilie – kochleární epitel
• perforace vajíčka při fertilizaci (polymerace aktinu v
akrosomech)
Funkce aktinových filament
Svazky aktinových vláken v buňkách:
A. mikroklky na povrchu střevní výstelky
B. kontraktilní svazky v cytoplazmě
C. lamellipodia a filopodia na vedoucím okraji
pohybující se buňky
D. kontraktilní prstenec během buněčného dělení
Buněčný kortex
• aktin je v celé cytoplazmě, ale u většiny buněk je
koncentrován těsně pod plazmatickou membránou
• zde aktinová vlákna pospojována aktin-vázajícími
proteiny (např. spektrin, ankyrin) do husté sítě
• zpevňuje povrch buňky
• dodává mechanickou pevnost
• přestavba kortexu je základem změny buněčného
tvaru a pohybu po podložce
F-aktin
Pohyb buňky po podložce
1. vysunování výběžků na přední straně (leading edge)
( polymerace aktinu)
2. výběžky přilnou k povrchu
3. zbytek buňky se tahem přitáhne dopředu
Model funkce myosinových a aktinových
vláken při svalovém stahu
Změna AF a AP jako příčina onemocnění
Změny exprese izoforem aktinu
• kardiomyocyty u pacientů se srdečními příhodami
(patologická exprese -skeletálního aktinu)
Mutace v genech pro aktin i AP
• např. nemalinová (tyčinková) myopatie
Malignita:
• aplikace cytochalasinů  potlačení schopnosti
migrovat
• snížení adheze – vyšší schopnost migrace
• úloha aktinu (a středních filament) v EMT
 problematika protinádorové terapie
Aktin u nádorově
transformovaných buněk
Izdebska M et al. BioMed Res Int 2018
Typické znaky EMT včetně změn aktinu
Střední filamenta /
intermediární filamenta (IF)
• pouze v živočišných buňkách
• stavební protein se liší podle histogenetického typu
tkáně
• fibrilární molekula s globulárními C- a N- konci, vždy IFdoména
na N-konci
• homodimery nebo heterodimery
• tetramery  protofilamentum
• vlákno 10 nm = 8 protofilament („rope-like“ struktura –
jako lana)  tím dosaženo pevnosti
Stavba středních filament
Stavba středního filamenta
 sestavování
spontánní,
nevyžaduje
účast
dalších
faktorů;
nízký podíl
monomerů v
buňce
 IF jsou
nepolární
Struktura molekuly IF proteinů
• střední tyčovité domény (tvořené -šroubovicí)
homologní u různých proteinů, globulární konce se liší
• koncové domény jsou na povrchu vláken – interagují s
ostatními součástmi cytoskeletu
N: hlavička C: ocásek
• zvýšení odolnosti buňky vůči mechanickému poškození
• určení tvaru buňky, lokalizace organel
• integrace komponent cytoskeletu
Funkce středních filament
 svalové buňky
 neurony (axony)
 epiteliální buňky (kůže)
Sharma P. et al, 2019
 IF pravděpodobně představují nejrobustnější markery
tkáňové a buněčné diferenciace (patologie)
Třídy středních filament
Hlavní třídy středních filament
 IF pravděpodobně představují nejrobustnější
markery tkáňové a buněčné diferenciace
(patologie)
Imunohistochemická detekce proteinů IF
cytokeratin vimentin
Linie A-549 (lidský karcinom plic)
cytokeratin / mitochondrie / DNA
Linie GMMe (norek: děložní endometrium)
aktin / vimentin / DNA
linie 3T3
(myš – kožní vazivo)
cytokeratin / DNA
(epitelie)
vimentin / DNA
(fibroblasty)
Defekty v genech pro IF
 ~ 80 klinických jednotek od nemocí kůže (keratiny) po
předčasné stárnutí (laminy)…
Nemoc motýlích křídel (epidermolysis bullosa)
• mutace genů pro keratiny spojeny s řadou
onemocnění včetně EB
• EB způsobená mutacemi jedenácti různých genů
včetně K5 a K14
• vrozené puchýřnaté onemocnění kůže
• kromě kůže postižení sliznice dutiny ústní, GITu,
respiračního a urogenitálního traktu
• v ČR asi 300 pacientů
• zatím nevyléčitelné onemocnění, nutnost
dennodenních preventivních opatření
Alexandrova choroba (Alexander disease)
• patří mezi leukodystrofie, což jsou geneticky
podmíněné choroby, které se projevují morfologickými
změnami bílé hmoty CNS
• fatální neurodegenerativní onemocnění
• dominantní mutace v genu pro
GFAP (glial fibrillary acidic
protein, III. třída IF)
 tvorba tzv. Rosenthalových fibril
v mozkové tkáni (eosinofilní
okrouhlé nebo protáhlé struktury
produkované astrocyty abnormální
proteinová depozita)
a destrukce myelinové pochvy
Alexandrova choroba (Alexander disease)
• přehled dosud identifikovaných mutací v genu
pro GFAP:
Kardiomyopatie, svalové dystrofie
 jedna z mnoha příčin vrozených kardiomyopatií
a svalových dystrofií jsou mutace desminu (III.
třída IF)
 desmin je nezbytný pro funkci všech typů
svalových tkání (kosterní, hladké, srdeční)
 známo nejméně 70 mutací genu pro desmin a
nejméně 8 různých onemocnění
Izdebska M et al. BioMed Res Int 2018
Epiteliální mezenchymální tranzice a nádory
Jaderný skelet
Fibrózní vrstva/lamela (nuclear lamina)
• hustá, vláknitá síť, která obaluje jaderný obsah (s chromatinem
propojen prostřednictvím např. proteinů BAF) a je připojena k
vnitřní straně jaderné membrány (prostřednictvím např. proteinů
emerin, LAP2)
• udržuje tvar a strukturu jádra a účastní se buněčné signalizace
• tvořena laminy (třída V IF):
lamin B – připojení fibrózní vrstvy na integrální proteiny
vnitřní membrány jaderného obalu
laminy A a C – připojení interfázních chromosomů
• nukleoskelet je propojen s cytoskeletem prostřednictvím komplexu
LINC (linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton)
(Jadérkový skelet – hlavní složkou protein nukleolin)
Jaderný skelet (nukleoskelet)
Fibrózní vrstva jaderného skeletu
- dvojrozměrná síť IF
(na rozdíl od
cytoplazmatických IF
připomínajících lana)
Jaderný skelet
Uspořádání jaderné membrány a nukleoskeletu
Změny jaderného obalu během mitózy
Laminy / MT /
DNA
Cytoskeletální toxiny
Cytoskeletální toxiny
• místem zásahu MT nebo AF
• inhibitory polymerace nebo depolymerace
• přírodní látky (rostlinné alkaloidy, mykotoxiny)
Vinca rosea /
Catharanthus
roseus (barvínek
růžový)
Mikrotubulární toxiny – inhibitory
polymerace
• tzv. vinca-alkaloidy (Vinca major)
vinkristin, vinblastin, vinorelbin
• mechanismus: tvorba parakrystalů z
molekul tubulinu
• využití: chemoterapie – např. Velban,
Navelbin
Vinca major –
Barvínek větší
Mikrotubulární toxiny – inhibitory
polymerace
• colchicine (Colchicum autumnale),
colcemide
• mechanismus: vazba na molekuly tubulinu
• využití: cytogenetická vyšetření – tzv. cmitózy,
polyploidizace u rostlin, léčba
ataků dny (pakostnice)
Colchicum au.
– Ocún jesenní
Poruchy sítě MT po působení vinblastinu
linie 3T3
(myš – kožní vazivo)
-tubulin / DNA
linie MDCK
(pes - ledviny)
Mikrotubulární toxiny – inhibitory
depolymerace
• paclitaxel (Taxus baccata), docetaxel
• mechanismus: stabilizace mikrotubulů
• využití: chemoterapie – Taxol, Taxotere Taxus baccata
– Tis červený
Toxiny aktinových filament – inhibitory polymerace
• cytochalasiny, latrunculin
• mechanismus: vazba na plus/barbed-konec F-aktinu
nebo na G-aktin
• využití: základní i aplikovaný výzkum
lidský kožní fibroblast
cytochalasin
F-aktin
Toxiny aktinových filament – inhibitory
depolymerace
• phalloidin (Amanita phalloides), jasplakinolid
• mechanismus: vazba na F-aktin, stabilizace filament
• využití: základní výzkum (vizualizace aktinových
filament)
F-aktin:
phalloidin -
rhodamin
Amanita phalloides– Muchomůrka zelená