Molekulární biologie extracelulární matrix Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot 3.10.2019 Jana Šmardová Jan Šmarda Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU • glykokalyx (živočichové) • buněčná stěna (rostliny, houby) Mnohobuněčné organismy • interakce mezi buňkami navzájem: tkáně, resp. pletiva = buňky + extracelulární matrix (ECM) • propojení buněk: přímý kontakt nebo prostřednictvím ECM • růst buněk, migrace, proliferace, diferenciace Povrch eukaryontních buněk  vývoj mnohobuněčnosti je jedním z nejvíce fascinujících a také z nejzáhadnějších kroků evoluce (a je jedním z „velkých evolučních přechodů“)  klíčovým zprostředkovatelem mnohobuněčnosti u metazoí je extracelulární matrix  sekretované proteiny, které tvoří ECM, se většinou objevily až s vývojem mnohobuněčných, představují tedy evoluční novinky  proteiny ECM a jejich geny jsou dobrým podkladem pro hledání evolučních vztahů metazoí Mnohobuněčné organismy Draper GW et al, Essays Biochem, 2019 • mnohobuněčnost se vyvinula nezávisle několikrát (7x, respektive více než 20x) • živočichové: predátoři jiných organismů, silní a hbití, rychlý pohyb, rychlé vyvinutí a přenášení síly… • rostliny: nepohybují se, jejich pletiva pevná, jejich buňky slabé a velmi křehké – pevnost dána buněčnými stěnami  rozdílům odpovídají i rozdíly v uspořádání ECM  ECM vytvářejí buňky kolem sebe a kontrolují její složení Mnohobuněčné organismy Osnova přednášky • buněčná stěna • extracelulární matrix (ECM) u živočichů  funkce ECM  komponenty ECM  degradace ECM Buněčná stěna • primární CW (tenká) – schopnost zvětšování • sekundární CW (pevná) – ztluštění primární CW nebo ukládání nových vrstev pod původní • střední lamela Buněčná stěna (cell wall, CW) u rostlin Složení buněčné stěny: • celulóza, další polysacharidy (pektin, hemicelulóza), strukturní proteiny • lignin Syntéza celulózy • lokalizace na vnějším povrchu buňky (enzymatické komplexy celulóza syntázy CESA zanořené do membrány) • transport sacharidových monomerů přes membránu, začleňování v místě přichycení k plazmatické membráně • orientace mikrofibril určena dráhami pohybu komplexů v membráně – dráhy patrně determinovány mikrotubuly pod membránou (tj. cytoskelet nepřímo určuje tvar buněk) Další stěnový materiál: • syntéza uvnitř buňky  exocytóza Komplexy celulóza syntázy – CESA lokaliozovány v plazmatické membráně ECM u živočichů: Funkce ECM = tzv. buněčný plášť • komponenty plazmatické membrány secernovaný materiál • mechanická ochrana povrchu buňky • realizace buněčných interakcí Glykokalyx Příklad: zona pellucida u oocytů • 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1) • bariéra mezidruhové fertilizace • zajištění fertilizace (vazba spermie na ZP2) • blokování polyspermie v důsledku kortikální reakce (štěpení ZP2, modifikace ZP3) Zona pellucida u lidských oocytů • 4 typy glykoproteinů: ZP1, ZP2, ZP3, ZP4 Gupta SKet al, J Repr Immunol 83: 50-55, 2009  slizovitý povrch pomáhá pohyblivým buňkám (např. bílým krvinkám) proklouzávat úzkými mezerami, zatímco zabraňuje lepení buněk k sobě navzájem, k erytrocytům a ke stěnám cév Příklad 2: Endoteliální glykokalyx (směrem do lumen cév) Reitsma S. et al, Eur J Physiol 454: 345–359, 2007  složení: proteoglykany s glykosaminoglykanovými řetězci (GAG-chain), glykoproteiny s karbohydrátovými řetězci, rozpustné proteoglykany, kyselina hyaluronová, proteiny (extracelulární superoxid dismutáza - ecSOD; antitrombin III - AT III)  ochranný plášť povrchu buňky - chrání před mechanickým a chemickým poškozením  (složený z glykoproteinů a proteoglykanů)  každá buňka má své vlastní specifické složení glykokalyxu - určuje tedy i identitu buněk („uniformy“)  pomáhá při vzájemném rozpoznávání buněk a při vytváření adhezí Glykokalyx • odlišné uspořádání a vlastnosti v závislosti na typu tkáně • pojivové tkáně (kosti, šlachy, chrupavky, sklivec): převaha ECM (nutnost mechanické pevnosti) • svaly, epitely, nervové tkáně: minimum ECM (bazální lamina), mechanickou oporu zajišťuje cytoskelet Funkce ECM: 1. mechanická opora 2. specifické funkce tkání (vazba signálních molekul) 3. regulace embryogeneze Extracelulární matrix (ECM) ECM u živočichů: Funkce ECM Složení ECM buňky příslušné tkáně produkují složky ECM intracelulárně a vylučují exocytózou: 1. kolagenová vlákna (zajištění pevnosti v tahu; základní složkou kolagen) 2. elastická vlákna (zajištění pružnosti; základními složkami elastin a fibrilin) 3. výplňová komponenta (zábrana stlačování; základními složkami hyaluronany a proteoglykany) 4. adhezivní molekuly (glykoproteiny) různé typy ECM v různých tkáních (izoformy, regulace genové exprese) • kolagen – u savců 25% z celkového množství proteinů v těle; (~20 genů) • trojřetězcová helikální struktura (trihelix) = tropokolagen • trihelix  kolagenové mikrofibrily  kolagenové fibrily (průměr 10-300 nm, délka v µm)  kolagenová vlákna • uspořádání fibril podle typu tkáně: kůže – střídající se vrstvy s různou orientací šlachy = paralelní svazky ve směru shodném s hlavní osou napětí • syntéza: fibroblasty, epitelové buňky, osteoblasty (1) Kolagenová vlákna Struktura kolagenu • trihelix – trojšroubovice - tropokolagen • stabilizace pomocí vodíkových vazeb mezi N- a C-konci jednotlivých molekul • vysoký obsah glycinu (každá 3. AA), prolinu, hydroxyprolinu, hydroxylysinu • člověk: asi 27 různých typů kolagenů Kolageny vláknité (typ I, II, III, V) síťové (typ IV) spojovací (typ VII) Struktura kolagenu • vlákna protokolagenu stáčena po způsobu lana tak, že jednotlivá vlákna přesahují o ¼ sousední vlákno • překryvy vláken a nahloučení kyselých a bazických zbytků jsou příčinou pruhování struktury viditelného v elektronovém mikroskopu • vzniká tak mechanicky velmi odolná mikrofibrila, jejíž molekula je dále stabilizována příčnými vazbami mezi aminokyselinovými zbytky (především lysinu a jeho derivátů) Organizace a struktura kolagenu  kolagenové fibrily v pojivové tkáni kůže kuřecího embrya • fibrily organizovány do svazků – některé v rovině řezu, jiné kolmo • fibroblast vylučující kolagen i ostatní složky ECM  molekulární struktura kolagenové fibrily Organizace a struktura kolagenu (a) – (c): tropokolagen; (d) – mikrofibrila; (e) – příčně pruhovaná struktura; (f) – obraz kolagenových vláken pojiva Struktura kolagenu Syntéza kolagenu • extracelulární uspořádání = kohezní agregáty • prokolagen = secernovaná forma kolagenu; na obou koncích molekuly přídavné peptidy, které blokují uspořádání do fibril prokolagen I: N-konec / 150 AA C-konec / 250 AA • Kolagenáza (ec): odštěpí přídavné peptidy z prokolagenu  kolagen • hydroxylace (Pro, Lys), připojení cukrů (Lys), tvorba disulfidických můstků • spontánní sestavení molekul do vláken (fibrily) Klasifikace kolagenů: Třída 1: • typy I, II a III • dlouhé řetězce • tzv. „ortopedické“ kolageny (kosti, chrupavky,…) Třída 2: • typy IV, VII a VIII • komponenty bazální laminy Třída 3: • typy VI, IX, a X • různé určení (např. stěny krevních cév) Poruchy syntézy kolagenu • osteogenesis imperfecta defekt syntézy kolagenu I (bodová mutace, AD) abnormality kostí, časté fraktury • epidermolysis bullosa defekt syntézy kolagenu VII nebo cytokeratinů (IF) extrémně křehká pokožka (puchýře, traumata) EBOI Poruchy syntézy kolagenu • hyperplastická kůže abnormálně roztažitelná kůže je příznakem genetického syndromu, který je důsledkem chyby v sestavování nebo zesíťování kolagenu (včetně nepřítomnosti/nefunkce kolagenázy) • elastin + fibrilin • kožní pojivo, stěny kapilár, plíce • pružnost tkání (po natažení návrat do původního tvaru) • poruchy způsobují vznik vrásek (2) Elastická vlákna Elastin • neglykosylovaný, hydrofobní polymer • základní jednotkou je rozpustný monomer tropoelastin, 60 kDa, 830 AA, značné množství Gly, Pro, Ala, Val, Lys • secernovaný fibroblasty, endoteliemi, buňkami hladkého svalstva, chondrocyty a keratinocyty • náhodné změny konformace, mnoho variant • tvorba hustých elastinových sítí (vysoká odolnost vůči tahu a tlaku, ochranu zajišťují vlákna kolagenu) Elastin zajišťuje odolnost vůči tlaku Poruchy elastických vláken • Marfanův syndrom AD mutace v genu pro fibrilin 1 postižení kostry, CVS, kůže, očí • cutis laxa AD mutace v genu pro elastin nedostatečná pružnost tkání) MS CL Marfanův syndrom základní kriteria: • vysoká postava • dlouhé tenké končetiny • dlouhé tenké prsty („nemoc pavoučích prstů“) • dislokace oční čočky • anomálie srdce a cév Niccolo Paganini Abraham Lincoln Abraham Lincoln • hyalurony: kyselina glukuronová + (1,3)-Nacetylglukosamin (až 50 000 disacharidů v 1 molekule) • proteoglykany: centrální protein + řetězce GAG (glykosaminoglykany - mukopolysacharidy) • tvroba viskózního hydratovaného gelu (vysoká afinita k molekulám vody, vznik vodíkových můstků)  tendence zaujímat velký objem  odolnost vůči tlaku • vazba na povrch migrujících buněk – usnadnění pohybu a proliferace (3) Výplňová komponenta Proteoglykanový agregát z chrupavky Proteoglykany • součást výplňové komponenty (zábrana stlačování), různorodé složení i velikost: centrální protein + řetězce GAG GAG (glykosaminoglykany) • nevětvené polysacharidy obsahující deriváty uronových kyselin a hexosaminové zbytky • minimum v kostech a šlachách, převaha ve sklivci • silně hydrofobní molekuly • rozvolněné konformace zabírající obrovský prostor • i v nízkých koncentracích tvorba gelu • různá velikost pórů v gelu – ECM funguje jako filtr • vazba signálních molekul • ovlivnění migrace buněk Struktura proteoglykanů Struktura a uspořádání ECM • zajištění interakcí v ECM (na čistý kolagen je přichycení obtížné) • laminin (heterotrimer – tvar kříže; multiadhezivní protein; migrace, tvar, adheze buněk) • fibronektin (dimer – disulfidové můstky na C-konci; 1 gen  alternativní sestřih  20 izoforem; migrace buněk) obsahují sekvenci RGD (Arg-Gly-Asp) • tenascin (antiadhezivní vlastnosti, příbuznost s fibronektinem) • fibrinogen (agregace trombocytů) (4) Adhezivní glykoproteiny Laminin Laminin • heterotrimer – tvar kříže; multiadhezivní protein; migrace, tvar, adheze buněk Fibronektin • jedna část molekuly fibronektinu se váže na kolagen, druhá na buněčnou strukturu (integrin) • integrin se extracelulární doménou váže na fibronektin, intracelulární doménou na aktinová filamenta v buňce Fibronektin Tenascin • typickou součástí struktury tenascinů jsou EGF-like repeats • interaguje s fibronektinem • rozpustný glykoprotein (340 kDa) • složený ze tří párů polypeptidů ()2; řetězce kovalentně propojeny disulfidickými můstky v N-části molekul (C-konce jsou rozvolněné) Fibrinogen Fibrinogen • fibrinogen je posledním stupněm (zymogenem) koalgulační kaskády, je aktivován proteázou trombinem, který přeměňuje fibrinogen na fibrinové monomery, které následně polymerují a tvoří hustou síť vláken • síť je dále stabilizována tvorbou vazeb mezi postranními řetězci ECM v epitelech • epiteliální list: apikální povrch bazální povrch  další druhy tkáně • polarizace buněk Bazální membrána (bazální lamina) • tenká tuhá vrstva ECM pod bazálním povrchem • tloušťka 50 – 200 nm • kolagen IV (síťová struktura), laminin, entaktin (spojovací protein) plicní epitel rohovka (kuřecí embryo) Různé způsoby uspořádání epitelu jednoduchý vrstevnatý ECM u živočichů: Degradace ECM Degradace ECM • řízená: embryogeneze, hojení ran, uvolnění endometria při menstruaci, angiogeneze, zánět • neřízená: metastazování degenerativní poruchy (emfyzém, artritida) • matrix metaloproteinázy (MMPs) MMPs • MMPs (23): 14-17 transmembránové, ostatní: sekrece • vazba pro-MMP na povrchové receptory • pro-MMP: autoinhibiční propetid (za signální sekvencí)  proteolýza  aktivace  MMP Yong VW et al, Nat Rev Neurosci 2: 502, 2001 Fields GB, Cells 8: 984, 2019 Obecná struktura MMPs • propeptid: inaktivuje MMP (zymogen), pro aktivaci musí být odštěpen (ec) • katalytická doména: váže Zn2+ iont • hinge oblast: spojuje katalytickou a Ckoncovou doménu • C-koncová (HPX) doména: proteinproteinové interakceMT1-MMP (membránový typ) Egeblad M, Werb Z, Nat Rev Cancer 2 (3): 161, 2002 Struktura některých MMPs Extracelulární proteinázy • MMPs (23) • ADAMs (A Disintegrin And Metalloproteinase) (13) • ADAMTS (A Disintegrin-like And Metalloproteinase Domain with Thrombospondine Type 1 Repeat) (29) Paulissen G. et al, Respiratory Res 10: 127, 2009 Úloha MMPs (ec proteináz) • degradace struktur ECM • degradace biomolekul (receptory, ligandy, cytokiny, chemokiny)  signalizace  buněčná proliferace, migrace, diferenciace, angiogeneze, apoptóza, obrana hostitele, … Young D. et al, Int J Mol Sci 20: 3847, 2019 Úloha některých MMPs v signalizaci Egeblad M, Werb Z, Nat Rev Cancer 2 (3): 161-174, 2002 Úloha (a exprese) MMPs v karcinogenezi TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases) • 4 různé TIMP 1-4 • inaktivují (regulují) všechny MMPs, ADAMs a ADAMTs • struktura molekuly: 184-194 AA, 21-22 kDa; 12 Cys  disulfidické můstky  6 smyček Cao J a Zucker S, www.abcam.comMohammed FF et al, Ann Rheum Dis 62 (Suppl II): ii43-47, 2003 Jackson HW et al, Nat Rev Cancer 17: 38-53, 2017 TIMPs jsou součástí (vrcholem) složité biologické sítě Příklady ECM  savčí ECM tvořena asi 300 proteiny (včetně kolagenů, proteoglykanů a glykoproteinů) někdy označovanými jako matrisom  2 hlavní typy ECM: • intersticiální pojivová tkáňová matrix • bazální membrána Theocharisetal,2019 Epitel: (1) Bazální membrána je unikátní pericelulární matrix, kterou tvoří především lamininy a kolagen IV, které propojují perlecan a nidogeny; epiteliální buňky jsou spojeny s BM pomocí desmosomů a integrinů. (2) S dalšími vrstvami ECM BM interaguje prostřednictvím kolagenů VI a VII, které interagují s kolagenem I a IV, perlecanem a lamininy. (3) Hlavní součástí intersticiální matrix jsou kolageny I, III a V, dále elastin, proteoglykany a HA. (4) Se složkami ECM interagují buněčné receptory (integriny, DDRs, glypikany) a růstové faktory (TGF). (5) K pevnosti ECM přispívají agregáty HA a hyalektanů. Interagují s některými buněčnými receptory (CD44). Theocharis AD et al, FEBS J 286: 2830-2869, 2019 ECM kostí: obsahuje fibrily kolagenu I, které slouží jako nukleační centra pro hydroxyapatity; mineralizaci kostí zajišťuje několik složek ECM, například SIBLING, OCN, OPN (osteopontin) a SLRPs (small leucine-rich proteoglycans) ECM chrupavky: (1) chondrocyty jsou obklopeny pericelulární matrix s kolagenem IV a perlecanem; (2) okolní matrix je tvořená kolagenem II, IX, SLRPs; (3) mezi fibrilami kolagenu II jsou zachyceny velké agregáty HA a aggrekanu Theocharis AD et al, FEBS J 286: 2830-2869, 2019