Remodelace
chromatinu
Přednáška kurzu Molekulární biologie eukaryot
7. a 14.11.2019
Jana Šmardová
Jan Šmarda
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Kovalentní modifikace histonů
- pokračování 14.11.2019
Fosforylace histonů
• fosforylace H3 během mitózy (popsáno 1974, 1978) na serinu S10
a S28 (v sekvenčních motivech –ARKS–) spojena s kondenzací
chromozomů
 kináza Aurora B
 nemá lokální omezení: začíná v heterochromatinových
pericentrických oblastech a pokračuje podél celých chromozomů
 fosforylace začíná s nástupem mitózy, kulminuje v metafázi a
rychle klesá po anafázi
Fosforylace histonů během mitózy
Sawicka A a Seiser C. Biochemie 94: 2193-2201, 2012
• fosforylovány především serinové a také threoninové zbytky
• mitogenní signály spouštějí kaskádu MAP kináz:
Rsk-2 („ribosomal subunit protein S6 kinase 2“) fosforyluje H3 na
S10: tato fosforylace „otevírá“ strukturu chromatinu a umožňuje
aktivaci (transkripci) genů spojených s buněčným dělením
podle typu stimulace další, příbuzné histon kinázy – např. MSK1
(„mitogen- and sress-activated kinase 1“).
• tato fosforylace H3 je lokálně omezena do oblastí cílových genů
 Jak je zajištěn tak odlišný způsob fosforylace H3 S10 (a
jejího dopadu!) při aktivaci transkripce a při kondenzaci
chromozomů??
Fosforylace histonů: regulace
transkripce
• fosforylace histonů je funkčně provázaná s acetylací: fosforylace
H3 S10 a simultánní acetylace K14 - 2 modely:
Sawicka A a Seiser C. Biochemie 94: 2193-2201, 2012
• synergistické kroky: fosforylace
H3 S10 (krok 1) umožňuje
přístup acetyltransferáz (krok 2)
a acetylaci H3 K9 nebo K14
• nezávislé kroky: k fosforylaci
H3 S10 dochází na
acetylovaném histonu H3 K9
nebo K14, ale ty modifikace se
navzájem nepodmiňují
Fosforylace histonů: regulace
transkripce
Fosforylace
histonu H3:
regulátory a pozice
Sawicka A a Seiser C. Biochemie 94: 2193-2201, 2012
Fosforylace histonů
Gil RA et Vagnarelli P. BBA - Mol Cell Res 1866: 90-101, 2019
 AA zbytky fosforylované:
• během mitózy
• během transkripce,
• při poškození DNA
• kontrolní bod
mitotického vřeténka
Fosforylace histonů: regulace
transkripce
Sawicka A a Seiser C. Biochemie 94: 2193-2201, 2012
• v bezprostředním sousedství S10 a S28 jsou lysiny K9 a
K27, které mohou být metylovány a tak reprimovat
transkripci
• navržena hypotéza „fosfo/metyl přepnutí“, podle které
fosforylace serinů vede k dočasnému uvolnění
represivních proteinů („čtenářů metylovaných lysinů“) a k
aktivaci transkripce
Fosforylace histonů: regulace
transkripce
Sawicka A a Seiser C. Biochemie 94: 2193-2201, 2012
 promotor reprimovaný vazbou proteinu HP1 na dimetylovaný H3K9me2 
fosforylace H3S10 vede k uvolnění represoru HP1, acetylaci H3K14 a vazbu 14-3-3
 transkripce je aktivována i v přítomnosti „represivní“ značky H3K9me2
 promotor je reprimovaný vazbou proteinu PcG na trimetylovaný
H3K27me3  fosforylace H3S28 a uvolnění represoru PcG 
transkripce je aktivována i v přítomnosti „represivní“ značky H3K27me3
Coffinův-Lowriho syndrom
 vrozené vývojové onemocnění spojené s těžkými
psychomotorickými poruchami, obličejovými a
progresivními skeletálními deformacemi
 příčinou je zárodečná mutace genu pro Rsk-2
(fosforyluje vedle H3 také například CREB jako
odpověď na některé mitogenní signály)
 gen je lokalizován na chromozomu X (Xp22.2);
dědičnost dominantní, vázaná na X - retardace
se výrazněji projevuje u mužů
Metylace histonů
• metylovány mohou být lysiny a argininy
• argininy mohou být mono- a di-metylovány
• lysiny mohou být mono-, di- a tri-metylovány
 různě metylované zbytky argininu a lysinu mění
vazebnou afinitu mnoha proteinů k histonům
Metylace histonů
 jaderné receptory aktivují transkripci za účasti
mnoha koaktivátorů (např. z rodiny proteinů p160); s
nimi interaguje také metyltransferáza CARM1
(„coactivator-associated arginine methyltransferase
1“)/PRMT4: metyluje zbytky argininu na H3 a
potencuje transaktivaci jadernými receptory
 histon metyltransferázy PRMT1, 2, 3, CARM1/PRMT4
a PRMT5/JBP1 metylují například H4 R3, H3 R17
 metyltransferázy PRMTs metylují také nehistonové
proteiny
 popsána (například) synergie p300, CARM1 a PRMT1
Metylace histonů - arginin
Metylace nehistonových proteinů
Model regulace specificity CBP/p300 by
CARM1
 CBP funguje jako integrátor signálních drah: není příliš specifický,
funguje jako aktivátor mnoha různých TF. Je v buňce přítomen v
nízké hladině a faktory o něj soutěží ( haploinsuficience).
 CARM1 interaguje s koaktivátory p160 a metyluje CBP/p300.
 Metylace CBP/p300 mění jeho specifitu: ztrácí afinitu k části TF
(např. CREB, Myb), pro které funguje jako koaktivátor  zvyšuje se
jeho afinita k ostatním TF (např. jaderným receptorům).
 Regulace transkripce aktivované jadernými receptory komplexem
obsahujícím CARM1 a CBP/p300:
1. acetylace histonů
2. metylace histonů
3. metylace CBP/p300 a další potencování acetylace histonů
Xu et al, 2001
Synergie p300, CARM1 a PRMT1
Aktivace transkripce genů prostřednictvím metylace argininů
Litt M et al. Biosci Rep
29: 131-141, 2009
• Suv39H1 trimetyluje lysin K9 histonu H3
 účastní se genově specifické represe: v komplexu s
HDACs (např. pRB)
 účastní se represe pericentrického
heterochromatinu - za účasti proteinu HP1
(„heterochromatin-associated protein-1“).
 metylace K9 H3 interferuje s fosforylací S10
 metylace K9 H3 + hypoacetylace H4 = znak heterochromatinu
Metylace histonů - lysiny
Jaký mechanismus je podstatou
antagonismu PU.1 a GATA1?
K aktivaci svých cílových genů v
erytroidních buňkách potřebuje
GATA1 protein CBP. Vysoká
hladina PU.1 ale odebírá CBP z
vazby na GATA1. Naopak to
vede k vazbě Rb a Suv39H, což
vede k metylaci K9 H3,
následnému navázání proteinu
HP1 a k výrazné (aktivní!)
represi cílových genů.
Graf T and Enver T, Nature 2009
Paradigma PU.1:GATA1:
kovalentní modifikace histonů
myeloidní buňky
(PU.1)
erytroidní buňky
(GATA1)
Metylace histonů
aktivacereprese
Trimetylace histonů na lysinech
• trimetylace lysinu 4 histonu H3 (H3K4me3) je detekována v
promotorech transkripčně aktivních genů,
zatímco…
• trimetylace lysinu 9 histonu H3 (H3K9me3) a lysinu 27 histonu H3
(H3K27me3) je přítomna v promotorech transkripčně
reprimovaných genů
 modifikace H3K9me3 a H3K27me3 představují klíčový umlčovací
mechanismus v savčích buňkách; H3K9me3 pracuje ve spojení s
metylací DNA, zatímco H3K27me3 obvykle funguje bez spojení s
metylací DNA
 společný (tj. dvojznačný) výskyt modifikace H3K4me3 a H3K27me3
v promotorech některých genů (např. v kmenových buňkách) jsou
znakem vývojově důležitých genů („fenotypová plasticita“)
Cornett EM et al. Mol Cell 75:1092-1101, 2019
KMT – lysin metyl transferázy
KDM – lysin demetylázy
Metylace DNA a metylace histonů
 některé histonmetyltransferázy (HMTs; např. G9a,
Suv39H1) mohou směrovat / navádět DNA
metyltransferázy (DNMTs) do specifických oblastí
genomu a přispívat tak ke stabilitě umlčení některých
genů
APL: „gene lock-up“
 Příklad zprostředkování epigenetického umlčování genů: Protein
PML-RAR (patologicky) přechodně reprimuje cílové geny RAR.
Přivádí do oblasti HDACs a DNMT a navozuje stabilní umlčení
těchto cílových genů.
Quina AS et al, Biochem Pharm 72: 1563-1569, 2006
Villa R et al. Biochem Pharm 68: 1247-1254, 2004
APL: „gene lock-up“
Metylace DNA a metylace
histonů
 některé histonmetyltransferázy (HMTs; např. G9a, Suv39H1)
mohou směrovat / navádět DNA metyltransferázy (DNMTs) do
specifických oblastí genomu a přispívat tak ke stabilitě umlčení
některých genů
 transkripční umlčování (během procesu
kancerogeneze)
1.mono-, di- a tri-metylace H3K27
2.ubikvitinace H2AK119
3.metylace DNA
Stahl M. et al. PLOS Genet 2016, DOI:10.1371/journal.pgen.1006193
Ubikvitinace histonů
• monoubikvitinace, a to na C-konci histonů: K119 histonu H2A a
K123 histonu H2B
• spojeno s transkripčně aktivním nebo naopak reprimovaným (H2A
K119) stavem chromatinu
• polyubikvitinace histonů je také integrální součástí oprav DNA
 jako odpověď na poškození DNA (DSBs) jsou ubikvitinovány histony
H2A a H2AX na K63 (histon ubikvitin ligázou RNF8);
 tato ubikvitinace:
• reprimuje elongaci mRNA
• má tendenci se šířit (amplifikovat) podél chromozomu od místa
DS zlomu, což by mohlo vést k nekontrolovanému umlčení genů;
proto následuje její aktivní – regulované - zastavení
Gudjonsson T et al., 2012
Ubikvitinace histonů
 Během replikace DNA nemůže být metylované vlákno replikované
kanonickým replikačním systémem, a tak se tvoří hemimetylovaná
DNA. K ní se specificky váže ubikvitinligáza Uhrf1 a ubikvitinuje
H3K23 a/nebo H3K18. To přivádí Dnmt1, která následně metyluje
DNA.
Nishiyama A et al., J Biochem 159(1): 9-15, 2015
Serotonylace histonů
Serotonin (5-HT)
• neurotransmiter
• účastní se procesů, které se podílejí na vzniku nálad;
jeho nedostatek může způsobovat deprese, poruchy
spánku, podrážděnost, agresivitu, bipolární poruchu,
chorobnou úzkost…
• podporuje kontrakce hladkého svalstva a krevní
srážlivost (význam při krvácivých poraněních)
Serotonylace histonů:
„Can the brain have happy
chromatin?“
Serotonin (5-HT)
1. funguje prostřednictvím nekovalentních interakcí s
příslušnými cytoplazmatickými receptory (typu GPCR),
které následně aktivují signální kaskády
2. receptor-independentně: translgutamináza 2 (TGM2)
kovalentně váže serotonin (a další monoaminové
substráty, včetně dopaminu, histaminů,..) na:
 nejrůznější proteiny (včetně např. malých GTPáz)
 histony: glutamin 5 histonu H3: H3Q5(5-HT)
Anastas JN a Shi Y. Mol Cell 74: 418-419, 2019
Serotonylace histonů
H3Q5(5-HT)
• během diferenciace neurálních
progenitorů
• spekuluje se, že ovlivňuje
transkripci
• objevuje se společně s H3K4me3,
která je znakem aktivní transkripce
(tyto dvě modifikace se navzájem
nepodmiňují)
• H3Q5(5-HT)/ H3K4me3 stimulují
vazbu TFIID k chromatinu
Farelly LA et al. Nature 567: 535-539, 2019; Anastas JN a Shi Y. Mol Cell 74: 418-419, 2019
spekulace
 změny modifikací chromatinu by mohly být molekulární podstatou
kognitivních funkcí, emocí a dalších funkcí mozku
Mechanismus účinku
kovalentních modifikací histonů
1. modifikace = redukce pozitivního náboje histonů  oslabení
interakcí mezi histony a DNA
2. modifikace  sterická inhibice kondenzace chromatinu vyššího
stupně
? fosforylace, metylace, ubikvitinace… histonů spojena s
kondenzací a/nebo represí transkripce, ale také s aktivací
transkripce; některé modifikace mohou být aktivující i reprimující
?
3. Hypotéza histonového kódu
Hypotéza „histonového kódu“
 konkrétní kovalentní modifikace nebo jejich kombinace
(konfigurace) představují specifické značky pro
specifické proteinové komplexy („readers“) s odlišnými
funkcemi („formátování textu genetické informace“)
 komplexní epigenetické rozlišení odlišných oblastí genomu, například:
– promotory: H3K4me3
– enhancery: H3K3me1
– aktivní regulační oblasti: H3K9ac, H3K27ac
– transkribované oblasti: H3K79me2, H4K20me1
– oblasti reprimované Polycomb: H3K27me3
– pericentrický heterochromatin: H3K9me3
 nikoli kód ve smyslu povelů, ale bohatý, dynamický „crosstalk“
Hassler MR a Egger G, 2012
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
• pozice a hustota
nukleozomů ovlivňuje
úroveň přístupnosti DNA
pro proteiny
• NDR – „nucleosome
depleted regions“
• aktivní geny mají v oblasti
před začátkem transkripce
– v oblastech, kde se váží
TFs - NDRs
• reprimované geny je
obvykle nemají
Hassler MR a Egger G, 2012
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
 multiproteinové komplexy, které mění konformaci
histonů a DNA v nukleozomu, tj. strukturu/pozici
nukleozomů; využívají k tomu energii z hydrolýzy ATP
• SWI/SNF, RSC, NURF, CHRAC, ACF, FACT, Mi-2/NuRD,…
 klasifikují se do čtyř rodin na základě sekvenční podobnosti
ATPázové domény:
• SWI/SNF (switch/sucrose-non-fermenting)
• ISWI (imitation switch)
• CHD (chromodomain-helicase-DNA binding)
• INO80 (inositol requiring 80)
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
doménová struktura ATPázové podjednotky čtyř rodin
ATP-dependentních chromatin remodelujících komplexů
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
Tyagi M et al. Nucleus 7(4):388-404, 2016
doménová struktura ATPázové podjednotky čtyř rodin
ATP-dependentních chromatin remodelujících komplexů
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
 ATPázová podjednotka váže a hydrolyzuje ATP,
asociované podjednotky modulují katalytickou aktivitu
ATPázy a určují genovou specifitu
 sestavování různých kombinací ATPázových
podjednotek a asociovaných podjednotek tvoří různé
ATP-dependentní chromatin remodelující komplexy s
tkáňově a buněčně specifickými funkcemi
Struktura některých ATP-dependentních
chromatin remodelujících komplexů
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
Struktura některých ATP-dependentních
chromatin remodelujících komplexů
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
 aktivita ATP-dependentních chromatin remodelujících komplexů je
obecně nutná všude tam, kde se proměňuje uspořádání nukleozomů,
pro udržování chromatinové plasticity
 zda participuje na aktivaci nebo represi, záleží více na rovnováze
ostatních ko-aktivujících nebo ko-reprimujících aktivit, tj. na struktuře
komplexu (asociovaných podjednotek) a jeho dalších interakcích
 (podle novějších pozorování ADCHRK stimulují transkripci skupiny
genů a simultánně inhibují nepatřičnou expresi jiných genů…)
 jejich součinnost nutná pro aktivátory i represory
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
Struktura chromatinu a
transkripční aktivita genů
Pozice nukleozomů:
• b: v promotoru konstitutivně exprimovaného genu pravděpodobně
vysoký obsah AT snižuje pravděpodobnost vytvoření stabilního
nukleozomu;
• c: v promotoru reprimovaného genu je oblast pro vazbu TF obsazena
nukleozomem; pro aktivaci transkripce je nezbytná „mobilizace“
nukleozomů
Bell et al. 2011
Mobilita a stabilita nukleozomů
Pozice nukleozomů je ovlivněna:
• působením-ATP dependentních remodelujících komplexů;
• složením histonového oktameru a modifikací histonů: přítomnost
histonových variant (žlutě) a posttranslační modifikace histonů
(červeně) ovlivňují afinitu k chromatin-modifikujícím proteinům (modře)
Bell et al. 2011
„ATP-dependent chromatin remodeling
during mammalian development“
 tkáňově specifické podjednotky ATP-dependentních
chromatin remodelujících komplexů často tvoří
unikátní komplexy, které spolupracují s transkripčními
faktory specifickými pro buněčné linie
 ty je přivádějí do regulačních míst v genomu, kde
remodelují chromatin a usnadňují vazbu
transkripčních faktorů a tak regulují lineage-specific
genovou transkripci
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
„ATP-dependent chromatin remodeling
during mammalian development“
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
Hypotéza “průkopnických (pioneer)
faktorů“
Henikoff S a Ramachandran S. Mol Cell 71:191-194, 2018
 sekvenčně specifické transkripční faktory stojí na
vrcholu hierarchie buněčné regulace
Průkopnické faktory
 určují, reprogramují buněčný „osud“, linii
 schopné interakce s „tichým“, nepozměněným
chromatinem, iniciují aktivaci transkripčního
programu, který vede ke změně buněčného osudu
 verbují aktivátory a represory, které samy nejsou
schopné interagovat s „tichým“ chromatinem
Morris SA. Development 143:2696-2705, 2016
1. určují, reprogramují buněčný „osud“, linii
2. schopné interakce s „tichým“, nepozměněným chromatinem, iniciují
aktivaci transkripce
Morris SA. Development 143: 2696-2705, 2016
Hypotéza “průkopnických (pioneer)
faktorů“
sekvenčně specifické transkripční
faktory
+
ATP dependentní chromatin
remodelující komplexy
„ATP-dependent chromatin remodeling
during mammalian development“
 tkáňově specifické podjednotky ATP-dependentních
chromatin remodelujících komplexů často tvoří
unikátní komplexy, které spolupracují s transkripčními
faktory specifickými pro buněčné linie
 ty je přivádějí do regulačních míst v genomu, kde
remodelují chromatin a usnadňují vazbu
transkripčních faktorů a tak regulují lineage-specific
genovou transkripci
Hota a Bruneau. Development 143:2882-2897, 2016
Histonové varianty
Histonové varianty
• Vedle hlavních typů histonů existují histonové varianty, např.
H3.3 (liší se od H3 pouze ve 4 aminokyselinách) a H2A.Z, které
jsou preferenčně přítomny v oblastech transkripčně aktivního
chromatinu.
• Jsou kódovány nezávislými geny. Jsou exprimovány a
inkorporovány v závislosti na průběhu buněčného cyklu,
nezávisle na expresi kanonických histonů.
• Ovlivňují, mění stabilitu nukleozomů.
• histon CENP-A je specifický pro centromerické oblasti
• histon macroH2A: inaktivní chromozom X
• histon γH2AX: dvouřetězcové zlomy DNA
Nekódující RNA
Nekódující RNA
 významné modulátory regulace chromatinu a genové
exprese
 asi 90% genomu je aktivně transkribováno, ačkoliv
pouze 2% představují geny kódující proteiny!!
• malé ncRNAs: tRNAs, rRNAs, miRNAs (micro),
piRNA (piwi interacting), snoRNAs (small nuclear)
• dlouhé lncRNAs: mRNA-like transcripty, které
nekódují proteiny, lincRNAs (long intergenic noncoding);
např. XIST a TSIX, které se podílejí na
umlčování chromozomu X
• T-UCRs: transcribed ultraconserved regions
Součinnost jednotlivých typů
přestavby chromatinu
Komplexní epigenetické rozlišení
odlišných oblastí genu
Hassler MR a Egger G, 2012
Inaktivace chromozomu X
X chromozom
~ 900-1500 genů
Y chromozom
~ 70 genů
Inaktivace chromozomu X
Kompenzace dávky genů
 inaktivace jednoho chromozomu X (XCI) v samičích buňkách (
Barrovo tělísko/tělíska)
 část genů (asi 20-30%) uniká inaktivaci, k jejich přepisu dochází na
aktivním i inaktivním X; v samičích buňkách je jejich exprese vyšší,
což zřejmě vede k vývoji pohlavních rozdílů
Xic - inaktivační centrum CH X (X-inactivation center)
• v proximální části dlouhého raménka, v pozici Xq13
• obsahuje neobvyklý gen xist (X-inactive-specific transcript)
• produktem xist je dlouhá nekódující RNA (lncRNA; první objevená
~1990), která zůstává uvnitř jádra v asociaci s inaktivním X
tsix – antisense transkript Xist, regulátor xist
U nediferencovaných buněk v časném embryu, kdy jsou všechny
chromozomy X aktivní:
• xist i antisense tsix jsou oba exprimovány
Diferenciační signály během vývoje 
• na jednom X je suprimována exprese tsix, zatímco pokračuje
exprese xist  budoucí inaktivní X
• na druhém X pokračuje exprese jak xist tak tsix  budoucí aktivní
X
Inaktivace chromozomu X
Inaktivace chromozomu X
Fang H et al. Front Cell Dev Biol 7: 219, 2019
Průběh inaktivace chromozomu X:
1. upregulace xist a následný Xist RNA coating - netranslatovaná
RNA pokryje povrch inaktivovaného chromozomu X  připojení
polycomb silencing complexes 1 a 2 PRC1 a PRC2
2. deacetylace H3K27ac (HDAC3) + ubikvitinace H2K119Ubi (PRC1)
3. trimetylace H3K27me3 (PRC2)
4. inkorporace histonu macroH2A a DNA metylace CpG ostrůvků
(DNMT3B)
Přestavba chromatinu a
nádorová onemocnění
 „Někteří považují pohled na život, jak ho vytváří rodící se biologie
21. století, za bolestně komplikovaný, až perverzní. My si
myslíme, že historická komplexita a univerzalita, o kterých nyní
víme, že jsou pro život charakteristické, jsou inspirací a výzvou.“
Rose MR, Oakley TH. Biology Direct 2007; doi:10.1186/1745-6150-2-30
Rose a Oakley: Nová biologie:
po moderní syntéze