MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT
podzim 2018
Restrikčně-modifikační systémy prokaryot
Ivana Mašlaňová
iva.maslanova@gmail.com
1
RM systém – obranný mechanismus hostitele
1950s – poprvé pozorován proces restrikce a modifikace – růst bakteriofágů na
různých kmenech
1962 – molekulární podstatu restrikce a modifikace popsal Arber a Dussoix, popsali
hostitelem řízené modifikace fága λ
Hlavní znaky RM systémů:
- endonukleolytické štěpení cizorodé DNA – DNA hostitele je chráněna metylací
adenosinů nebo cytosinů v definovaných místech (rozpoznávací místa) sekvence.
- RM systém obsahuje složky: restrikční endonukleázu (RE), DNA-metyltransferázu
(Mtase)
Dvě skupiny R-M systémů:
- (a) R-M systémy, štěpící nemodifikovanou DNA (výjimkou enzymy podtypu IIM
rozpoznávající a štěpící metylovanou DNA např. DpnI, BisI, GlaI).
- (b) enzymy štěpící modifikovanou DNA např. enzymy, EcoKMcrA, EcoKMcrBC a EcoKMrr,
všechny z Escherichia coli K (Roberts a kol., 2007).
- Typy RM systémů (podle struktury): I, II, III, IV a V
RM systém – obranný mechanismus hostitele
Názvosloví restrikčních enzymů, mertyltransferáz a jejich genů:
- 1973: H. O. Smith a D. Nathans navrhli systém pravidel, podle
kterých byly pojmenovány jak existující, tak i nově objevené
enzymy účastnící se procesu restrikce a modifikace DNA
- název enzymu začíná třemi písmeny - první velké písmeno počáteční
písmeno rodu a následující dvě malá písmena počátečními
písmeny druhu
- Např. enzym HindII – enzym získaných z bakterie Haemophilus influenzae sérotypu
d, římská číslice se používá na odlišení většího počtu enzymů izolovaných ze stejného
organismu.
- Rozdělení restrikčních enzymů na tři hlavní typy (typ I, typ II, typ III a typ IV):
Typ I - podtypy IA, IB, IC, ID a podtyp IE
Typ II - podtypy IIA, IIB, IIC, IIE, IIF, IIG, IIH, IIM, IIP, IIS, IIT.
Typ IV - enzymy štěpící pouze metylovanou DNA a vykazující malou specifitu, pokud
jde o rozpoznávání specifických sekvencí DNA.
RM systém – obranný mechanismus hostitele
RM sytém rozpoznává cizorodou DNA – stav metylace, nemetylovaná DNA je rozeznána restrikční
endonukleázou (REase), metylaci rozpoznávaných míst na hostitelském chromozomu
zprostředkovávají metyltransferázy (MRase) RM systému.
Restrikce a modifikace fágové DNA
Kmeny E. coli K a E. coli K (P1)+ mají vzájemně
odlišnou hostitelskou
specifitu (K a P1) = obsahují odlišné RM-
systémy
Fágy po jednom růstovém cyklu na hostiteli
získávají nové hostitelské spektrum.
Nejedná se o mutaci - změna se týká celé
populace a není dědičná – epigenetická
záležitost.
po jednom cyklu
Experimentální důkaz přítomnosti a působení RM systémů
Kmen E. coli
obsahující RM
systém EcoB
Kmen E. coli
obsahující RM
systém EcoK
nemodifikovaný fág
Plaka vytvořená
fágem, který se
na kmeni B
modifikoval
Plaka vytvořená
fágem, který se na
kmeni K modifikoval
• Složkami standardního restrikčně-modifikačního (RM) systému
jsou sekvenčně specifické enzymy:
• A. modifikační metyláza (metyltransferáza)
• B. restrikční endonukleáza
• Restrikci a modifikaci podléhá jen dsDNA:
• Při infekci fágem
• Při přenosech DNA transdukcí a konjugací, omezeně transformací
(při uměle navozené transformaci)
Monitorování příjmu exogenní DNA – „imunitní systém prokaryot“
RESTRIKČNĚ-MODIFIKAČNÍ (RM) SYSTÉMY
N6mA
C5mC
Donor metylové skupiny:
SAM (AdoMet)
Metylované báze v DNA
Single-mplecule real-time (SMRT)
-detekce metylované DNA
(A) Cytosin – C4metylcytosin,
C5metylcitosin
(B) Adenin – N6metyladenin
C4mC
SYSTÉMY RESTRIKCE A METYLACE
• Hsd systémy (host specificity of DNA)
• třídy (typy) I, II, III, IV
restrikční a metylační aktivita
• Systémy restrikce modifikované DNA
• Mar, Mrr (methylated-adenine), DpnI
• Mcr (methylated-cytosine)
• Systémy metylující specifické sekvence DNA
• Dam (adenine-methylation)
• Dcm (cytosine-methylation)
Host specifity
determinant
Vlastnost R-M systémy typu I R-M systémy typu II R-M systémy typu III
Struktura
jeden multifunkční enzym
složený ze tří různých
podjednotek
restrikční endonukleáza a
metyltransferáza jsou dva
oddělené enzymy
jeden multifunkční enzym
složený ze dvou různých
podjednotek
Kofaktory potřebné
pro restrikci DNA
ATP, SAM*, Mg2+ Mg2+ ATP
Stimulační kofaktory
pro restrikci DNA
žádné žádné SAM*, Mg2+
Kofaktory potřebné
pro modifikaci DNA
SAM* SAM* SAM*
Stimulační kofaktory
pro modifikaci DNA
ATP, Mg2+ žádné ATP, Mg2+
Rozpoznávací
sekvence
asymetrická, složená ze
dvou sekvencí oddělených
mezerníkovou oblastí
délka 4-6 bp, většinou
palindromatická
asymetrická, složená ze dvou
opačně orientovaných sekvencí
oddělených mezerníkovou oblastí
Místo štěpení DNA
náhodné, vzdálenost od
rozpoznávací sekvence
řádově stovky až tisíce bp
konstantní, je štěpena
rozpoznávací sekvence nebo
místo poblíž této sekvence
konstantní, vzdálenost od jedné
ze dvou rozpoznávacích sekvencí
24-26 bp
Translokace DNA Ano Ne Ano
*S-adenosylmetionin
Charakteristika RM systémů typu I, II a III
Charakteristika RM systémů typů I-IV
Charakteristika RM systémů typu I, II a III
Rebase: 75 tis 13 tis 18 tis
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.enz.html
Strukturní a funkční organizace RM systémů typu I-III
(a) Uspořádání genů;
hsdM, M, mod – geny
pro DNAmetyltransferázu,
hsdR,
R, res – geny pro RE,
hsdS – gen pro DNA
rozpoznávací protein u
typu I
(b) příklady rozpoznávací
sekvence
(c) složení DNAmetylačního
komplexu,
M- metyltransferáza, SDNA-binding
protein
(d) složení DNAhdrolyzačního
komplexu
(a) Type I RM systém (b) Type II RM (c) Type III RM
Proces metylace a restrikce DNA u RM typů I, II, III
GENY KÓDUJÍCÍ RM-SYSTÉMY JSOU NESENY NA RŮZNÝCH
REPLIKONECH
lokalizace genů na chromozomu, plazmidech, nebo profágách
Mobilní element Příklad RM systému
Plazmid
paeR71 P. aeruginosa
ecoRI E. coli
ssoII Shigella sonnei
bsp6I Bacillus sp.
Bakteriofág/profág
hindIII H. influenzae
sau42I S. aureus
ecoO1091 E. coli
bsuMI B. subtilis
Integrační kumulativní
element/genomický
ostrov
Sth368I Streptocvoccus thermophilus
hsdMS S. aureus
Transpozon Rle39BI
Integron
xbaI Xanthomonas campestris
M.Vch0211 Vibrio cholera
hphI Vibrio metschnikovii
CAA68 Lactococcus lactis
Přítomnost genů RM systémů na mobilních elementech
PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍ
ENZYMOVÉHO KOMPLEXU
TYPU I
Multifunkční komplex
S = rozpoznání cílové sekvence
M = vazebné místo pro SAM a
aktivní místo pro metylaci
R = aktivní místo pro hydrolýzu
ATP, pro translokaci DNA a pro
štěpení
Komplex schopný pouze metylace
Alosterický efektor umožňující
rozpoznání cílové sekvence
SAM se uvolňuje
před štěpením
INTERAKCE ENZYMŮ RM SYSTÉMU TYPU I
S CÍLOVOU SEKVENCÍ NA DNA
1. Vyhledání rozpoznávací
sekvence
2. Podle stavu sekvence (M,
NM, H-M) dochází k
a) uvolnění enzymu
b) restrikci
c) metylaci
Interakce enzymového
komplexu s rozpoznávacím
místem
štěpení
MODELY TRANSLOKACE DNA ZPROSTŘEDKOVANÉ
ENZYMY RM SYSTÉMŮ TYPU I
Pokud jsou místa nemodifikovaná, vytváří se rozpoznávací
komplex, vázaný na rozpoznávací místo, a jím je DNA protahována
(translokována) až k místu vzdálenému zhruba 1000 bp nebo více,
kde pak proběhne štěpení.
Smyčky pozorované v EM
S- podjednotka –
specifická vazba na
rozpoznávací místo v
DNA, dvě rozpoznávací
domény (TRD1, TRD2 –
target recognition domains)
M1,2 – metyltransferáza
– modifikace DNA
SAM
M1,2 -
metyltransferázy
S- podjednotka R1,2 – dvě molekuly endonukleáz
Obousměrná
translokace
DNA vede k
vytvoření
smyček
ATP-dependentní translokace DNA - ke štěpení dochází po kolizi
DNA řetězců v místě navázaného enzymu
Navázaný restrikční enzym
smyčka
TRD = target recognition domain
Geny hsdS mohou rekombinovat –
představují dvě alely
Struktura rozpoznávací podjednotky - S
Vytváření RM systému typu I s novými sekvenčními specifitami
Pro RM systém typu I je nezbytná
funkční hsdS –
její mutace vede k fenotypu r- m-.
S- M-RMUTACE
V GENECH RM SYSTÉMU
r+/-/mRestrikčně-deficientní
mutanty
r-/m-
r-/m+
RM SYSTÉMY, U NICHŽ JE ŠTĚPENA CIZORODÁ
MODIFIKOVANÁ DNA
(KMEN NETVOŘÍ METYLÁZU)
• E. coli K12
• Mar = methyladenine restriction (GmeAC, GmeAG)
• Mrr = methyladenine recognition and restriction
• Mcr = methylcytosine restriction - modified cytosine
restriction (GmeCG - C5, N4, HM-C5) - štěpení sekvence v
několika místech (štěpí též neglukozylovanou fágovou
DNA)
• Diplocooccus (Streptococcus) pneumoniae:
RM systém DpnI - štěpí GmACT
• (Caulobacter, Neisseria, Acholeplasma, Streptomyces)
Kóduje místně
specifickou
metylázu
Na úrovni
populace
Standardní
RM systém
SYSTÉMY METYLACE DNA (E. COLI K12)
1. Systém Dam (dam-metyláza)
• metylace A v GATC (donor met = SAM)
• GATC - regulační funkce: počátek replikace, promotory, reparace,
transpozice
• sekvence GATC je rozpoznávána 15% RE typu II, je přítomna u
50% všech 4N-RM-systémů, není však cílovou sekvencí pro
restriktázy v žádném z druhů enterobaktérií.
2. DNA cytozin metylační - Dcm (E. coli K12)
• metylace cytozinu na C5 v sekvenci CC(A/T)GG
(?funkce při reparaci na velmi krátké vzdálenosti)
- V buňkách není přítomna RE rozpoznávající metylovanou sekvenci – nejedná se
tudíž o standardní RM systém
VÝZNAM RESTRIKCE
• Ochrana integrity vlastní DNA
• obrana před bakteriofágy (typ II)
dočasné působení – epigenetické změny, na úrovni populace nutná
obměna
• Systém napomáhající rekombinaci cizorodé DNA (typ I)
• štěpení DNA (náhodně) mimo rozpoznávací sekvenci umožní
rekombinaci mnoha genů - analýza přenosu genů transdukcí a
konjugací podporuje vliv RM systémů při vzniku mozaikových genomů
(E. coli)
• ? „Selfish DNA“
• molekulární paraziti bakterií. RM systémy typu II se udržují
prostřednictvím plazmidů, které je kódují (usmrcení bezplazmidových
buněk)
RM systémy jako mechanismus postsegregačního zabíjení
restriktáza metyláza
Oblast " immigration control region „ u E. coli – 14 kbp ("immigration island„
- značné rozdíly u různých kmenů
Gen hsdS může být nahrazen genem hsdS z jiného RM systému stejné třídy, nebo geny
mohou vzájemně rekombinovat
Odlišný obsah GC – indicie přenosu HGT
%GC
VYUŽITÍ RM SYSTÉMŮ V EUKARYOTICKÝCH BUŇKÁCH
Transgenní linie myších buněk exprimující geny RM systémů
1. přenos a exprese genu M.PaeR7 (Pseudomonas aeruginosa) metyláza
CTCGAG
2. přenos a exprese genu R.PaeR7 - endonukleáza (restriktáza)
3. infekce buněk HSV1 adenoviry - očekávaná rezistence buněk vytvoření
organizmu rezistentního k virům
(nebo jen určitých tkání)
Další možnost:
studium vlivu metylace na genovou expresi
Další obranné mechanismy bakterií
(A) vrozená imunitní odpověď (B) adaptivní imunitní odpověď
(A)
1. Zabránění adsorbce fágů –
modifikace RBP (receptor binding
protein)
2. Blokování vstupu fágové DNA do
buňky
3. Působení RM systémů
4. Abortivní infekce
5. Blokování sestavování fágových
virionů
(B) CRISPR-Cas systém
Další obranné mechanismy bakterií
(A)
2. Superinfection exclusion (SIE) systems - Systémy zabraňující superinfekci
bakterií – působí na vstupující fágovou DNA.
Tyto systémy se skládají z membránově asociovaných proteinů kódovaných profágy
a chrání jejich hostitele před infekcí jinými blízko příbuznými fágy.
Např. Streptococcus thermophilus obsahuje fágy TP-J34, které produkují lipoprotein
asociovaný s membránou hostitele LtpTP-J34, který interaguje s tape measure
proteinem jiných fágů.
Čeleď Siphoviridae – tape measure protein usnadňuje průchod fágové DNA
tvorbou kanálu v membráně hostitele, LtpTP-J34 nejenže blokuje injekční proces
fágové DNA, ale také snižuje počet neinfekčních fágových částic uvnitř hostitele.
Další obranné mechanismy bakterií
(A)
4. Abortivní infekce – fágová infekce vede k předčasné řízené smrti bakterie, čímž
chrání sousední bakteriální populaci.
Abi systémy jsou často kódovány MGE, jako jsou plazmidy a profágy.
Tyto systémy působí v jakémkoli stádiu životního cyklu bakteriofága - zabraňují jeho
šíření.
Např. fág lambda - systém RexAB chrání lysogenizované buňky před infekcí dalšími
coliphagy prostřednictvím ztráty membránového potenciálu, což vede ke snížení
hladiny ATP a nedochází k adsorbci dalších fágů na povrch hostitele. 20 Abi (AbiA AbiZ)
- identifikováno u bakterie Lactococcus lactis.
5. Blokování sestavování fágových virionů
Phage packaging interference (Ppi) proteins - kódovány SaPI - hrají roli při blokování
malé podjednotky fágové terminázy, potřebné pro rozpoznávání fágové DNA, stejně
jako pro zahájení sbalování - umožňuje malé podjednotce SaPI terminázy interagovat s
fágem-kódovanou velkou podjednotku pro usnadnění štěpení SaPI DNA s sbalení do
virionu.
Další interferenční mechanismus zahrnuje přerušení transkripce pozdních genů fága –
sbalení DNA do virionu, sestavení virionu, lyze.
V. cholerae obsahují ostrov podobný PICI, který působí inhibičně na virulentní fágy.
BREX – nově objevený obranný mechanismus bakterií proti
fágové DNA (2015)
(A) Mírný fág (červeně) nebo lytický fág
(fialově) infikuje bakteriální buňku.
Temperovaný fág se začleňuje do hostitelského
chromozomu a lytický fág se replikuje, tvoří
potomstvo a lyzuje buňku.
(B) Bakterie s „bacteriophage exclusion“
(BREX) systémem je rezistentní k mnoha
mírným nebo lytickým fágům.
Různé typy systémů BREX jsou kódovány
konzervovanými operony (BREX typu 1 z
Bacillus cereus, dva operony: brxABC-pglX a
pak pglZ-brxL).
Konzervovaná část BREX systému - tři enzymy:
ATP-vázající se na P-smyčku proteinu (PglY /
BrxC, C), alkalickou fosfatázou (PglZ, Z) a
metyltransferázu (PglX, X), která specificky
metyluje TAGGAG.
BREX B. cereus inhibuje integraci mírných fágů
do hostitelského chromozomu, stejně jako
replikaci (a proliferaci) lytických fágů.
Antirestrikční mechanismy
Mechanismy, kterými plazmidy a fágy unikají restrikci
1. Neobvyklé modifikace DNA
2. Nízká frekvence cílových míst
3. Tvorba proteinů, které interferují s jednou nebo více aktivitami RM systému
4. DNA vstupující do buňky ve formě ssDNA (konjugativní plazmidy nebo některé
fágy), neuniká restrikci, ale stává se k nim citlivá po syntéze druhého vlákna.
• Fág MU – funkce MOM: konverze adeninu na A-(1acetamido)adenin,
který je necitlivý k EcoKI a EcoBI.
• Plazmidy: Ard (alleviation of restriction) - antirestrikční protein,
zmírnění restrikce
• Fág lambda: Ral (restriction alleviation) - antirestrikční protein zvýšení
modifikační aktivity enzymů typuAI na NM DNA
• Fágy T3 a T7: (proteiny Ocr = overcoming restriction) inaktivace
enzymů typu I (zábrana jejich vazby na DNA)
• Fág P1: Dar-proteiny (defense against restriction) ? - rozklad
SAM
Příklady antirestrikčních mechanismů
Příklady antirestrikčních mechanismů
Příklady antirestrikčních mechanismů
a) Eliminace restrikčních míst nebo jejich velká vzdálenost od sebe
b) Fág je modifikován metylázami hostitelské buňky, případně takové metylázy
vytváří sám
c) Fág při infekci koinjikuje do buňky proteiny, které se vážou na cílové rozpoznávací
sekvence RE a tím je chrání (maskují).
d) Fág vytváří protein, který imituje cílovou sekvenci, váže RE a tím ho inhibuje.
e) Fágový protein navozuje aktivitu metylázy a tím urychluje obranu před RE. Peptid
Stp fága T4 může inhibovat restrikci změnou struktury komplexu restriktáza-
metyláza.
Pasivní a aktivní strategie fágů pro únik před působením RM systémů
"Loss" of restriction sites.
Some phage have many fewer recognition sites for certain restriction endonucleases than you would predict by random
chance. For example, the phages T3 and T7 lack the 5-bp EcoRII recognition site CC(A or T)GG. This is thought to arise by
selection for phage with mutations that prevent cleavage by restriction endonucleases commonly encountered in their hosts
Modified bases.
Some phage have modified bases that prevent recognition by restriction endonucleases. For example, phages T2 and T4 have
hydroxylmethylcytosine instead of cytosine in their DNA.
Self-methylation.
Some phage encode a methylase that can modify their DNA so that it is not cleaved by certain restriction endonucleases. For
example, the E. coli phages T2, T4, and the Myxococcus phage Mx8 encode dAdenine methylases (dam). Certain plasmids also
encode methylases that may provide protection against restriction endonucleases
Activation of a host methylase.
Some phage encode a protein that stimulates the host's methylase to modify the phage DNA. For example, the Lambda Ral
("restriction alleviation") protein enhances methylation by the HsdM subunit of the EcoK and EcoB restriction systems]. Ral
seems to act by stimulating the expression of the host hsdS and hsdM genes
Degradation of host S-adensylmethionine.
Some host restriction systems only recognize modified DNA (e.g. the McrA and McrB systems in E. coli). Phage T3 encodes a Sadensylmethionine
hydrolase activity that degrades the substrate required for methylation by host enzymes, thus avoiding
modification of the phage DNA and subsequent cleavage by modification-dependent host endonucleases
Inhibition of host restriction endonucleases.
Many conjugal plasmids produce antirestriction proteins (called Ard) that specifically inhibit Type I restriction endonucleases.
The Ard proteins have a motif that is very similar to a motif found in the HsdS subunit, thus it is possible that the Ard proteins
prevent proper assembly of the restriction endonuclease complex by binding to the other Hsd subunits. Phage T3 produces a
protein called Ocr which inhibits host methylases, resulting in resistance to modification-dependent restriction systems
DNA repair systems.
Activity of certain phage genes may allow repair of the double-stranded breaks produced by restriction endonucleases. For
example, the lambda Gam and Red proteins may repair the cleaved DNA by recombination with another copy of the phage DNA
Lokalizace genu ocr na fágovém genomu
Bakteriální viry vyvinuly různé strategie, aby se vyhnuly RM systémům.
Některé viry kódují svou vlastní methyltransferázu, aby ochránily svůj genom od
hostitelských restrikčních enzymů.
Bakteriofág T7 kóduje Ocr protein, který blokuje aktivní místo několika restrikčních
enzymů napodobením fosfátového řetězce DNA.
Jiné bakteriální viry používají neobvyklé báze na svém genomu, aby se vyhnuli
restrikci.
Bakteriofágy SPO1, SP82 a 2C nahrazují tymin - 5-hydroxymetyluracilem, zatímco
fágy PBS1 a PBS2 thymin změní na uracil.
Glukozylace HMC zbytků DNA Tsudých
fágů je účinnou ochranou
před většinou RE – a navíc slouží
k identifikaci fágové DNA, takže
enzymy kódované fágy mohou
selektivně degradovat hostitelský
chromozom
Strategie fága T4 pro překonání RM systémů a reakce E. coli
Evoluce interakcí mezi T-sudými fágy a hostiteli
a) Fág infikující normálního
hostitele
b) Fág infikuje E. coli s RM
systémem, RE štěpí
c) Genom fága obsahuje HMC, RE
neštěpí
d) Některé kmeny E. coli mají RM
systém štěpící DNA s HMC
e) Fág glykozyluje HMC (na gluHMC)
a jeho DNA není štěpena
MDS (modif.depend. syst.)
f) Některé kmeny E. coli mají RM
systém (Gmr) štěpící glu-HMC,
ne však neglukozylovanou
g) Některé fágy (like-T4) mají gen
kódující IPI, který ruší působení
Gmr
h) Některé kmeny E. coli mají
modifikovaný Gmr (fúze GmrSGmrD),
který ruší působení IPI
i) Některé mutanty fága T4
překonávají GmrS-GmrD a
úspěšně infikují E. coli