Téma P02: Diagnostika streptokoků K nastudování: Streptococcus (z učebnic, internetu…) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace, Neutralizace Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 6 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Kataláza – úkol 2a Slanetz-Bartley úkol 2b Úkol 3 Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) 4b: STREPTOtest 16 (jen ústní strep.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Z časových důvodů dnes nebudete sami kmeny mikroskopovat, pouze si prohlédnete preparáty a/nebo obrázky preparátů, které studenti všeobecného lékařství v dopoledním praktiku zanechali v počítači. Úkol 2: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalázový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalázový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou kataláza pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Připomeňme si, že substrátem je v tomto testu peroxid vodíku, pozitivita se projeví bublinkami, negativita jejich absencí. Zapište do tabulky. b) Růst na Slanetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Roste však jen jeden. Tento kmen je enterokok, a není to tedy streptokok. Slanetz-Bartleyho agar obsahuje azid sodný, který neumožňuje růst jiných bakterií, než jsou enterokoky. Stafylokoky zase rostou na půdě s 10 % NaCl. Streptokoky nerostou ani na jedné z těchto půd. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 3: Kultivace na krevním agaru Krevní agar lze považovat za půdu obohacenou (o krvinky), je však zároveň i půdou diagnostickou: můžeme na něm pozorovat následující typy změn: úplná hemolýza – bakterie svou činností zcela rozloží erytrocyty ve svém okolí, krevní agar nabude barvy séra, je průhledný částečná hemolýza – bakterie svou činností rozloží erytrocyty jen částečně, krevní agar kolem kolonií je pouze poloprůsvitný a jeho barva je nažloutlá (bez zeleného nádechu) viridace (lat. viridis = zelený) – změna červeného krevního barviva na barvivo zelené, agar v okolí kolonie nabývá zelenavé barvy žádná změna – většina bakterií krevní agar nemění Na miskách s krevním agarem máte opět všechny kmeny. Ty, které jste vyloučili v úkolech 1 a 2, nemusíte popisovat, pro porovnání se však na ně podívejte. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky. Nyní zapište do tabulky „dílčí závěr“. Ke každému z kmenů K až S zapište „NENÍ STR“ (není streptokok) „HEMOL STR“ (částečná či úplná hemolýza) nebo „VIRID STR“ (streptokok s viridací) Úkol 4: Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledekbarevně zakreslete a zapište do tabulky (zde stačí ve formě + / –) Všimněte si: samotné kolonie jsou velmi malé, takže spíše uvidíte agar. Agar se streptokoky je šedozelený v důsledku jejich viridace. Nicméně s ohledem na určité rozdíly ve vzhledu kolonií není barva úplně stejná pro oba kmeny. Agar bez streptokoků (uvnitř zóny pozitivního kmene) má svoji původní červenou barvu. KMEN __ KMEN __ + = jakákoli zóna citlivosti (není nutno měřit) – = není zóna b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka Biochemické určení „ústního“ streptokoka připadá v úvahu jen výjimečně – většinou tehdy, když je kmen lokalizován mimo ústní dutinu, zejména v lokalitách normálně sterilních (např. v krevním řečisti nebo v ráně). V ostatních případech zcela vyhovuje označení „ústní streptokok“, nebo je nález dokonce součástí obecnějšího pojmu „běžná orofarangeální mikroflóra“ (nebo jen „běžná flóra“). Protože biochemickou identifikaci bakterií budeme probírat až v příštím praktiku, tento úkol vynecháme. Zájemci ovládající odečítání těchto testů najdou tento úkol na konci protokolu. Úkol 5: Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s betahemolýzou (části a, b); poslední část (c) pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je biochemický proužkový test (na přítomnost pyrrolidonylarylamidázy), provedením je podobný například oxidázovému testu. Také zde se reakční ploškou dotýkáme testovaných kolonií, a výsledek se projeví jako barevná změna. Na rozíl od oxidázového testu ale při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je výsledekStreptococcus agalactiae i všech non-A-non-B streptokoků.Výsledek testu pouze zapište do souhrnné tabulky na začátku protokolu. b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých tří objevitelů (Christie, Atkins, Munch-Petersen). Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-hemolyzin a kmenem S. agalactiae. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku: kmen ___ kmen ___ kmen ___ Úkol 6: Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Z časových důvodů proveďte pouze u kmene, který byl určen jako Streptococcuspneumoniae. Povšimněte si toho, že u streptokoků nelze použít k testování čistý MH agar, protože na něm nerostou. Je tedy potřeba použít některou půdu s krvinkami, kde ale vzniká problém s interpretací – okraj růstu kolonií může být zaměněn za okraj hemolýzy nebo viridace. Kmen(zapište písmeno kmene) Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Penicilin P* ≥ 18 mm < 18 mm Tetracyklin* TE ≥ 23 mm 20–22 mm < 20 mm Vankomycin VA ≥ 13 mm < 13 mm Nitrofurantoin F ≥ 15 mm < 15 mm *interpretuje se jako ampicilin Úkol 7: Úvod do „sérologie“ V lékařské mikrobiologii se více než v jiných oblastech používají testy založené na interakci mikrobiálního antigenu (povrchová součást mikroba, která stimuluje imunitní odpověď hostitele) a protilátky (bílkovinný produkt imunity hostitele, odezva na antigenní výzvu. Antigen a protilátka spolu tvoří imunokomplex, který můžeme různými způsoby detekovat (viz dále). Tyto reakce lze rozdělit Podle použití: 1. Určujeme mikrobiální antigen a k tomu používáme laboratorní protilátku 1.1 Antigen hledáme přímo ve vzorku (například ve vzorku mozkomíšního moku – více v P06) 1.2 Již jsme vykultivovali kmen a určujeme jeho antigen. Tento postup se nazývá antigenní analýza a používá se zpravidla k detailní diagnostice u mikrobů, které se neliší (nebo jen nepatrně) morfologickými, kultivačními, biochemickými aj. vlastnostmi, ale liší se právě typem antigenu 2. Provádímeprůkaz protilátek(tj. tzv. nepřímý průkaz): vůbec v těle pacienta nehledáme mikroba, ale hledáme v něm protilátky, které si proti mikrobovi vytvořil. Tento postup používáme nejčastěji v případech, kdy přímý průkaz není možný, je obtížný, nebo je potřeba kombinovat přímou metodu (např. PCR) ještě s jednou další metodou. V dnešním praktiku si budeme demonstrovat antigenní analýzu a průkaz protilátek, i když poněkud specifický. Podle typu použité reakce Precipitace – vizuálně detekujeme komplex vzniklý vazbou molekuly protilátky na molekulu antigenu Aglutinace – od předchozí se liší tím, že místo molekuly antigenu máme k dispozici částici (korpuskuli) – buďto je to celý mikrob (antigen je na jeho povrchu), nebo je použit tzv. nosič, tedy cizí korpuskule, na kterou je antigen navázán. Může jít např. o latexovou částici (latexová aglutinace) Neutralizace–používá se v případech, kdy antigen má zároveň toxické účinky, které protilátka přímo neutralizuje, nebo v případě, že jde o virový antigen a protilátka je schopna neutralizovat aktivitu celého viru Komplementfixace, reakce se značenými složkami(např. ELISA), imunochromatografické a jiné testy – budou probrány později V dnešním praktiku si ukážeme příklad aglutinace a příklad neutralizace. a) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněte si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, azapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). A B C D F G b) Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Jak bylo napsáno výše, průkaz protilátek zpravidla provádíme v případě, že chceme ověřit proběhlou protilátkovou odpověď a tím zjistit, že se tělo s mikrobem setkalo. V případě ASLO jde ale o trochu jiný případ – nejde o přítomnost protilátek (ta je po prodělané infekci normální a tu předpokládáme), ale o jejich zvýšené množství protilátek. To v daném případě indikuje autoimunitní reakci (tj. protilátky se „zvrhly“ a chybně reagují se strukturami vlastního těla). Princip:Neutralizační reakce: Protilátky brání hemolyzinu (streptolyzin O – antigen) hemolyzovat králičí erytrocyty. Hladina ASLO se zvyšuje po nákazách vyvolaných hemolytickými streptokoky skupiny A (méně často i jiných). Riziko pozdních následků streptokokových nákaz se projeví zvýšením ASLO nad 200 m.j. (mezinárodních jednotek). Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a několik sér pacientů. Určete hodnoty ASLO (hodnota ASLO odpovídá poslednímu ještě pozitivnímu důlku; pozitivita = zábrana hemolýzy, negativita = hemolýza) a interpretujte z hlediska rizika pozdních následků streptokokové infekce. Nepovinný úkol 4b: Biochemické určení „ústního“ streptokoka Pro urychlení a standardizaci identifikace bakterií se používají komerčně vyráběné identifikační soupravy. Bakterie jsou určovány do druhu na základě biochemických vlastností. V současné době existuje na trhu celá řada diagnostických souprav od nejrůznějších výrobců. V našich podmínkách jsou nejběžnější testy od firmy Erba Lachema, konkrétně si v tomto úkolu představíme STREPTOtest 16. Provedení testu z časových důvodů nebudeme provádět: Připravíme bakteriální suspenzi tak, že rozmícháme několik kolonií ve zkumavce s fyziologickým roztokem. Naočkujeme 0,1 ml suspenze do všech jamek. Po inokulaci se k některým jamkám kápne parafinový olej, destička se vloží do polyethylenového sáčku a sáček se inkubuje v termostatu, u většiny běžných testů při 37 °C 24 hodin. Po inkubaci se často ještě do některých důlků přikápne určité činidlo. Vyhodnocení testu. Zhodnoťte biochemickou aktivitu kmene „ústního“ streptokoka a určete jej na úroveň druhu. Výsledky jednotlivých reakcí zapište do protokolu. Jako první odečtěte výsledek ve zkumavce (VPT), pak reakce prvního a nakonec i druhého řádku ve dvojstripu. Kromě názvu mikroba zapište i procento pravděpodobnosti pro daný taxon a index typičnosti zkoumaného kmene. U nejednoznačných výsledků zapište všechny možné výsledky, případně se s pomocí asistenta pokuste o zhodnocení. U kmene, který jste v předchozím úkolu určili jako „ústního“ streptokoka, druhově vyhodnoťte biochemický mikrotest (STREPTOtest 16). Zkum. První řádek s osmi jamkami Druhý řádek s osmi jamkami VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace Streptococcus ___________ % pravděpod. T index