Téma P03: Dg. některých dalších grampozitivních baktérií (enterokoků, listerií, korynebakterií, bacilů). Přehled přímého průkazu II K nastudování: Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (ze skript, učebnic, internetu). Dále: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace Úkol 0: Demonstrace některých testů biochemické identifikace v klinické mikrobiologii Prohlédněte si a zakreslete příklady identifikačních testů, které se sice nepoužívají k diagnostice enterokoků, ale zato se s nimi setkáme v diagnostice jiných klinicky významných bakterií. Testy jsou pro ukázku připraveny na bočním stole. Zakreslete si ukázky možných výsledků testů. Testy, které se používají u enterokoků, najdete v dalších úkolech. Úkol 0a: Příklad testu s diagnostickým proužkem: oxidázový test (důkaz produkce cytochromoxidázy) Filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný příslušným reagens přitiskněte na kolonie testovaného kmene. Proužek položte do víčka Petriho misky otisknutými koloniemi nahoru. Hodnocení reakce: Pozitivní do 30 s intenzivní modré zbarvení Opožděně pozitivní do 2 min intenzivní modré zbarvení Negativní beze změny nebo modrání až po uplynutí 2 min Zakreslete výsledky a interpretujte. Kmen: Kmen: Oxidáza Úkol 0b: Důkaz produkce β-galaktosidázy – ONPG-test Filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný vhodným reagens (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid) se vloží do suspenze připravené z kultury testovaného kmene. Inkubujeme v termostatu a výsledek reakce odečítáme po 4 hodinách. Reakce je pozitivní, pokud dojde k zežloutnutí suspenze. Zapište, které z testovaných kmenů produkují β-galaktosidázu. Kmen ONPG ßKmen Výsledek ßVýsledek Úkol 0c: Tvorba sirovodíku, štěpení sacharidů a produkce plynů v půdě Hajnově Tvorbu sirovodíku prokazujeme spolu se zkvašováním cukrů a produkcí CO[2] v kombinované půdě podle Hajny. Substrátem pro tvorbu H[2]S je thiosulfát sodný a indikátorem citrát železitoamonný. Sirovodík vytvořený redukcí thiosulfátu reaguje s ionty železa za vzniku sulfidu železitého. Produkce H[2]S se projeví zčernáním spodní části půdy. S. Typhi dělá jen uzoučký černý proužek na rozhraní šikmé části a plného sloupce. Podle pokynů vyučujícího zhodnoťte štěpení sacharidů a produkci plynů u testovaných kmenů. Výsledky zakreslete a zapište. Úkol 0d: Průkaz pohyblivosti, tvorby indolu a štěpení močoviny (MIU) K průkazu těchto vlastností se používá kombinovaná diagnostická půda MIU (motility, indol, urea). Zkoumané kmeny byly do půdy očkovány vpichem. Pohyblivost bakterie se prozradí rozrůstáním z čáry vpichu. K průkazu indolu se přikapávají 2 kapky Kovácsova reagens – v pozitivním případě se na rozhraní půdy a činidla vytvoří červený prstenec. Pokud bakterie štěpí ureu, půda se alkalizuje a barví se do růžova. K úkolu 0c: K úkolu 0d: Hajna MIU Tabulka pro hlavní výsledky úkolů číslo 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Úkol 2 Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné Katalázový test Úkol 3a Slanetz-Bartley Úkol 3b Žluč-eskulinová půda Úkol 3c Arabinózový test Úkol 4a MALDI-TOF Úkol 4b Růst v ledničce Úkol 5a DEFINITIVNÍ ZÁVĚR* *U G+ tyčinek napište pouze rodové jméno. Druhové určení by vyžadovalo přesnější testy, které nemohou být v praktiku provedeny. Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Stejně jako v minulém praktiku prohlédněte preparáty a/nebo jejich obrázky v počítači. Zapište do tabulky. Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků a tyčinek Popište kolonie jako obvykle. V popisu vynechejte gramnegativní bakterie, ale prohlédněte si je pro srovnání. U kmenů, které jste identifikovali jako G+ tyčinky, se pokuste uhádnout, o jakou bakterii by mohlo jít, podle následující charakteristiky: Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie, „rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou hemolýzou, jindy zcela bez ní. Mikroskopicky velmi robustní tyčinky, někdy s nálezem centrálně až subterminálně uložených endospór, jež mohou, ale nemusí bubřit tyčinku. Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s hemolýzou, mikroskopicky drobnější než Bacillus, neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých řetízcích. Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o hodně menší, většinou bez hemolýzy; v mikroskopii spíše menší než předchozí, ale kyjovité a uspořádané do palisád. Úkol 3: Některé běžné biochemické a kultivační testy a) Katalázový test Proveďte katalázový test pro všechny kmeny, které jsou G+. Poznámka: Testování katalázy u G+ tyčinek se může zdát zbytečné, protože Listeria, Corynebacterium i Bacillus jsou v testu pozitivní. Ovšem některé jiné koryneformní tyčinky (např. Arcanobacterium) jsou negativní, a proto má kataláza v diagnostice G+ tyčineksvé místo. b) Růst na Slanetz-Bartleyho půdě Na misce máte naočkované tytéž kmeny jako v úkolu 1. Pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu. Na této půdě rostou pouze enterokoky. Výsledek zapište do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinové půdě Na rozdíl od předchozí umožňuje žluč-eskulinová půda nejen růst rodu Enterococcus (to umožňuje rozlišit jej mezi G+ koky), ale také Listeria (diagnostická mezi G+ tyčinkami). V pozitivním případě vidíte černé kolonie. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus faecalis). b) MALDI-TOF pro přesnější diagnostiku enterokoků a koryneformních tyčinek Ačkoli arabinózový test lze považovat za dostatečný pro běžné případy, v některých situacích potřebujeme diagnostiku založenou na více znacích a schopnost detekovat více než dva druhy enterokoků. Podobně termín "koryneformní tyčinky" obvykle představuje dostatečnou úroveň určení korynebakterií a příbuzných bakterií (zejména pokud jsou izolovány z kůže), ale ne pro důležité izoláty (například z krevního oběhu). Jak pro enterokoky, tak i pro koryneformní tyče je možné použít některé biochemické testy. Test na Enterococcus je vyráběn i v Česku ("EN-COCCUStest firmy Erba Lachema"), ale neexistuje žádný test Lachema pro koryneformní tyčinky, takže by bylo zapotřebí použít jiné testy (například API® Coryne od firmy Bio-Mérieux). V poslední době je také možné oba nahradit metodou MALDI-TOF. Odečtěte výsledky MALDI-TOF u tří z vašich kmenů (dva enterokoky a jedna koryneformní tyčinka). Napište výsledky do tabulky a odpovězte na následující otázku: Do jaké úrovně jsou kmeny určeny pomocí MALDI-TOF? Podtrhněte, co platí: První enterokok, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určen na úroveň rodu – úroveň druhu Druhý enterokok, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určen na úroveň rodu – úroveň druhu Koryneformní tyčinka, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určena na úroveň rodu – úroveň druhu Úkol 5: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Úkol 6a: Testy citlivosti enterokoků a grampozitivních tyčinek na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Enterococcus faecalis a Listeria sp. Test na Enterococcus faecium chybí, protože tato bakterie je často izolována ze stolice, kde testy citlivosti nejsou nutné. Nicméně nacházíme i kmeny z moče – viz úkol 6b. Nenaleznete ani test na Corynebacterium sp., mlčky předpokládáme, že náš kmen je původem z kůže a můžeme jej tedy považovat na součást normální mikroflóry. Také test na Bacillus sp. byste hledali marně – ve většině případů jsou bacily považovány za kontaminaci z prostředí a tudíž nebývají testovány. Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Kmen Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Ampicilin AMP ≥ 10 mm 8–9 mm < 8 mm Nitrofurantoin F ≥ 15 mm < 15 mm Vankomycin VA ≥ 12 mm < 12 mm Tetracyklin* TE ≥ 19 mm 15–18 mm < 15 mm Q. + D.** QD ≥ 22 mm 20–22 mm < 20 mm Gentamicin CN*** ≥ 8 mm < 8 mm *výsledek testu platí i pro doxycyklin **quinupristin + dalfopristin, kombinace dvou streptograminových antibiotik ***k léčbě enterokokových infekcí se hodí pouze v kombinaci s betalaktamy Úkol 6b: Demonstrace testu citlivosti u kmene Enterococcus faecium Na bočním stole můžete vidět test na E. faecium. Napište název antibiotika, které je lékem volby u infekcí způsobených E. faecalis, avšak z důvodu primární rezistence jej nelze použít uE. faecium:_________________ Úkol 6c: Demonstracekmene VRE Na bočním stole nebo v prezentaci máte také kmen VRE. S použitím své paměti a/nebo asistentky napište, co znamená zkratka VRE: ____________________________________________ Úkol 7: Demonstrace Elekova testu Principem Elekova testu je precipitace mezi toxinem z toxického kmene a antitoxinem z papírového proužku, napuštěného antisérem. Jak toxin, tak i antitoxin difundují agarem. Prohlédněte si obrázek výsledku Elekova testu k průkazu toxicity kmene Corynebacterium diphtheriae vypěstovaného z krku pacienta s pseudomembranosní (pablánovou) angínou. Zakreslete (včetně popisu).