Téma P06: Diagnostika gramnegativních bakterií jiných než těch z P04 Ke studiu:Haemophilus, Pasteurella, Pseudomonas, G– nefermentující tyčinky, Neisseria, Moraxella, Legionella, Bordetella, Brucella, Francisella; mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S T U V W Gramovo barvení – Úkol 1 Kul-tiva-ce Úkol 2 Růst na KA (A/N/jen+#) Růstové charakteri-stiky na KA (ČA*) Endova p. (–/L-/L+) MH agar (barva) Úkol 3a Satelitový fenomén (+/–) Úkol 3b Růstové f. (X, V, X + V) Úkol 3c Pouzderný typ: Haemophilus 3d Test citlivosti Penic. Vanko. Fermentace gluk. Úkol 4 (Hajna) Oxidázový test Úkol 5a NEFERMtest 24, NEISSERIAtest a INAC (Úkoly 5b+c) KONEČNÝ ZÁVĚR *Pro bakterie nerostoucí na krevním agaru (KA) použijte čokoládový agar (ČA) #Napište „jen +“, pokud kmen roste pouze na obohaceném krevním agaru (označen jako KA+) Úkol 1: Mikroskopie suspektních kmenů Prohlédněte si preparáty a/nebo jejich obrázky v počítači. Zapište výsledky do tabulky. Úkol 2: Kultivace na agarových půdách Nejdříve napište, které bakterie rostou na krevním agaru a které ne. Pak, používajíce standardních procedur, popište kolonie všech kmenů na krevním agaru. Pouze ty, které na KA nerostou, popište na čokoládovém agaru nebo na „KA+“. Poté popište růst na Endově půdě: „–“ pokud nerostou, „L–“ pokud rostou, ale nefermentují laktózu „L+“ pokud laktózu fermentují. Dejte pozor: některé kmeny mohou předstírat pozitivitu laktózového testu, ačkoli jsou laktóza negativní: produkují pigmenty, takže kolonie jsou tmavé, avšak okolí je tmavé. V případě pochyb porovnejte s Hajnovou půdou (Úkol 4): úplná žlutá barva = fermentuje glukózu i laktózu, úplná červená barva = nefermentuje glukózu ani laktózu, napůl červená a napůl žlutá = fermentuje glukózu, ale ne laktózu. Co se týče MH agaru: prověřte pouze jeden kmen, a to pouze na případnou přítomnost pigmentu. Použijte misku z Úkolu 1 nebo z Úkolu 6b (není žádná speciální miska s MH agarem pro Úkol 2). Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae a jejich přesnější určení a) Satelitový fenomén Hemofily jsou typické takzvaným satelitovým fenoménem. To znamená, že samy o sobě nerostou na krevním agaru, ale jsou tam schopny růst v přítomnosti kmene, který pro ně z krvinek uvolní růstové faktory. Pro tento účel se zpravidla používá kmen Staphylococcus aureus. Zakreslete satelitový fenomén (testován u dvou kmenů) a spojte popisky s příslušnými jevy na obrázku. Výsledek zapište do hlavní tabulky na první straně. Staphylococcus aureus Kolonie hemofilů b) Identifikace hemofilů podle potřeby růstových faktorů Určete dané kmeny podle potřeby růstových faktorů. Zakreslete výsledek faktorového testu pro oba kmeny. c) Detekce kapsulárních antigenů H. influenzae Popište výsledek aglutinace kapsulárních antigenů H. influenzae pomocí latexové aglutinace. d) Detekce P. multocida pomocí typického vzorce citlivosti Velmi typická pro P. multocida je její citlivost k penicilinu, velmi vzácná u G– tyčinek. Na druhou stranu je rezistentní k mnohem silnějšímu (ovšem pouze pro G+ bakterie vhodnému) antibiotiku vankomycinu. Zapište. e) Potvrzení určení Pasteurella multocida pomocí MALDI-TOF Podívejte se na výsledky MALDI-TOF u našeho kmene pasteurely. Rozhodněte: Určení Pasteurella multocida z předchozích testů je – není (nehodící se škrtněte) potvrzeno MALDI-TOF. Úkol 4: Hajnova půda Prohlédněte si kultivační výsledky čtyř kmenů na Hajnově půdě. Kmen, který fermentuje glukózu (žlutá barva) označte jako „+“, kmeny nefermentující (červená) jako „–“. Ostatní výsledky (laktóza, sirovodík) nejsou v tomto praktiku důležité, ale výsledek fermentace laktózy (úplná žlutá vs. červenožlutá barva) můžete případně použít pro porovnání s Úkolem 2. Úkol 5: Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a G– koků a) Oxidázový test Demonstrace oxidázového testu u tří G– nefermentujících bakterií a u G– koků. Zapište výsledky do tabulky. Nefermentující tyčinky:Pseudomonas je vždy pozitivní, Burkholderia většinou, ale ne nutně pozitivní; na druhou stranu, Stenotrophomonas bývá zpravidla negativní. Oxidáza pozitivní bakterie s typickou vůní a pigmentem (zpravidla zeleným, řidčeji modrým či zrzavým) je prakticky s jistotou Pseudomonas aeruginosa. U této bakterie tedy není nutno provádět další biochemické testování, popsané v úkolu 5a. U ostatních dvou kmenů je toto biochemické testování nezbytné. G– koky: Neisserie i moraxely jsou oxidáza pozitivní, i když u moraxel může být reakce opožděná. b) Podrobné biochemické testování Vyhodnoťte předložené výsledky NEFERMtestu 24, který byl připraven DVA dny předem (rozdíl oproti jiným biochemickým testům) při 30 °C (další rozdíl; jiné testy vyžadují 37 °C). Také způsob odečítání testu je jiný, protože zde máme tři řady. Testy v horní řadě mají vždy hodnotu „1“, v prostřední „2“ a v dolní „4“. První číslice je z oxidázového testu: „0“ pro negativní, „1“ pro pozitivní oxidázu. Z reakcí v důlcích B a A se číslice nevypočítávají. Máme tedy sedmimístný kód – první pozice je „0“ (oxidáza –) nebo „1“ (oxidáza +) a dalších šest může nabývat hodnot 0 až 7 dle výsledku testů ve sloupcích H až C. Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód U kmenů určených jako G– koky odečtěte biochemický mikrotest (NEISSERIAtest fy Lachema) naočkovaný předchozí den. Na rozdíl od předchozího má jen jeden řádek. První jamka obsahuje negativní kontrolu, takže vlastní test začíná až od DRUHÉ jamky! Zakápnutí Lugolovým roztokem již bylo provedeno, nemusíte je provádět sami. Povšimněte si nízké biochemické aktivity některých neisserií. Porovnejte výsledek s růstovými vlastnostmi (kmen určený jako gonokok by měl růst pouze na čokoládovém agaru, meningokok pouze na čokoládovém a bohatém krevním agaru). Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Úkol 6: Testy citlivosti patogenů na antibiotika Z časových důvodů odečtěte citlivost jen u pseudomonády, i když by se normálně provádělo testování i u členů čeledi Pasteurellaceae a u patogenních G– koků. Test pro pseudomonádu (jako pseudomonáda byl určen kmen ___) Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Piperacilin+tazobaktam (TZP) C ≥ 18 / R < 18 ciprofloxacin (CIP) C ≥ 26 / R < 26 gentamicin (CN) C ≥ 15 / R < 15 ceftazidim (CAZ) C ≥ 17 / R < 17 ofloxacin (OFL) C ≥ 16 / R < 13 kolistin (CT) C ≥ 11 / R < 11 Poznámka: Tazobaktam působí jako inhibitor betalaktamázy, zároveň ale má i svoji vlastní antimikrobiální účinnost. Úkol 7: Přímý průkaz antigenů původců meningitid v mozkomíšním moku (demonstrace diagnostické soupravy a videoklip) Meningokoková meningitida je závažná choroba. Nelze zde čekat na kultivaci, je nutno využít rychlých diagnostických metod. Vedle mikroskopie se zde využívá především latexové aglutinace. a) Demonstrace soupravy k latexové aglutinaci Prohlédněte si soupravu a zapište názvy mikrobů, které mohou být touto metodou diagnostikovány. b) Videoklip Prohlédněte si videoklip. V této ukázce se jako patogen projevil __________________________________ Úkol 8: Diagnostika bordetel, brucel, legionel a francisela) a) Diagnostika bordetel Diagnostika pertuse je v současnosti založena na serologii (aglutinace a ELISA), která vždy vyžaduje dva vzorky séra. Jinou diagnostickou metodou je PCR. Nicméně důležitou a klasickou metodou stále zůstává kultivace. Existuje speciální médium pro druh Bordetella pertussis a speciální způsob očkování na tuto půdu. Na rozdíl od mnoha jiných bakterií je Bordetella rezistentní k penicilinu. Proto začínáme kápnutím kapky penicilinového roztoku doprostřed misky s agarem. Výtěr je smíchán s kapkou a očkován ve směru spirály. Poté jsou očkovány radiální paprsky kličkou. Napište název půdy a zakreslete postup očkování podle obrázku. Název půdy: ____________________ b) Demonstrace kultivační půdy na legionely Prohlédněte si kultivační půdu na legionely. Zapište o ní několik údajů. Zkratka Co znamenají jednotlivá písmena ve zkratce Barva půdy c) Průkaz protilátek proti tularémii V praktiku P02 a P05 jste viděli aglutinaci použitou k antigenní analýze. Aglutinace se ale dá použít také k průkazu protilátek. Výsledek ale vypadá jinak. Sérum se ředí geometrickou řadou s koeficientem 2. Na bočním stole je vlhká komůrka s výsledky nepřímého průkazu francisel aglutinací. Jamky s pozitivní reakcí vykazují příslušnost aglutinátu (větší terčík nepravidelného tvaru), důlky s negativní reakcí ukazují sedimentaci bakterií (menší, výrazně bílé kulaté kolečko). První důlek je „technický“, dále za čárou následují titry 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40 atd. Pokuste se o závěrečnou interpretaci, víte-li, že jakýkoli titr se považuje za „suspektní“, samozřejmě jen pokud nejde o pozitivní kontrolu. Doplňte do následující tabulky: d) Diagnostika protilátek proti brucelóze Diagnostika brucelózy (Bangova choroba – způsobena B. abortus) byla provedena nepřímým průkazem – metodou ELISA ve třídách IgG i IgM. Absorbance byla změřena spektrofotometrem a výsledky byly expertním systémem přímo vyhodnoceny jako „pozitivní“, „hraniční“ či „negativní“. Výsledky najdete na stole. Pokuste se o závěrečnou interpretaci, pokud víte, že třída IgM svědčí pro aktivní infekci, samotný nález IgG pro dříve prodělanou. Více se o serologických reakcích a jejich interpretaci dozvíte ve zvláštním praktickém cvičení. Pacient Výsledek IgM Výsledek IgG Konečný závěr Alice Bob Claudia David Poznámka: Brucelóza je vzácnou nemocí, pročež řada laboratoří včetně té naší diagnostiku neprovádí. Z tohoto důvodu pracovní listy použité pro tento úkol nejsou skutečné, ale jsou to upravené pracovní listy z jiné serologické reakce. Nicméně skutečné pracovní listy pro diagnostiku brucel by vypadaly stejně či velmi podobně.