P03
Základy biochemické
identifikace bakterií
Diagnostika některých
dalších grampozitivních
bakterií
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
● biochemické identifikační metody substrátové
– metody rychlé, metody s kultivací
● nesubstrátové identifikační metody
● rod Enterococcus
● G+ tyčky
● diagnostika enterokoků a G+ tyček
● úkoly
2/60
Přehled identifikačních metod
● přímé metody (mikrob, jeho část, produkty)
– mikroskopie (průkaz ve vzorku i identifikace)
– kultivace (průkaz + identifikace)
– biochemická identifikace (jen identifikace)
– průkaz antigenu (průkaz + identifikace)
– průkaz NK (průkaz ve vzorku)
– pokus na zvířeti (průkaz ve vzorku)
● nepřímé metody (průkaz protilátek)
3/60
Biochemická identifikace
● rozdíly v metabolismu mezi bakteriemi
● bakterie mění substrát (cukry, AMK, apod.) v produkt(y)
● přednostně se metabolizují cukry před AMK
● ideálně se produkt a substrát liší skupenstvím nebo barvou
● pokud se neliší, užijeme vhodný indikátor
● sledujeme více než jeden znak (atypické kmeny,
možnost rozlišit více rodů a druhů)
● % pravděpodobnosti
● index typičnosti (shoda s „ideálním“ kmenem:
Tin = 1,00)
4/60
% pravděpodobnosti, Tin
● 99 %, Tin = 0,95
ideální stav
● 99 %, Tin = 0,63
atypický kmen nebo chyba diagnostiky
● 49,5 %, Tin = 1,00
test je typický pro dva taxony, musíme dále rozlišit
pomocí jiného testu
5/60
Endova půda
● na Endově půdě rostou pouze některé G- bakterie
(Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, GNFB)
● laktóza pozitivní (červené,
včetně okolí, jinak může jít
pouze o pigment!)
a negativní (bledé)
● Escherichia coli (růžové, červené
zbarvení, až kovový vzhled)
● Enterobacter/Klebsiella
(velké mukoidní červené kolonie)
● Proteus, Salmonella, Shigella
(bezbarvé až jemně růžové)
● Pseudomonas (nepravidelné, bezbarvé) 6/60
Endova půda (2)
● kultivace + identifikace
● v průběhu metabolismu laktózy vznikají aldehydy
● Schiffovo činidlo (fuchsin + Na2SO3)
7/60
Rychlé biochemické testy
● katalázový test
– kataláza – antioxidační enzym, chrání před
oxidačním stresem
– do substrátu (H2O2) rozmícháme bakterie
– POZ = viditelné bublinky
8/60
Testy s diagnostickými proužky
● Oxidáza – cytochromoxidázový test
– využívání cytochrom c oxidázy pro produkci energie
– OXI+ (bakterie využívá cytochrom c oxidázu, a tedy
O2 jako terminální akceptor elektronů pro produkci
energie); P. aeruginosa,
V. cholerae
– OXI- (bakterie využívá
pro produkci energie jiné
cytochromy, nebo O2 pro
produkci energie
nevyužívá vůbec);
většina rodů čeledi
Enterobacteriaceae
9/60
Testy s diagnostickými proužky (2)
● PYR test
– enzym PYRáza (pyrrolidonyl arylamidáza)
– odlišení S. pyogenes od ostatních β-hemolytických
streptokoků
● INAC test (Indoxyl-acetátový test)
– odlišení M. catarrhalis od N. meningitidis
a N. gonorrhoeae
● stripy pro detekci běžných β-laktamáz
10/60
Jednoduché zkumavkové testy
● přednostně se metabolizují cukry před AMK:
– cukry → org. kyseliny → pH klesá
– AMK → deaminace → vznik amoniaku → pH roste
– metabolizování komplexního média:
● pH nejdříve klesá (dokud jsou k dispozici cukry) →
pH opět roste (metabolizovaní AMK)
● acidobazické indikátory:
– detekce změn pH v průběhu růstu mikrobů
– detekce utilizace konkrétních substrátů (např.
cukrů nebo AMK
11/60
Jednoduché zkumavkové testy (2)
● acidobazické indikátory:
– fenolová červeň
● běžně používaná pro
buněčné kultury a
biochemické testy
– bromthymolová modř
● sledování fotosyntetické
aktivity a biochemické testy
12/60
Jednoduché zkumavkové testy (3)
● substrát je rozpuštěn v tekutině, přimícháme
testovaný kmen → změna zbarvení v celém objemu, nebo
jako prstenec u hladiny
– arabinózový test pro rozlišení E. faecalis a E. faecium
POZ = žlutá (E. faecium)
NEG = zelená (E. faecalis)
● kmen je rozmíchán v tekutině, přidáme proužek
napuštěný substrátem
– VPT test pro detekci tvorby acetoinu (POZ = červená)
– ONPG test pro detekci β-galaktosidázy (nezbytná pro
utilizaci laktózy); rozlišení rodů Citrobacter (POZ =
žlutá) a Salmonella (NEG = bezbarvá)
● o-nitrofenol (žlutý) + galaktóza (bezbarvá)
13/60
Jednoduché zkumavkové testy (4)
● agar obsahující substrát
– Citrát dle Simmonse pro detekci růstu bakterií na
citrátu jako jediném zdroji uhlíku;
rozlišení Enterobacter aerogenes
(POZ = modrá) a
E. coli (NEG = tmavě zelená)
14/60
Složité zkumavkové testy
● test (půda) MIU (Motility, Indol, Urea)
– pohyb – pohyblivé bakterie se rostou do okolí
vpichu, nepohyblivé podél vpichu
– tvorba indolu – po přidání Kovácsova činidla se
vytvoří červený prstenec
– štěpení urey – půda se zbarví fialově
15/60
Složité zkumavkové testy (2)
● Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
– štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
● v případě pozitivity H2S
v podstatě nelze posoudit
fermentaci glukózy!
– tvorba plynu (POZ = potrhaná
půda, bublinky, půda vysunutá
nahoru)
– očkování vpichem
a tzv. hádkem
16/60
Příklad vyhodnocení Hajna+MIU
Test Hajna MIU
Reakce Glc Lac H2
S Mot Ind Ure
Pseudomonas
aeruginosa
- - - - - +
Escherichia coli + + - + + -
Proteus
mirabilis
+ - + + - +
Salmonella
enterica
+ - + +/- - -
Citrobacter
freundi
+ +/- (+) + - -
17/60
Testy v plastových panelech
● miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů
● počty testů v sadách se liší
● destičky s lyofilizovanými substráty
● přidání suspenze bakterií ve fyz. roztoku nebo
v dodaném suspenzním médiu
● zbytek bakteriální suspenze se využije jako zkumavkový
test (VPT, ONPG)
● u nás nejběžnější testy od firmy Erba Lachema
(např. STAPHYtest 16, STREPTOtest 16, ENTEROtest 16,
NEFERMtest 24, apod.)
18/60
Testy v plastových panelech (2)
● NEFERMtest 24 (Erba Lachema)
– jeden test tvoří tři řádky
po osmi jamkách
● API 20 E (bioMérieux)
– princip stejný, provedení se
mírně liší
19/60
Vyhodnocení destičkových testů
● oktalové kódy podle poz. a neg. výsledků
● trojici výsledků se přiřadí číslice od nuly po sedmičku
(dvojice výsledků pak číslice nula až tři)
● kód vyhledáme v kódové knize nebo v příslušném
softwaru
20/60
Další identifikační testy
● zkoumání další enzymové výbavy či faktorů virulence
– schopnost koagulovat králičí plazmu
– hyaluronidázový test
– diagnostické použití ATB (optochin, bacitracin)
– chromogenní půdy
● nové identifikační metody
– MALDI-TOF (ionizace laserem za přítomnosti matrice,
spojení s detektorem doby letu)
21/60
Chromogenní půdy
● selektivně diagnostické půdy
● chromogen = molekula, která využita jako substrát
mikrobem mění barvu → různé barvy kolonií podle
utilizovaného chromogenu
● chromogen = substrát + chromofor
● podobnost s ONPG testem
(ONPG je bezbarvý,
o-nitrofenol žlutý)
● URIselect, půdy pro
kandidy, MRSA, listerie atd.
22/60
MALDI-TOF
● rozdělení nabitých částic podle jejich
molekulových hmotností v elektrickém/magnetickém
poli
● díky matrici lze analyzovat i velké biomolekuly (při
přímé ionizaci vzorku laserem dochází ke štěpení molekul
nežádoucím způsobem)
● směs vzorku a matrice je ionizována laserem → ionty
analyzované látky jsou urychleny silným elektrickým
polem → vstupují do trubice detektoru → měření doby
letu částice → výpočet poměru molekulové hmotnosti a
náboje částice
● hmotnostní spektrum se poté porovnává se
známými profily uloženými v knihovně
23/60
MALDI-TOF (2)
● Matrix-assisted laser desorption/ionization –
Time of flight
24/60
MALDI-TOF (3)
25/60
MALDI-TOF (4)
● příklady spekter
26/60
Úkol 0a: Oxidázový test
● filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný
příslušným reagens přitiskněte na kolonie
testovaného kmene
● proužek položte do víčka Petriho misky otisknutými
koloniemi nahoru
● POZ = do 30 s intenzivní
modré zbarvení
● OPOŽDĚNĚ POZ = do 2 min
intenzivní modré zbarvení
● NEG = beze změny nebo
modrání až po uplynutí 2 min
27/60
Úkol 0b: produkce β-galaktosidázy
ONPG-test
● filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný
vhodným reagens (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid)
se vloží do suspenze připravené z kultury
testovaného kmene
● β-galaktosidáza štěpí ONPG na o-nitrofenol (žlutý) a
galaktózu (bezbarvá)
● inkubace v termostatu,
výsledek reakce odečítáme
po 4 hodinách
● POZ = zežloutnutí suspenze
● NEG = beze změny
28/60
Úkol 0c: Hajnova půda
● Hajnova půda
– štěpení laktózy (nahoře)
(A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (dole)
(C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S
(POZ = zčernání půdy)
● v případě pozitivity H2S
v podstatě nelze posoudit
fermentaci glukózy!
– tvorba plynu
(POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá
nahoru)
29/60
Úkol 0d: MIU
● pohyb – pohyblivé bakterie se rostou do okolí vpichu,
nepohyblivé podél vpichu
● tvorba indolu – POZ = červený prstenec
● štěpení urey – POZ = půda se zbarví fialově
30/60
Úkol 0c+d: Vyhodnocení Hajna+MIU
Test Hajna MIU
Reakce Glc Lac H2
S Mot Ind Ure
Pseudomonas
aeruginosa
- - - - - +
Escherichia coli + + - + + -
Proteus
mirabilis
+ - + + - +
Salmonella
enterica
+ - + +/- - -
Citrobacter
freundi
+ +/- (+) + - -
31/60
Rod Enterococcus
● G+ koky, ve dvojicích nebo krátkých řetízcích
● fakultativně anaerobní, KAT-, OXI●
vysoce odolné: až 6,5 % NaCl, 40 % žluči, azid
sodný (půda Slanetz-Bartley), pH 4,8 až 11,
půlhodinové zahřátí na 60 °C, primární rezistence na
cefalosporiny
● součástí normální mikroflóry střeva
● původci močových infekcí, nozokomiální kmeny jsou
často rezistentní (bakteriémie, katetrové sepse,
meningitidy, endokarditidy, inf. žlučových cest, …)
● E. faecalis (90 %), E. faecium (5–10 %)
● VRE – vankomycin rezistentní enterokoky
32/60
Rod Enterococcus (2)
● G+ koky, dvojice, řetízky
● žluč eskulinový agar (tmavě hnědé
až černé drobné kolonie nebo zbarvují
dvorec kultivační půdy černě)
● půda Slanetz-Bartley (růžové až červené kolonie)
33/60
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Rod Listeria
● G+ tyčky, krátké,
● fakultativně anaerobní, KAT+
● odolné (růst při vyšších koncentracích NaCl nebo
žlučových solí, růst při nízkých teplotách)
● L. monocytogenes (listerióza), L. ivanovi (listerióza
ovcí)
● listerióza:
– nejčastěji alimentární infekce (nedostatečně
pasterované mléko, sýry, krůtí a drůbeží maso,
zelenina)
– nejčastěji probíhá bezpříznakově, popř.
nevolnost, zvracení, průjem
34/60
Rod Listeria (2)
● listerióza:
– nejnebezpečnější u oslabených jedinců (nemoc,
stáří, gravidita)
– infekce ran, meningitida, meningoencephalitida nebo
encefalitidami dospělých
– infekce placenty, plodových obalů a celkové
generalizované onemocnění plodu provázeného
sepsí
– potraty ve druhém a třetím trimestru, narození
mrtvých nebo těžce nemocných novorozenců
(umírají brzy po porodu)
35/60
Koryneformní tyčky („difteroidy“)
● termín používaný zpravidla pro nesporulující G+
tyčky, kyjovitého tvaru, někdy rovné či zahnuté
● v minulosti všechny v rodu Corynebacterium
● vytvořeny nové rody (Arcanobacterium, Rhodococcus,
Dermatophilus, Turicella, …)
● Arcanobacterium haemolyticum – tonsilitidy, infekce
ran; KAT-, reverzní CAMP test
● Rhodococcus equi – infekce imunokompromitovaných
pacientů (transplantace, AIDS)
36/60
Reverzní CAMP test
37/60
Rod Corynebacterium
● G+ nesporulující tyčky
kyjovitého tvaru,
někdy pleomorfní
● typické uspořádání
v palisádách a
tzv. havraních křídlech
● fakultativně anaerobní, půdy s teluričitanem
● odolné k vyschnutí a NaCl, nerostou na agaru bez
přídavku krve
● Corynebacterium diphtheriae
● nedifterická (=nezáškrtová) korynebakteria (součást
mikroflóry kůže)
38/60
Corynebacterium diphtheriae
● původce záškrtu (diftérie)
● difterický toxin (nezbytná přítomnost genu tox,
přenášený β-bakteriofágem, ireverzibilně blokuje
proteosyntézu → zánik infikované buňky)
● pseudomembrána z fibrinu, pod níž jsou bakterie
produkující toxin → nekróza okolních buněk
● pseudomembrány vznikající ve sliznici HCD mohou
vést k jejich mechanické obstrukci, edému sliznice a
následně k udušení
● akutní infekce léčena podáním antitoxinů
● prevence očkováním (hexavakcína)
39/60
Corynebacterium diphtheriae (2)
masivní zvětšení krčních
uzlin u diftérie
40/60
pseudomembrána
Nedifterická korynebakteria
● součástí běžné mikroflóry kůže
● infekce ran, katétrové sepse, postihují vnitřní orgány při
průniku do organismu
● Corynebacterium jejkeium:
– dříve „korynebakterium skupiny JK“
– nozokomiální infekce (až 40 % hospitalizovaných
pacientů, zřídka na kůži zdravých jedinců)
– katétrové sepse, polyrezistence
● Corynebacterium pseudotuberculosis – lymfadenitidy,
pneumonie, záněty kůže
● Corynebacterium urealyticum – pyelonefritidy, cystitidy
41/60
Rod Bacillus
● G+ tyčky, robustní, rovné až konkávní konce, tvoří
endospory, často pohyblivé, obvykle KAT+
● většina zástupců běžně přítomna v prostředí (tvorba
endospor)
● v klinickém prostředí časté kontaminace
● podle morfologie spor rozdělení do tří skupin:
– oválné spory, nevyklenují buňku (B. anthracis,
B. cereus, B. subtilis, ...)
– oválné spory, vyklenují buňku
(G. stearothermophilus, B. polymyxa, ...)
– sférické spory, vyklenují buňku (B. sphaericus)
42/60
Rod Bacillus (2)
● rozdělení dle morfologie endospor:
43/60
Bacillus anthracis
● obligátní patogen, původce anthraxu (sněť
slezinná, uhlák)
● plicní anthrax: spory pronikají do plicních alveolů →
makrofágy do mediastinálních uzlin (zpočátku
připomíná chřipkovité onemocnění) → hemoragická
nekróza uzlin a bakteriémie → septický šok a respirační
selhání; bez včasného podání ATB letalita až 100 %
● kožní anthrax: papula v místě vstupu → vřed se silným
edémem a hemoragickou nekrózou v centru →
regionální lymfadenitida → sepse u neléčení infekce
● střevní anthrax: nauzea, zvracení, horečka, bolesti
břicha, krvavé průjmy → sepse; letalita až 50 %
● lékem volby jsou penicilinová ATB
44/60
Další druhy rodu Bacillus
● B. cereus – součástí střevní mikroflóry, alimentární
enterotoxikózy při přemnožení; devastující infekce oka
● B. subtilis, Geobacillus (dříve Bacillus)
stearothermophilus – spory přežívají vysoké teploty,
indikátory účinnosti sterilizátorů
45/60
Léčba infekcí způsobených
enterokoky a G+ tyčkami
● enterokoky a listerie rezistentní na cefalosporiny
● E. faecalis ampicilin, E. faecium je k ampicilinu
primárně rezistentní
● ko-trimoxazol, doxycyklin, jako rezerva vankomycin
● vankomycin rezistentní kmeny (VRE)
– zejména u hematoonkologických pacientů
– linezolid (oxazolidinony, inhibice proteosyntézy)
– quinupristin/dalfopristin (streptograminy, inhibice
proteosyntézy)
46/60
Enterokoky Listerie Koryneform. Bacillus
G+ koky
v krátkých
řetízcích
G+ tyčky,
mohou tvořit
řetízky či
palisády
G+ tyčky
skládající se
vedle sebe
(palisády,
„havraní
křídla“)
G+ robustní
tyčky,
sporulující
(nemusí být
viditelné)
šedavé,
velké asi jako
S.
agalactiae,
většinou bez
hemolýzy,
ale i s virid.
či hemol.
podobné
entero-
kokům,
hemolýza je
či není
velmi drobné
kolonie
(podobné
mouce)
plsťovité
kolonie,
někdy i
výrazná
hemolýza
Enterokoky a G+ tyčky:
přehled kultivace a mikroskopie
47/60
MikroskopieKultivace
Diagnostika enterokoků
● biochemické testy: KAT-, štěpení arabinosy
(E. faecalis neštěpí, půda je zelená, E. faecium štěpí,
žlutá), ENCOCCUStest
● antigenní analýza: zpravidla se nepoužívá (dle
Lancefieldové antigenní skupina D
● citlivost lze testovat na běžném MH agaru bez krve
● speciální půdy na skríning VRE
48/60
Diferenciální diagnostika
enterokoků
● Gramovo barvení: grampozitivní koky, grampozitivní
tyčinky a ostatní bakterie
● stafylokoky: KAT+, růst na agaru s 10 % NaCl
● streptokoky: nepřítomnost růstu na Slanetz-Bartleyho
či žluč-eskulinové půdě, popř. PYR testem (kromě
S. pyogenes negativní)
● enterokoky: růst na Slanetz-Bartleyho či
žluč-eskulinové půdě, PYR test pozitivní
● vzájemné rozlišení enterokoků arabinózovým testem
nebo složitějším ENCOCCUS testem
49/60
Diagnostika G+ tyček
● biochemické testy: KAT+ (Arcanobacterium KAT–),
biochemicky lze rozlišovat koryneformní tyčinky
navzájem (API Coryne, Remel)
● růst při nízkých teplotách, vysokých koncentracích
NaCl a hemolytické interakce se používají v diagnostice
listerií
● průkaz antigenu – např. průkaz difterického toxinu
Elekovým testem
50/60
Diferenciální diagnostika G+ tyček
● u G+ tyčinek ale není jednoznačný algoritmus!
● Gramovo barvení: odliší grampozitivní tyčinky od
ostatních (bacily robustní tyčky, často tvorba endospor
● bacily kultivačně charakteristické (velké plsťovité
kolonie)
● druhové určení je možné biochemickými testy, testy
citlivosti na antibiotika apod.
● pokud tyčky nesporulují a nejsou robustní, mělo
by jít o listerie nebo některou z koryneformních
tyček (samotná nepřítomnost endospory není důkaz!)
● další rozlišení je možné biochemicky, růstem při
různých teplotách, testy hemolytických interakcí
(synergismů, antagonismů) apod. 51/60
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
● obarvěte podle Grama osm kmenů
● G+ koky, G+ tyčky, jeden kmen G– tyčka
● Bacillus – robustní tyčinky, někdy s nálezem
centrálně až subterminálně uložených endospór, jež
mohou, ale nemusí vyklenovat tyčku
● Listeria – mikroskopicky drobnější než Bacillus,
neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých
řetízcích
● Corynebacterium – kyjovité, uspořádané do palisád či
„havraních křídel“
52/60
Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků
a tyčinek
● popište kolonie, odhadněte rody bakterií
● Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie,
„rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou
hemolýzou, jindy zcela bez ní
● Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi
podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s
hemolýzou
● Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo
bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o
hodně menší, většinou bez hemolýzy
53/60
Úkol 3: Některé běžné
biochemické a kultivační testy
● úkol 3a: katalázový test (Listeria, Corynebacterium i
Bacillus pozitivní)
● úkol 3b: růst na Slanetz-Bartleyho půdě (pro
enterokoky, pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale
navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu)
● úkol 3c: růst na žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky a listerie, pozitivní jsou černé kolonie)
54/60
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris
Skalka, DrSc.
Úkol 4: Vzájemné rozlišení
enterokoků
● úkol 4a: arabinózový test pro druhové rozlišení dvou
nejběžnějších druhů enterokoků (E. faecalis neštěpí,
půda je zelená, E. faecium štěpí, žlutá)
● úkol 4b:
MALDI-TOF (dva enterokoky a jedna koryneformní
tyčka)
ENCOCCUStest
55/60
Úkol 5: Další metody k diagnostice
listerií
● úkol 5a: růst listerií při 4 °C (listerie je schopna
růst při nízkých teplotách; některé druhy yersinií a
pseudomonád také.)
● úkol 5b: demonstrace růstu Listeria monocytogenes
na chromogenní půdě (půda ALOA, modré zbarvení
všech kolonií listerií, přičemž patogenní druhy navíc
mají kolem sebe halo (odlišně zbarvené okolí
kolonie).
56/60
Úkol 5b: Chromogenní půda ALOA
57/60
HALO
modré zbarvení všech kolonií listerií, patogenní druhy
mají kolem sebe halo
Úkol 6: Vztah enterokoků a G+
tyčinek k antibiotikům
● úkol 6a: odečtěte diskový difuzní test
● úkol 6b: demonstrace testu citlivosti u kmene
Enterococcus faecium (k ampicilinu primárně
rezistentní)
● úkol 6c: demonstrace kmene VRE
58/60
Úkol 7: Demonstrace Elekova testu
● precipitace mezi toxinem z toxického kmene a
antitoxinem z papírového proužku napuštěného
antisérem
59/60
Po tomto cvičení byste měli umět:
● vysvětlit význam a podstatu biochemických
identifikačních metod v mikrobiologii
● popsat nejběžnější testy, které se v mikrobiologii
využívají a spojit je s konkrétní příklady využití
v diagnostice a umět provést nejběžnější testy
● popsat zástupce rodu Enterococcus a hlavní klinicky
významné G+ tyčky, vč. diagnostických postupů, které
vedou k úspěšné identifikaci
● diskutovat význam VRE, jejich diagnostické
a terapeutické možnosti
● obecně vysvětlit princip a význam precipitace v agaru
a popsat Elekův test
60/60