P04
|    Dekontaminační metody |
I Diagnostika enterobakterií a I
bakteriálních původců gastrointestinálních infekcí
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
• dekontaminační metody
- desinfekce, vyšší stupeň desinfekce
- sterilizace
- mytí a dezinfekce rukou
• čeleď Enterobacteriaceae
• rod Campylobacter, rod Helicobacter
• čeleď Vibrionaceae
• úkoly
Bakterie a vnější prostředí
• fyzikální a chemické faktory
- optimum
- inhibiční mez (mez růstu)
- baktericidní mez (mez přežití)
dolní mez přežití    dolní mez růstu    f       horní mez růstu horní mez přežití (letální, mikrobicidní)       (inhibiční)   °Ptimum   (mez množení)   (usmrcující hodnota)
3/54
Dekontaminace
• fyzikální a chemické postupy likvidace mikrobů, hmyzu a hlodavců mimo organismus
- likvidace hmyzu a hlodavců někdy zvlášť (asanace)
- nezařazujeme likvidaci mikrobů v organismu (ani lokální, tzn. antiseptika)
• baktericidní mez = kombinace intenzity působícího faktoru (faktorů) a času
4/54
Přehled dekontaminačnich metod
• předpis č. 306/2012 Sb.
• Vyhláška o podmínkách předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnenia o hygienických požadavcích na provoz zdravotnických zařízení a ústavů sociální péče
Sterilizace	Zničení všech mikrobů v daném prostředí
Vyšší stupeň desinfekce	Zničení naprosté většiny mikrobů, některé formy života mohou přežívat (cysty prvoků a pod.)
Dezinfekce	Zničení patogenních mikrobů (závisí na okolnostech)
Dezinsekce	Zničení škodlivého hmyzu
Deratizace   Zničení škodlivých hlodavců 5/54
Asepse a antisepse
přístup:
- pasivní -> asepse
- aktivní -> antisepse
- předpokládá se primárně sterilní nebo patogenů prosté prostředí, bráníme kontaminaci vzorku
- pracovní postupy, sterilní/jednorázové pomůcky, uspořádání pracovních prostor, ...
antisepse:
- dezinfekce, sterilizace (někdy též použití antiseptik)
6/54
Zásady správné dekontaminace
• výběr vhodné metody/prostředku
• vhodný:
- musí bezpečně ničit všechny organismy (sterilizace)
- musí bezpečně ničit všechny patogenní organismy (dezinfekce)
- nesmí ničit sterilizovaný/dezinfikovaný materiál
- musí být prakticky použitelný
• použití dostatečné intenzity a doby působení
7/54
Kroky před a po dekontaminaci
• před dekontaminací je časté mechanické očištění
(např. chirurgické nástroje) a osušení, postupy upravuje vyhláška
- u rukou postupujeme obráceně (dezinfekce -> mýdlo)
• po dekontaminaci mohou následovat oplach nebo odvětrání působící chemikálie, uchování dekontaminovaných předmětů
• uchovávání (tj. doba, jak dlouho předmět vydrží sterilní) upravuje vyhláška
8/54
Dezinfekce
• fyzikální metody:
- var za atmosférického tlaku (nejméně 30 minut)
- var v přetlakových nádobách (nejméně 20 minut)
- UV záření, filtrace, žíhání, spalování
- pasterizace
• ošetření nízkou teplotou po dlouhou dobu (LTLT: Low Temperature - Long Time)
• např. mléko při teplotě 62,5 °C po 30 minutách
• ošetření vysokou teplotou po krátkou dobu (HTST: High Temperature - Short Time)
- např. mléko při teplotě 72 °C za 15 sekund
• UHT (Ultra High Temperature)
- např. mléko a smetana na 135 - 150 °C po 1 - 2 sekundy
9/54
Dezinfekce (2)
• chemické metody:
- oxidační činidla:
• peroxidy: peroctová kyselina (CH3COOOH, Persteril), působí i na spory, houby, TBC; 0,5% roztok = vyšší stupeň dezinfekce; nevýhody: agresivita, nestabilita, odbarvování textilií
• peroxid vodíku (H202), podobné účinky, méně agresivní, ale také méně účinný
• chlorové preparáty: chlornan sodný (NaClO, Savo), chlornan vápenatý (Ca(CIO)2, chlorové vápno), chloramin (chloramin T, dříve chloramin B)
10/54
Dezinfekce (3)
• chemické metody:
- oxidační činidla:
• jodové preparáty: jodová tinktura; Jodonal B, Jodisol, Betadine obsahují jód v komplexu
• manganistan draselný (již se nevyužívá)
- formaldehyd (konzervace, ve směsích), kresol
- ethanol (70% roztok, ve směsích)
- tenzidy: Orthosan BF 12, Ajatin, Septonex
- anorganické kyseliny a zásady
- těžké kovy
- kombinované přípravky (Incidur)
Spektrum účinku dezinfekce
• A = baktericidní (usmrcují vegetativní formy bakterií a mikroskopické kvasinkové houby)
• B = virucidní (usmrcují viry)
• C = sporocidní (inaktivují spory bakterií)
• T = tuberkulocidní (působí na původce tuberkulózy)
• M = mykobaktericidní (působí i na atypická mykobakteria)
• V = fungicidní (působí proti mikroskopickým kvasinkám i vláknitým houbám)
12/54
I Umývání a dezinfekce rukou
• pojmy z legislativy:
- Mechanické mytí rukou (MMR) - mytí mýdlem, předchází CHDR
- Hygienické mytí rukou (HMR) - mytí dezinfekčním mýdlem
- Hygienická dezinfekce rukou (HDR) - dezinfekce např. alkoholovými prostředky, doporučené ve zdravotnictví
- Chirurgická dezinfekce rukou (CHDR)
• umývání a dezinfekce rukou je nezbytná i při použití rukavic
13/54
Rotační tření levého palce sevřeného v pravé dlani a naopak;
Rotační tření v obou směrech sevřenými prsty pravé ruky o levou dlaň a naopak;
Po usušení jsou Vaše ruce dezinfikovaný.
14/54
I Nejčastěji vynechávaná místa
Mast frequently missed
Less frequently mlised
BACKOF HAND
FRONTOF HAND
pat htoradianthealth. corn
15/54
Vyšší stupeň dezinfekce
• dezinfekční přípravek se širokým spektrem
účinnosti (Persteril, glutaraldehyd, apod.)
• nemusí ničit cysty prvoků a vajíčka červů
• pro zdravotnické prostředky, které nemohou být dostupnými metodami sterilizovaný
• používají se k výkonům a vyšetřování mikrobiálně fyziologicky neosídlených tělních dutin (flexibilní endoskopy)
• dvoustupňová dezinfekce = vyšší stupeň dezinfekce + oplach pitnou/čištěnou vodou
- používá se k výkonům a vyšetřování mikrobiálně fyziologicky osídlených tělních dutin
16/54
Fyzikální sterilizace
• vlhkým teplem (sytou vodní parou) pod tlakem (autoklávování)
- předměty z kovu, skla, porcelánu, keramiky, textil gumy, plastů, aj.
- 121 °C + přetlak 1,05 bar / 20 minut
- 134 °C + přetlak 2,04 bar / 10 minut
- 134 °C + přetlak 2,04 bar / 60 minut (suspektní prionová nákaza; ve spojení v alkalickým mytím)
• cirkulujícím (proudícím) horkým vzduchem
- předměty z kovu, skla, porcelánu, keramiky
- 160 °C / 60 minut; 170 °C / 30 minut; 180 °C / 20 minut
Fyzikální sterilizace (2)
• plazmou
- vysokofrekvenční elektromagnetické pole nebo vysokonapěťový výboj
- ve vysokém vakuu působením na páry peroxidu vodíku, nebo jiné chemické látky uvolňují volné radikály kyslíku (hydroxyl, hydroperoxyl)
- účinek je dán nízkoteplotní plazmou plynu (peroxid vodíku, kyselina peroctová) při teplotě do 50 °C, čas od 30 do 75 minut (podle přístroje)
- termolabilní nástroje a pomůcky
18/54
Fyzikální sterilizace (3)
• radiační
- využití Y-záření v dávce minimálně 25 kGy
- používá se pro sterilizaci nových výrobků, hlavně lékařských předmětů pro jedno použití z plastických hmot, textilie apod.
• ohněm (mikrobiologické kličky, odpady)
• tlakem (paskalizace, 6000 bar, potravinářství)
• ostatní: frakcionovaná sterilizace, filtrace, ...
19/54
Chemická sterilizace
• pro termolabilní materiál, který nelze sterilizovat fyzikálními způsoby sterilizace
• sterilizačním médiem jsou plyny předepsaného složení a koncentrace a sterilizace probíhá za stanoveného přetlaku nebo podtlaku a teplotě do 80
• páry formaldehydu nebo ethylenoxidu
Kontrola účinnosti dekontaminace
• orientačně (smyslově) - charakteristický zápach
• stanovení skutečné koncentrace dezinfekčních prostředků (chemická analýza)
• chemická kontrola sterilizace (využití indikátorů; např. Bowie-Dick test - test správného odvzdušnení a průniku páry)
• biologická kontrola - využití spor odolných kmenů
rodů Bacillus nebo Geobacillus {B. atrophaeus, G. stearothermophilus)
21/54
Čeleď Enterobacteriaceae
• G- tyčky, většinou pohyblivé (kromě shigel, klebsiel a Y. pěstis),
• OXI- (KAT+), biochemicky značně aktivní
• komenzálové, saprofyté, patogeny střevní i mimostřevní (obligátní i oportunní patogeny)
• klinicky nejdůležitější čeleďG- tyček
22/54
Čeleď Enterobacteriaceae: patogeny
• způsobující celkové (systémové) infekce:
- Yersinia pest is (mor)
- antropopatogenní serovary salmonel (sérovary Typhi, Paratyphi A, B a C - břišní tyfus)
• obligátní patogeny způsobující zpravidla střevní infekce:
- zoopatogenní serovary salmonel (sérovary Enteritidis, Typhimurium - salmonelózy)
- shigely, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis
• podmíněně patogenní enterobakterie:
- rody Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Enterobacter, ...
23/54
Yersinia pestis
• původce moru
• přenašeč: blecha morová (Xenopsylla cheopsis)
• zdroj: krysy, potkani a jiní hlodavci
• formy onemocnění: I
- dýmějový (bubonický) mor I
- plicní forma |
- septická forma ■
Dýmějový (bubonický) mor
hemoragie a srážení krve -> bubon (zvětšená uzlina) v podpaží odtud označení černá smrt
25/54
Antropopatogenni salmonely
• S. enteríca spp. enterica sérovary Typhi a Paratyphi
• septická onemocnění břišní tyfu s/para tyf u s
• vstupní branou je trávicí trakt (kontaminovaná voda) -> inkubační doba 10-14 dní ->
primárni bakteriémie,
• Widalova reakce (aglutinace)
• S. Typhi
- antigény O: 9, 12
- antigény H: d
- antigény pouzdra: Vi
vysoké teploty, silné bolesti hlavy
http://centrumcestovnimediciny.c2
26/54
Zoopatogenni salmonely
• S. enteríca spp. enterica sérovary Enteritidis, Typhimurium, aj.
• fekálně-orální přenos - kontaminované potraviny (zejména vejce, syrové drůbeží a vepřové maso)
• salmonelózy (průjmy bez krve, horečka, zvracení, oslabených jedinců možná sepse)
• vysoká infekční dávka (cca lO^-lOs bakterií) = nutnost pomnožit se v nějaké potravině
• 5. Enteritidis
- antigény O: 1, 9, 12
- antigény H: g, m
I Rod Shigella
• Shigella dysenteriae, S. flexneri, ...
• fekálně-orální přenos, typická nemoc „špinavých rukou", možný i alimentární přenos (voda, mléko, ...)
• shigelóza = bacilární úplavice/dysenterie (průjmy s krví a hlenem, horečka, křeče v břiše, zvracení)
• nízká infekční dávka (cca 102 bakterií)
28/54
Escherichia coli
• důležitá součást střevní mikroflóry (produkce kolicinů a mikrocinů), omezuje kolonizaci střeva jinými bakteriemi
• patogeny ve střevě:
- EPEC (enteropatogenní EC) - novorozenecké průjmy
- ETEC (enterotoxigenní EC) - průjmy (cestovatelské)
- EIEC (enteroinvazivní EC) - krvavé průjmy
- EHEC = STEC (enterohemoragické, shiga-like toxigenní EC) - hemolyticko-uremický syndrom (průjem, zvracení, horečka, následuje anémie, petechie, ... až selhání ledvin a neurologické příznaky)
• zejména sérotyp 0157:H7 (dále 026, 055, 0111)
• nízká infekční dávka (< 50 bakterií)
29/54
Escherichia coli (2)
• patogeny ve střevě:
- EAEC (enteroagregativní EC) - cestovatelské průjmy
- DAEC (difúzně-adherentní EC) - cestovatelské vodnaté průjmy se zvracením
• patogeny mimo střevo:
- UPEC (uropatogenní EC)
- kmeny způsobující respirační infekce, sepse, infekce ran, novorozenecké meningitidy...
• epidemie v Německu 2011 (EAEC O104:H4, která získala geny pro shiga toxin od STEC horizontálním přenosem)
30/54
Escherichia coli (3)
microbewiki.ksnyon.edu
Delivery of LT or ST en terato* ins
ETEC
DAEC
/*\    f\   infimäle /*\ anartinienr of bacteria
condensation and micfoviitous etfacemenl
\
de+ivery of Shiga town
EHEC
iriitra! adherence via WFP
m Limite
iffiMr attachment
aclin
condensation and migtpvillQiis effatemenl
EPEC
aggragatrvo adherer oe
biofilm
Delivery of cylotoxin
EAEC
invasion
phagosomaf rupture
lateral P) spreadto adjacent ceil
31/54
Rod Klebsiella
opouzdřené bakterie
pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae
nozokomiální patogeny
- infekce močových cest
- Pneumonie, sepse
Rod Proteus
• Próteus mirabilis, Próteus vulgaris
• původci močových infekcí
• typický je plazivý růst (tj. neroste jen v místě inokulace, ale šíří se po povrchu agaru do stran), tzv. Raussův fenomén či fenomén příbojové vlny
Multirezistentni enterobakterie
rezistence na vetsi množství antibiotik
častí producenti širokospektrých betalaktamáz typu ESBL popř. ampC
Izoláty E. coli
rezistentní
k aminopenicilinům,
rok 2013
Percentage resistance
H < 1%
E3 lto < 5% [I : 5 to < 10% H 10 to < 25% H 25 to < 50% H > 50%
H No data reported orlessthan 10 isolates I   I Notincluded
Liechtenstein Luxembourg Malta
1C;i ä:DC.Oj»la:.iTÍSS>-
Multirezistentní enterobakterie (2)
Percentage resistance
H < 1%
E3 lto < 5%
5 to < 10% H ID to <25% M Z5to < 50%
H No data reported or less than 10 isolates l   l Notincluded
Multirezistentní izoláty K. pneumoniae, rezistence ke 3. gen. cefalosporinů, fluorochinolonům a aminoglykosidům, rok 2013
Liechtenstein Luxembourg Malta
;c;. 5CDC.Íljirlii.iTE££>-
35/54
Campylobacter jejuni
• G- zahnutá tyčka (nepatří mezi enterobakterie), 0X1 +
• kampylobakterióza - průběh a závažnost onemocnění srovnatelná se salmonelózou (nebývá zvracení)
• fekálně-orální přenos - kontaminované potraviny (zejména drůbeží maso)
• speciální kultivace (viz úkol č. 7):
- černá „půda pro kampylobaktery" (CCDA - charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar); ^^^^^»«n
teplota 42 °C
zvýšená tenze C02
prodloužená kultivace na 48 hodin
neroste na KA a ENDO
Helicobacter pylori
G- zahnutá (spirálovitá) tyčka (nepatří mezi enterobakterie)
v žaludku -> mohutnou ureázovou aktivitou si
upravuje mikroprostředí (využití pro dg.)
podíl na vzniku gastroduodenálních vředů
speciální půda tj^ ^ X^C\ f C\ %
(kultivace 5 dní) ^/V^-Č Vv" H
i
H2N NH2
\ / urease
V x,     *3#> ikW
C +H20->2NH3+COz 7 .^H,
37/54
Čeleď: Vibrionaceae
• G- krátké zakřivené tyčky, pohyblivé, OXI +
• ve vodě v teplých oblastech
• Vibrio cholerae - cholera (těžké průjmové onemocnění, zvracení), sérotypy Ol a 0139
• halofilni vibria: I.................111
- V. vulnificus (infekce ran, sepse)
- V. parahaemolyticus
(gastroenteritis,
krvavé průjmy)
38/54
I Diferenciální diagnostika
• Gramovo barvení pro odlišení G- tyček
• ENDO: z klinicky významných rostou enterobakterie, Vibrionaceae a G- nefermentující tyčky (GNFB; praktikum P06)
• Hajnova půda pro odlišení GNFB (vše negativní)
• Oxidáza pro odlišení vibrií (pozor, některé GNFB mohou mít také pozitivní oxidázu; rod Plesiomonas má také pozitivní oxidázu, ačkoliv patří do čeledi Enterobacteriaceae)
39/54
Rozlišení enterobakterii
• ENDO: možné orientační rozlišení obligátních patogenů (většinou L-) a potenciálních patogenů (většinou L+)
• další půdy:
- XLD (salmonely černé, shigely růžové, ostatní enterobakterie žluté, G+ bakterie jsou inhibovány)
- MAL, Deoxycholát-citrátový (DC) agar (obě půdy podobné XLD, určené pro enterobakterie)
- CIN pro yersinie
• biochemické testy (Hajná, MIU, ENTEROtesty aj.)
• antigenní analýza (zpravidla sklíčková aglutinace)
40/54
I Úkol 1: Mikroskopie kmenů
• obarvěte podle Grama sedm kmenů (kromě kmenu N, ten je pro Vás již obarven)
• jeden z kmenů bude G+, výsledek si poznamenejte, dále už s ním ale nebudeme pracovat
41/54
Úkol 2: Kultivace naKAa ENDO
• popište kolonie na KA a ENDO
• na KA můžete vidět hemolýzu, není ale důležitá pro diagnostiku
• nezapomeňte že L+ kmeny mají nejen červené (též růžovočervené nebo kovový lesk) kolonie, ale i okolní
půdu (jinak je to jen pigment)
• kmeny, které nerostou ani na jedné z půd
a morfologicky se jeví jako zahnuté mohou být kampylobakter
- tyčky, které nejsou zahnuté budou probírány až v dalším z praktik
42/54
Úkol 3: Skupinová dg. G- tyček rostoucích na ENDO
• úkol 3a: Hajná - pátráme po GNFB, biochemicky neaktivním kmenu (tj. celá půda je červená), pokud je půda žlutá, tvoří kmen fermentuje Glc nebo Lac, pokud je černá, pak kmen tvoří sirovodík
• úkol 3b: Oxidáza - pro odlišení vibrií (OXI+) a enterobakterií (OXI-), GNFB mohou být 0X1+ i 0X1-
43/54
Úkol 3: Skupinová dg. G- tyček rostoucích na ENDO - HAJNÁ
Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
- štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
- štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
- produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
- tvorba plynu (POZ = potrhaná půda, bublinky, půda vysunutá nahoru)
/
- očkování vpichem a tzv. hádkem
B
fr.wik
Úkol 4: Další kultivační a biochemické testy
• úkol 4a: popište kmeny na XLD (salmonely mají bledé kolonie s černým středem) a dalších selektivních
• úkol 4b: ENTEROtest 16 (17 reakcí: 1. je ONPG, 2. až 9. jsou v prvním řádku, 10. až 17. ve druhém řádku)
45/54
I Úkol 5: Antigenní analýza
úkol 5a: vyloučení EPEC (sklíčková aglutinace se dvěma polyvalentními séry)
- pro detekci 12 serovarů EPEC nonavalentní sérum (I, II, III) a trivalentní sérum (IV)
- pokud je jedno z nich pozitivní, pokračujeme s příslušnými trivalentními resp. monovalentními séry
- neužívá se vždy, obyčejně však u obligátních patogenů (salmonely, shigely, yersinie) a u střevních izolátů E. coli při podezření na EPEC (děti do 3 let) nebo STEC
úkol 5b: určení sérováru salmonely (sklíčková
aglutinace se dvěma séry, obě musí být pozitivní; S. Enteritidis pozitivní tělový antigén 9, bičíkový g, m)
46/54
Úkol 6: test citlivosti na ATB
• antibiotická citlivost se neurčuje u kmenů ze stolice
(u bakteriálních průjmů podání ATB prodlužuje dobu vylučování patogenů ze střeva, doporučují se probiotika)
• antibiotická citlivost se určuje u kmenů z moče
- spektrum testovaných ATB zahrnuje i léky používané při léčbě močových infekcí (např. nitrofurantoin)
47/54
Úkol 7: Dg. kampylobakterů
• speciální kultivace:
- černá „půda pro kampylobaktery" (CCDA-charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar); neroste na KA a ENDO
- teplota 42 °C ^^^H
- zvýšená tenze C02
- prodloužená kultivace na 48 hod • OXI+ (typicky opožděná pozitivita)
48/54
Úkol 8: Ureázový test
v diagnostice helikobakterů
• helikobaktery nerostou na běžných půdách (mají speciální půdu, kultivace 5 dní)
• využívá se štěpení urey (ureázová aktivita je tak silná, že můžeme pracovat přímo s odebraným vzorkem (žaludeční tkáň)
• POZ = červená
• NEG = žlutá
clsdiagnostics.com
I Úkol 9: Dg. čeledi Vibrionaceae
• mikroskopicky zahnutá tyčka
• kultivace:
- pomnožení v alkalické peptonové vodě
- pevná půda TCŽS (thiosíran-citrát-žluč-sacharóza)
• pro biochemickou identifikaci můžeme použít sadu ENTEROtest 16, ale s jinou maticí
• antigenní analýza: sérovary Ol a 0139
• další biochemické testování sérovaru Ol (biovary Classic a El Tor)
50/54
Úkol 10: Vliv různých faktorů na růst a přežití bakterií
• úkol 10a: vliv teploty na bakterie (posuďte, které případy jsou inhibice růstu a které usmrcení bakterií)
• úkol 10b: vliv dezinfekčního činidla na bakterie
(určete minimální baktericidní koncentraci daného dezinfekčního činidla)
• úkol 10c: vliv času v kombinaci s teplotou
(sterilizace při dané teplotě po daný čas)
52/54
Úkol 11 a 12: Výběr vhodného dezinfekčního činidla; kontrola účinnosti dezinfekce
• úkol 11: popište různé situace a použité dezinfekční prostředky do tabulky
• úkol 12a: zkontrolujte účinnost horkovzdušného sterilizátoru a rozhodněte, zda je možné ho používat
• úkol 12b: zapište si místo steru z prostředí a jeho (ne)sterilitu
53/54
I Po tomto cvičení byste měli umět:
• správně použít dekontaminační metody (dezinfekce, vyšší stupeň dezinfekce, sterilizace) pro různé druhy materiálů a situací
• správně si mýt a dezinfikovat ruce
• popsat nejdůležitější zástupce čeledí Enterobacteriaceae a Vibrionaceae a rodů Campylobacter a Helicobacter vč. diagnostických postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
• posoudit, kdy je vhodné využít antigenní analýzu
• jmenovat klinicky nejdůležitější sérovary salmonel, escherichií a vibrií
54/54