P09
Přehled virologické
diagnostiky
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
● klasifikace a struktura virů
● replikace virů; adenoviry, picornaviry, respirační
viry; mykoplasmata
● virus klíšťové encefalitidy
● viry spalniček, zarděnek, příušnic
● viry hepatitid
● HIV virus
● herpesviry
● izolace a kultivace virů, cytopatický efekt
2/125
Viry
● elementární biosystém, který vykazuje některé
vlastnosti živých systémů (přítomnost genomu,
schopnost adaptace)
● nejsou schopny zabezpečit své energetické
nároky bez živé buňky a mimo ni nejsou funkčně
aktivní
● intracelulární parazité, postrádají proteosyntetický
aparát
● 2 fáze:
– neživé agregáty makromolekul mimo hostitelskou
buňku (metabolicky inertní)
– uvnitř buňky replikace a exprese genomu
(metabolicky aktivní)
3/125
Viry (2)
● společné znaky s živými organizmy:
– schopnost rozmnožování (de novo)
– přítomnost genomu
– variabilita (proměnlivost, mutace)
– adaptace (změna spektra hostitelů)
– vývoj (evoluce)
● odlišné znaky od živých organizmů:
– charakter genetického materiálu (RNA genomy)
– specifický druh parazitizmu (na genetické úrovni)
– nepřítomnost proteosyntetického aparátu
=> nebuněčná forma života
4/125
Viry
● původ není jasný, zdá se, že nemají společného předka
● rozdělení:
– DNA viry, RNA viry
– jednovláknové (ss = single stranded),
dvouvláknové (ds = double stranded)
● +ssRNA – slouží jako mRNA
● -ssRNA – RNA komplementární k mRNA, před
translací musí být nejdříve přepsána do +ssRNA
– přítomnost reverzní transkriptázy
– obal (obalené, neobalené)
5/125
Baltimorova klasifikace virů
6/125
Struktura virů
● virion = diskrétní virová částice
– intaktní virová částice = komplex virové NK a proteinů
(popř. i obalu) schopný infikovat buňku
● kapsid(a) = plášť viru tvořený bílkovinami (chrání a
stabilizují NK); určuje symetrii/tvar
● kapsomera = morfologická jednotka sdružující
strukturální podjednotky a tvořící kapsidu
● nukleokapsid(a) = strukturní útvar tvořený virovou NK
a bílkovinným obalem
– přítomná u většiny virů (bez ohledu na obal)
● proteinové podjednotky se k sobě spojují autoagregací
(energeticky výhodný proces; bez dodání energie)
7/125
Struktura virů (2)
● vnější obal (envelope) = lipidová dvojvrstva
s transmembránovými glykoproteiny
– glykoproteiny tvoří výběžky (peplomery, spikes)
na povrchu viru
– pro přichycení viru k hostitelské buňce
– tvořena komponenty z hostitelské buňky
(původně část cytoplazmatické nebo jaderné
membrány, endoplazmatického retikula nebo
Golgiho aparátu)
– obalené viry méně mechanicky odolné (citlivější
k vyschnutí, teplu nebo detergentům)
– výhodou je adaptabilita obalu → únik před
imunitním systémem hostitele
8/125
Symetrie kapsid
9/125
● ikosahedrální (kubická) = dvacetistěn se třemi osami
symetrie (2-, 3-, 5-četnou)
Symetrie kapsid (2)
● helikální (šroubovicová) = jednotlivé polypeptidy
(protomery) se řadí za sebou a jako šroubovice sledují
vlákno genomu
10/125
Symetrie kapsid (3)
● komplexní = uspořádání kapsomer neumožňuje
jednoznačné zařazení do předchozích skupin
11/125
Symetrie kapsid (4)
● symetrie nukleokapsidů pod vnějším obalem
12/125
Adenoviry
● neobalené dsDNA viry, ikosahedrální symetrie, středně
velké (90 nm)
● původně izolované z adenoidní vegetace (nosní mandle)
● přes 50 serotypů patogenních pro člověka
– respirační onemocnění (rýmy, tonsilitidy,
faryngitidy; ojediněle až fatální pneumonie – Ad 14)
– konjunktivitidy (faryngokonjunktivální horečka –
Ad 3, 4, 7; keratokonjunktivitidy – Ad 8, 19)
– gastroenteritidy (Ad 40, 41)
– akutní hemoragická cystitida (nefritida) (Ad 11, 21)
● pouze symptomatická léčba
13/125
Adenoviry (2)
14/125
Adenoviry (3)
● přichycení viru
glykoproteiny
● endocytóza
● rozrušení endosomu
lytickými enzymy
po snížení pH
● uvolnění virionu
do cytoplasmy
● transport k jádru
(mikrotubuly)
15/125
Adenoviry (4)
● přenos NK do jádra
16/125
Adenoviry (5)
● DNA v jádře:
– exprese časných genů (regulační proteiny):
● exprese proteinů nutných k replikaci DNA
● aktivace dalších virových genů
● zamezit IS zničit virus/napadenou buňku
(blokování apoptózy, interferonu a exprese a
transportu MHC I)
– replikace DNA (DNA viry často využívají DNA
polymerázu hostitele, ale adenoviry mají vlastní)
– exprese pozdních genů (strukturní proteiny)
● sestavení nových virionů, maturace
● opuštění buňky (lyze buňky)
17/125
Adenoviry (6)
18/125
Čeleď Picornaviridae
● neobalené +ssRNA viry, malé (30 nm), ikosahedrální,
odolné
● rod Enterovirus (poliovirus, rhinoviry, coxsackie viry,
echoviry)
● rod Hepatovirus (virus hepatitidy A)
● replikace: adsorpce → endocytóza → translace do
polyproteinu → replikace ve viral factories → sestavení
prokapsidu → maturace (neznámá proteáza) → lyze
buňky
● viral factories (intracelulární kompartmenty různého
původu; zvyšují efektivitu virové replikace a sestavení
virionů; ochrana před obranými mechanismy hostitele)
19/125
Čeleď Picornaviridae (2)
20/125
Viral factories
21/125
Viry chřipky
● obalené -ssRNA viry, 80 – 120 nm, kulaté, oválné,
někdy i protáhlé, segmentovaný genom (8 segmentů)
● replikace v jádře (u RNA virů výjimka)
● hemaglutininy
– membránové proteiny, hlavní povrchový antigen H
– přichycení k povrchu buňky – receptor kys. sialová
– fúze virového obalu a endosomu)
● neuraminidáza (N) – štěpení kys. sialové
– umožní pronikání viru přes hlen na sliznicích
– uvolnění virionů z buňky a zabránění jejich agregaci
22/125
Viry chřipky (2)
● https://www.youtube.com/watch?v=YSgkoldBNkI
23/125
Viry chřipky (3)
24/125
Chřipka
● příznaky: horečka (zimnice a třesavka), silné bolesti
hlavy, artralgie, myalgie, nevolnost až zvracení,
suchý dráždivý kašel
● nebezpečná u lidí se sníženou imunitou,
těhotných a starších osob
● některé subtypy vyvolávají u mladých lidí s dobrou
imunitou tzv. cytokinové bouře (neadekvátní
reakce IS) – pandemie španělské chřipky (H1N1,
1918), prasečí (mexické) chřipky (H1N1, 2009)
● virus chřipky A (nejčastější a nejzávažnější)
● virus chřipky B (sezónní, možné i střevní příznaky)
● virus chřipky C (mírný průběh, hlavně děti)
25/125
Chřipka (2)
● léčba:
– symptomatická (analgetika, antipyretika,
antitusika, expektorancia, nazální dekongescencia)
– specifická terapie – antivirotika
● antivirotika:
– amantadin, rimantadin (inhibitory M2-proteinu)
– modernější zanamivir (Relenza; inhal.) a
oseltamivir (Tamiflu) (inhibitory neuraminidázy)
● prevence:
– vakcína 2 subtypů chřipky A a dvou chřipky B
– v ČR nejvhodnější dobou pro očkování období od
října do prosince
26/125
Chřipka (3)
● evoluční vývoj:
– antigenní drift:
● malé změny hemaglutininu a neuraminidázy
způsobené náhodnými mutacemi
● infekce (epidemie) přichází v době, kdy je virus
dostatečně odlišný a IS ho nerozezná od předchozí
prodělané infekce
– antigenní shift:
● reasortace segmentů genomu mezi různými
kmeny viru (nejčastěji ptačí, prasečí a lidské
kmeny)
● rychlé získání odlišných antigenů, vyvolává
pandemie
27/125
Chřipka (4)
● pandemie:
– jen chřipka A (u ostatních je prakticky nemožné,
aby nastal antigenní shift)
– H1N1, španělšká chřipka (1918), prasečí
(mexická) chřipka (2009)
– H2N2, asijská chřipka (1957)
– H3N2, hongkongská chřipka (1968)
– H5N1, ptačí chřipka (2003, nejvíce od 2005)
● samotné subtypy H a N neříkají nic o nakažlivosti
a virulenci, záleží na konkrétní struktuře viru
● viry nebezpečné až po vhodné rekombinaci
různých částí různých virů
28/125
Viry parachřipky
● obalené -ssRNA viry, větší (150 nm), 4 typy
● příbuzné virům příušnic a spalniček
● postihuje zejména malé děti
● horečnaté infekce HCD (kašel, často katar), může
přejít i na DCD vč. zánětu plic
● diagnostika: KFR, HIT, ELISA (časté zkřížené reakce)
29/125
RS virus
● respirační syncyciální virus (rod Pneumovirus)
● obalené -ssRNA viry
● příbuzné virům parachřipek
● postihuje zejména kojence a malé děti
● jedna z nejčastějších příčin hospitalizace dětí
● bronchitidy, bronchiolitidy, zánět plic
● diagnostika: ELISA, buněčné kultury
● při replikaci viru vznikají mnohojaderná syncytia
● metapneumovirus (napadá starší děti; mírnější
příznaky onemocnění)
30/125
Mykoplasmata
● bakterie, nejmenší a nejjednodušší prokaryota, která
nepotřebují cizí buňku
● nemají buněčnou stěnu (→ nepůsobí β-laktamová
ATB), mají trojvrstevnou plazmatickou membránu (tvar
pleomorfní)
● rody Mycoplasma
a Ureaplasma
31/125
Mycoplasma pneumoniae
● původcem tzv. atypických pneumonií
● často jen jako rýma nebo bez příznaků
● mohou nastat i mimoplicní komplikace (srdeční,
nervové a jiné)
● ATB při těžších formách infekce
● citlivé na tetracykliny, makrolidy (u dětí),
● ATB bakterii neusmrcují, pouze zastavují její množení
(působení na proteosyntézu)
● diagnostika: KFR, ELISA (v rámci serologie
respiračních virů)
32/125
Další mykoplasmata
● Mycoplasma hominis
– běžně nacházený patogen převážně v urogenitálním
systému u žen a sexuálně aktivních mužů
– záněty pochvy, močové trubice, apod., které mohou
vyústit v hluboký pánevní zánět
● Mycoplasma genitalium
– negonokoková uretritida (muži), cervicitida (ženy),
hluboký pánevní zánět
● Ureaplasma urealyticum
– záněty pochvy, močové trubice
33/125
Virus klíšťové encefalitidy
● obalený +ssRNA virus, 50 nm, čeleď Flaviviridae
● klíšťová encefalitida:
– nejdříve mírné „chřipkovité“ příznaky
– encefalitida, meningitida, meningoencefalitida
– letalita 1 – 5 %
– arbovirus (arthropod-borne virus) – viry
přenášené členovci
– zdrojem lesní savci (hlodavci)
– diagnostika: KFR, HIT, ELISA, PCR, izolace na
sajících myšatech
34/125
Virus klíšťové encefalitidy (2)
35/125
Virus klíšťové encefalitidy (3)
● symptomy a diagnostika
36/125
Čeleď: Togaviridae
● obalené +ssRNA viry, ikosahedrální symetrie,
65-70 nm
● rod Rubivirus – virus rubeoly (zarděnky)
● rod Alphavirus – arboviry (arthropode born)
– viry koňské encefalitidy (EEE, WEE, VEE)
– viry horeček Chikungunya a O'nyong nyong
37/125
Virus rubeoly (zarděnky)
● lat. rubeo = zardívám se, angl. rubella
● čistě lidský virus
● benigní dětské onemocnění
● přenos vzduchem, inkubace 16–18 dní, začíná se
vylučovat nosohltanem už před výsevem vyrážky
● nebezpečné u těhotných (první trimestr → vrozené
vady – malformace srdce, sluchu či jiných orgánů
● diagnostika: klinické příznaky, ELISA, přímý průkaz
množením na tkáňových kulturách bez CPE (pomnožení
viru prokazováno interferencí, tj. přidáme virus, který by
normálně dělal CPE, např. echovirus 11)
● léčba: symptomaticky
38/125
Virus rubeoly
● obalený, +ssRNA, 65-70 nm
39/125
Zarděnky – příznaky
● makulopapulózní vyrážka, začíná na obličeji, šíří se na
celé tělo
40/125
Čeleď: Paramyxoviridae
● obalené -ssRNA viry, sférické, 150 nm
● podčeleď Paramyxovirinae
– Respirovirus – virus parachřipky 1 a 3
– Morbillivirus – virus spalniček
– Rubulavirus – virus příušnic, parachřipky 2, 4a, 4b
● podčeleď Pneumovirinae
– Pneumovirus – lidský RS virus
– Metapneumovirus – lidský metapneumovirus
41/125
Čeleď: Paramyxoviridae
● obalené -ssRNA viry, sférické, 150 nm
42/125
Virus spalniček (Morbillivirus)
● angl. measles nebo rubeolla
● neexistují bezpříznakové infekce:
– po 10–11 dnech horečka, rýma, kašel, záněty
spojivek → charakteristická vyrážka, začínající na
tvářích a za ušima (po 3–4 dnech vybledá)
– v ústech tzv. Koplikovy skvrny (šedé makuly)
● možné komplikace postihující dýchací a nervovou
soustavu
● vzácně reaktivace v dospělosti: subakutní sklerózující
panencefalitida (SSPE)
● diagnostika: serologie (ELISA, KFR, HIT)
● léčba: symptomaticky
43/125
Spalničky – příznaky
● vyrážka
● Koplikovy skvrny
(dole)
44/125
Virus příušnic
● angl. mumps
● vstup přes respirační trakt (kapénkově) → inkubační
doba 2-3 týdny, generalizovaná infekce
● otok slinných žláz, možné postižení CNS, slinivky břišní
a varlat (nebezpečné u mužů v pubertě → vzácně vede
ke sterilitě)
● diagnostika: serologie (HIT, KFR, ELISA), izolace
● léčba: symptomaticky
45/125
Příušnice – příznaky
46/125
MMR vakcína
● očkování proti spalničkám, příušnicím a zarděnkám
● živé oslabené viry
● indikováno dětem starším 15 měsíců, osobám vnímavým
na alespoň jednu z nákaz, při riziku komplikací
v těhotenství
● postexpoziční profylaxe po kontaktu se spalničkami
47/125
Viry hepatitid
● pět hlavních typů virových hepatitid VHA až VHE
● každý patří do jiné skupiny, většina jsou RNA viry, kromě
VHB je DNA virus s RT
● VHA a VHE – přenášejí se fekálně-orální cestou
(ruce), nepřecházejí do chronicity
● VHB, VHC a VHD – přenos krví, popř. sexuálně
(u VHC spíše nevýznamné), mohou přecházet do
chronicity, prekanceróza
● existují i další viry hepatitid
● pacient má horečky, trávicí potíže, může být přítomno
zežloutnutí skléry či kůže, změna barvy moče a stolice
atd.
48/125
Virus Zařazení Přenos
HAV Picornaviridae
+ssRNA
fekálně-orální
HBV Hepadnaviridae
dsDNA (RT)
sexuální, krví
HCV Flaviviridae
+ssRNA
krví
HDV Deltavirus (Delta
agens – viroid)
-ssRNA
sexuální, krví
HEV Hepeviridae
+ssRNA
fekálně-orální
Viry hepatitid – přehled
49/125
Hepatitis A virus
● neobalený, +ssRNA, 30 nm
50/125
Hepatitis B virus
● obalený, částečně dsDNA (RT), 42 nm
51/125
Hepatitis B virus (2)
● neinfekční částice produkované v nadbytku
52/125
Hepatitis B virus (3)
● neinfekční částice produkované v nadbytku
53/125
Hepatitis C virus
● obalený, +ssRNA, 50 nm
54/125
Hepatitis D virus
● obalený, -ssRNA
22 nm
● satelitní virus
(vyžaduje koinfekci
s HBV)
55/125
Hepatitis E virus
● neobalený, +ssRNA, 32-34 nm
56/125
Hepatitidy
● infekční záněty jater, lidově žloutenky
● hepatitida jako přenosné virové onemocnění
● hepatitida jako příznak, který je přítomen nejen při
virové hepatitidě, ale i např. při obstrukci žlučových cest
kameny
● nevirové hepatitidy:
– metabolická (Wilsonova choroba – abnormální
střádáním mědi v játrech → způsobuje poškození
jaterních buněk, poruchy funkce CNS a hemolytickou
anémii; porfyrie = hromadění prekursorů hemu v
játrech)
– toxická (alkohol, léky)
57/125
Hepatitida příznaky
● typická ikterická forma (u všech hepatitid je však
častější forma anikterická)
58/125
Prevence hepatitid
● očkování proti hepatitidě A je dostupné a
doporučené např. i při cestách do jižní Evropy či severní
Afriky
● očkování proti hepatitidě B nyní součástí normálního
očkovacího kalendáře (hexavakcína)
● možné současné očkování proti hepatitidě A i B
● očkování proti hepatitidě C není (několik genotypů,
velké množství subtypů, snadno mutuje)
● očkování proti hepatitidě D = proti HBV
● experimentální vakcíny proti HEV (různé fáze klinických
studií, uvedení na trh zřejmě nebude v dohledné době)
59/125
Diagnostika hepatitid A, C, D, E
● HAV: stanovujeme metodou ELISA anti-HAV IgM s IgG,
nebo IgM a celkové protilátky
● HCV: stanovujeme IgM a IgG protilátky metodou
ELISA, dále se používá PCR
● HDV: prokazuje se delta antigen (HDAg), protilátky
(anti-HD) či virová RNA pomocí PCR
● HEV: průkaz IgM a IgG protilátek metodou ELISA, ve
výzkumu i PCR
60/125
Zvláštnosti diagnostiky HBV
● nuleokapsida – dvě dřeňové bílkoviny, které mají
povahu antigenů (HBcAg a HBeAg)
● obal – antigen HBsAg
● HBsAg je nadprodukován (v krvi kolují i prázdné obaly)
● do prázdného HBsAg může proniknout delta
agens – původce hepatitidy D
● delta agens podstatně zhoršuje prognózu virové
hepatitidy
61/125
Hepatitis B virus (2)
● neinfekční částice produkované v nadbytku
62/125
Diagnostika HBV
● HBV má tři pro diagnostiku významné antigeny, jen dva
z nich však nalézáme v séru: HBsAg a HBeAg
● HBsAg se tvoří v nadbytku, takže je ho vždy v séru
hodně, proto se hodí pro screening
● protilátky naopak můžeme stanovovat proti všem třem
z nich: anti-HBs, anti-HBe i anti-HBc.
● diagnostiku případně doplní PCR, průkaz jaterních
enzymů aj.
● z kombinace vyšetření plyne interpretace
63/125
Screening a léčba hepatitid
● screening hepatitidy B běžný (před operacemi, v
těhotenství apod.)
● léčba akutních hepatitid je symptomatická a
podpůrná
● základem terapie klidový dietní režim, použití
hepatoprotektiv
● VHC –časná léčba interferonem může zabránit
přechodu do chronicity
● antivirotika: lamivudin (HBV)
64/125
Virus HIV
● retrovirus (reverzní transkriptáza)
● HIV 1 – ve střední Africe a v ostatních kontinentech,
kam se rozšířil
● HIV 2 – pouze v západní Africe, rozvoj onemocnění je
pomalejší než u infekce HIV 1
● přenos se krví, pohlavní cestou, z matky na dítě
(transplacentárně i mateřským mlékem)
65/125
Průběh infekce virem HIV
● primoinfekce virem HIV (težký pokles CD4+
lymfocytů, přechodná virémie, příznaky podobné jako
tonsilofaryngitida, infekční mononukleóze či chřipce)
● bezpříznakové stádium (18 měsíců až 15 let,
perzistující generalizovaná lymfadenopatie)
● časné symptomatické stádium (celkové příznaky –
horečka nad 38,5° C, noční pocení, únava, úbytek na
váze; časté malé oportunní infekce
● pozdní symptomatické stádium, AIDS (konečné
stadium HIV infekce, velké oportunní infekce, nádory,
encefalopatie)
66/125
Virion HIV
● obalený, dvě kopie +ssRNA, 80-100 nm
67/125
Diagnostika HIV
● protilátky proti obalovým glykoproteinům pomocí
ELISA testů (gp41, gp120)
● výsledek vyjde jako pozitivní, pošle se vzorek séra do
referenční laboratoře, která výsledek ověří
(konfirmuje) další reakcí ELISA a Western blottem
● do výsledků konfirmace je výsledek hodnocen jako
„reaktivní“, nikoli jako „pozitivní“
● přímý průkaz lze provádět pomocí PCR
● izolace viru je dnes již možná, ale velmi náročná a
běžně se neprovádí
68/125
Herpetické viry
● obalené, dsDNA, ikosahedrální symetrie, poměrně
velké (HSV-1 150-200 nm)
● typické dlouhodobé přetrvávání v organismu (fáze
latence) v nervových a lymfatických tkáních
● reaktivace při stresové situaci popř. oslabení
imunitního systému
69/125
Herpetické viry (2)
● obalený, lineární dsDNA, 150-200 nm
70/125
Zkratka,
podčeleď
Celé jméno Choroba
HSV-1 + 2
(alfa)
Herpes simplex virus herpes simplex
(prostý opar)
VZV
(alfa)
Varicella zoster virus plané neštovice,
pásový opar
EBV
(gamma)
Virus Epstein-Barrové infekční
mononukleóza
CMV
(beta)
Cytomegalovirus cytomegaloviróza
HHV-6 + 7
(beta)
Lidský herpesvirus
6 + 7
exanthema
subitum
HHV-8
(gamma)
Lidský herpesvirus 8 Kaposiho sarkom
Herpetické viry (2)
71/125
Herpes simplex virus
● po infekci viry přežívají v nervových gangliích
● HSV-1: herpes labialis (bolestivé puchýřky v oblasti
úst, může se ale objevit i jinde)
– závažné komplikace (encefalitida, infekce oka)
● HSV-2: herpes genitalis (bolestivé puchýřky v oblasti
genitálu a anu
● diagnostika: klinické příznaky, PCR, popř. izolace viru
● léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir (nepůsobí na
latentní infekci, infekce nejsou vyléčitelné → latence)
72/125
Herpes labialis, herpes genitalis
● HSV-1
● HSV-2
73/125
Varicella zoster virus (VZV)
● bránou vstupu respirační trakt → pomnožení
v lymfatických uzlinách → hematogenní rozsev do kůže a
sliznic → tvorba puchýřků (plané neštovice)
● perzistuje ve spinálních gangliích interkostálních
nervů
● při oslabení imunity nebo stresu se šíří
anterográdně do senzitivní oblasti příslušného nervu →
pásový opar
● diagnostika: PCR, ELISA, popř. kultivace
● léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir
74/125
Plané neštovice
75/125
Pásový opar
76/125
Cytomegalovirus (CMV)
● název odvozen od zvětšených buněk napadených virem
(virus zabraní apoptóze zprostředkovanou mitochondriemi)
● vstup respiračním nebo trávicím traktem → pomnožení
a hematogenní rozsev → perzistence ve slinných žlázách,
renálních tubulech, leukocytech
● u většiny probíhá infekce bezpříznakově, méně často
syndrom infekční mononukleózy (teplota, lymfadenopatie)
● infekce je závažná u těhotných (infekce plodu) a
imunokompromitovaných (transplantace, AIDS, apod.)
● diagnostika: serologie, PCR, kultivace
● léčba: ganciklovir, foskarnet
77/125
Lidský herpesvirus 6 + 7
● HHV-6A, HHV-6B; HHV-7
● infekce probíhá u dětí nejčastěji do 1. roku života,
přenos kontaktem → zvýšená teplota, někdy
doprovázená exantémem (exanthema subitum
neboli roseola infantum)
● reaktivace bezpříznakové, s výjimkou
imunokompronitovaných jedinců
● diagnostika: klinické příznaky, serologie, izolace viru
● léčba: symptomaticky, výjimečně ganciklovir apod.
78/125
Exanthema subitum neboli
roseola infantum
79/125
Virus Epsteinův – Barrové
● brána vstupu respirační trakt → pomnožení v
B-lymfocytech → příznaky žádné, přes angínu
s lymfadenitidu (infekční mononukleóza),
až po postižení jater
● souvislost s určitými typy tumorů
● diagnostika: Paul-Bunnellova reakce – důkaz tzv.
heterofilní protilátek shlukujících beraní krvinky, nebo
průkaz specifických protilátek proti různým virovým
antigenům (hlavně EBNA a VCA)
● léčba: obvykle symptomatická
80/125
Protilátky anti-VCA a anti-EBNA
● virový kapsidový antigen (VCA)
– anti-VCA IgM se objevují časně při EBV infekci
a zpravidla mizí během 4 až 6 týdnů
– anti-VCA IgG se objevují v časné fázi EBV infekce,
vrcholí během 2 až 4 týdnů po začátku nemoci,
pomalu klesají, a pak přetrvávají během zbytku
pacientova života
● EBV nukleární antigen (EBNA)
– protilátky proti EBNA se pomalu objevují 2 až
4 měsíce po začátku příznaků a perzistují po zbytek
pacientova života
81/125
Infekční mononukleóza
82/125
Lidský herpesvirus 8 (HHV 8)
● obsahuje neobvykle velké množství genů, pocházejících
z hostitelské buňky
● souvisí s onkogenitou
● primární infekce může připomínat infekční
mononukleózu, ale bez heterofilních protilátek
● souvisí s Kaposiho sarkomem (tvorba lézí na těle),
zvláštním typem nádoru u pacientů s AIDS
● diagnostika je zatím spíše experimentální
83/125
Přímé vs. nepřímé metody
přímé
● hledáme mikroba, jeho
část či jeho produkt
(produktem může být
například nějaký bakteriální
antigen či jed – toxin)
● agens je přítomno nyní
nepřímé
● hledáme protilátky
● protilátka není součástí ani
produktem mikroba
(produkt makroorganismu,
odezvou na činnost mikroba)
● agens bylo přítomno někdy
v minulosti
84/125
Přehled metod
● přímé metody
– mikroskopie – elektronová (morfologie virionů),
optická (buněčné kultury, CPE, inkluze)
– kultivace, izolace – buněčné a tkáňové kultury
– biochemické metody – u virů se nepoužívají
– průkaz antigenu (pomocí protilátky)
– pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity)
– průkaz nukleové kyseliny
● nepřímé metody
– základ diagnostiky virů – KFR, HIT, VNT, ELISA
85/125
Mikroskopie
● elektronová mikroskopie:
– pozorování většiny virů
– nákladná a není vždy dostupná → nepoužívá se
k rutinní diagnostice, ale k výzkumným účelům
● optická mikroskopie:
– pozorování cytopatických efektů in vitro
– pozrování buněčných inkluzí in vivo (Negriho
tělíska u vztekliny) – spíše v rámci histologie
– možné pozorování velkých virů (> 0,2 μm, např.
poxviry) – výjimečně, pro praxi se nehodí
86/125
Izolace a kultivace virů
● zvíře se používá dnes již méně často (sající myšata)
● kuřecí zárodek (asi 10 dnů staré embryo):
– pod skořápkou papírová blanka (uzavírá
vzduchovou bublinu)
– na papírovou blanku nasedá
chorioalantoidní
membrána, která
ohraničuje allantoidní
dutinu
– v allantois se vznáší
amniová dutina
s vlastním embryem
– žloutkový vak
87/125
Izolace a kultivace virů (2)
● směry očkování do jednotlivých struktur
88/125
Izolace a kultivace virů (3)
● směry očkování do jednotlivých struktur
89/125
Izolace a kultivace virů (4)
● amniová dutina – obklopující zárodek,používá se
často, např. u virů chřipky
● allantois (odpadní váček) poskytuje větší objem
tekutiny, ale je méně výživný (hodí se pro viry, které
byly předtím pěstovány v amniu a adaptovaly se;
využívá se při výrobě chřipkové vakcíny)
● žloutkový vak – kultivace chlamydií a rickettsií
(používají se sedmidenní embrya → vak je větší)
● chorioalantoidní membrána – pěstování zejména
poxvirů a herpesvirů
90/125
Izolace a kultivace virů (5)
● výsledek není na kuřecích zárodcích vidět
– výjimka chorioalantoidní membrána – poky
(bělavá ložiska)
– využíváme schopnosti většiny virů aglutinovat
erytrocyty → Hirstův test
● buněčné kultury:
– „nesmrtelné“ zvířecí či lidské buňky – embryonální,
nádorové
– HeLa (nádor cervixu), Vero (opičí ledviny), HEL
(Human Embryonic Lung)
– některé viry způsobují cytopatický efekt (CPE)
91/125
Cytopatický efekt
● morfologicky patrné důsledky infekce buňky
virem (ne všechny viry způsobí CPE!)
● následek narušení metabolismu a s ním
spojených životních funkcí buněk
● projevy:
– změny cytoskeletu:
● zakulacení buněk
● odlupování od podkladu
– v důsledku změny obsahu vody a přesunu iontů:
● vakuolizace cytoplazmy
● svraštění buněk
92/125
Cytopatický efekt (2)
● total destruction:
– úplná destrukce buněk monolayeru, zhuštění
buněk (kondenzace chromatinu)
– enteroviry (poliovirus, rhinoviry, coxsackie viry,
echoviry)
● subtotal destruction:
– částečná destrukce buněk monolayeru (nejsou
zasaženy všechny buňky)
– togaviry, pikornaviry, paramyxoviry
93/125
Cytopatický efekt (3)
94/125
Cytopatický efekt (4)
● focal degeneration:
– místo generalizované infekce monolayeru → virus
produkuje lokalizovaná ohniska
– infekce probíhá šířením viru z buňky do buňky
(ne difúzí z média)
– buňky zvětšené, zakulacené, refraktilní
– herpesviry, poxviry
95/125
Cytopatický efekt (5)
96/125
Cytopatický efekt (6)
● swelling and clumping:
– infikované buňky se zvětšují a postupně shlukují do
střapcovitých (hroznovitých) útvarů, nakonec se
odloučí od podkladu
– adenoviry
97/125
Cytopatický efekt (7)
● foamy degeneration (vaculalization)
– produkce velkých a
početných vakuol
v cytoplazmě
infikovaných buněk
– těžko pozorovatelné
bez barvení
– retroviry, paramyxoviry,
flaviviry
98/125
Cytopatický efekt (8)
● cell fusion (syncytium formation/polykaryon formation)
– fúze plazmatických membrán čtyř a více buněk
– produkce jedné velké buňky se čtyřmi a více jádry
(lépe pozorovatelné po obarvení)
– paramyxoviry, herpesviry
99/125
Cytopatický efekt (9)
● inclusion bodies:
– obvykle místa syntézy virových proteinů nebo
replikace virového genomu nebo místa vzniklá po
působení viru
– liší se dle infikujícího viru (různý počet, velikost a
tvar, v jádře/cytoplazmě, eosinofilní/bazofilní)
– pozorovatelné po obarvení (Giemsa: lze vidět fúzi
buněk, vakuolizaci cytoplazmy, inkluze)
100/12
Cytopatický efekt (10)
● inclusion bodies
101/12
Průkaz viru
● výsledek izolace viru většinou není vidět (výjimky
CPE, poky)
● Hirstův test (test hemaglutinace)
– využíváme schopnosti viru shlukovat erytrocyty
– amniová tekutina s pomnoženým virem
aglutinuje krvinky → průkaz přítomnosti viru
– přítomnost specifického viru provedeme přidáním
protilátek proti hledanému viru → v pozitivním
případě inhibujeme aglutinaci = HIT
● hemadsorpce na buněčných kulturách (chřipka)
– i zdánlivě nezměněné buňky, v nichž se pomnožil
virus, adsorbují na svůj povrch erytrocyty
102/12
Průkaz viru chřipky
● diagnostika má epidemiologický význam (důkaz, že
epidemii působí opravdu chřipka)
● přímý průkaz (výplach z nosohltanu nebo výtěr do
speciálního transportního média)
– průkazem virového antigenu
– izolace v amniové dutině (virus se pak prokazuje
Hirstovým testem)
– izolace na buňkách opičích ledvin
– průkaz virové RNA pomocí PCR
● nepřímý průkaz:
– klasické serologické metody – párová séra, KFR, HIT
– ELISA – IgM, IgA
103/12
Úkol 1: Stanovení hemaglutinační
jednotky viru chřipky v amniové
tekutině (Hirstův test)
● do 8 důlků v destičce napipetujte po 25 µl
fyziologického roztoku
● 1. důlek slouží jako kontrola erytrocytů
● do 2. důlku přidejte 25 µl amniové tekutiny,
promíchejte a 25 µl přeneste do třetího důlku
● pokračujte v geometrickém ředění do 1:128,
přebývajících 25 µl z posledního důlku odpipetujte do
dezinfekčního roztoku
● do všech důlků přidejte 25 µl suspenze kuřecích
erytrocytů
● reakci odečtěte po 90 minutách při lab. teplotě
104/12
Úkol 1: Vyhodnocení
● vyhodnoťte virové shlukování erytrocytů
● zakreslete výsledky a zapište jaké ředění odpovídá
jedné hemaglutinační jednotce (1 HU)
105/12
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku
● ovoskop = prosvětlovač vajec
106/12
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku (2)
● očkování do amnia
107/12
Úkol 2: Izolace virů na kuřecím
zárodku (3)
● vejce položte naležato, prosviťte v ovoskopu a naznačte
tužkou okraj vzduchové bubliny (širší konec)
● odřízněte skořápku nad vzduchovou bublinou
● na papírovou blanku kápněte alkohol
● vejce opět prosviťte v ovoskopu a vyznačte pozici
zárodku, resp. jeho oka
● jehlou se snažte trefit do oka kuřecího zárodku –
buď přímo v ovoskopu, nebo případně mimo něj
● aplikujte inkoust (atrament)
● zvětšete si otvor ve vejci pomocí pinzety, poté vejce
vyklopte do Petriho misky a sledujte výsledek
108/12
Úkol 3: Hodnocení buněčných
kultur
● buněčná kultura bez a s CPE
http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/c
ellculture.php?menuID_=122
www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html
109/12
Úkol 4: Diagnostika parotitidy
reakcí ELISA
● vyhodnoťte reakci ELISA ve třídách protilátek IgG a IgM,
interpretujte
110/12
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz
● vyhodnoťte KFR
● na destičce je vyšetřena dvojice sér jediného
pacienta s atypickou pneumonií
● POZ = sedimentace erytrocytů
● NEG = hemolýza
● za signifikantní považujte čtyřnásobný vzestup
titru
111/12
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz (2)
● Řádek 1 – Chřipka A I 1 : 4
● Řádek 2 – Chřipka A II 1 : 4
● Řádek 3 – Chřipka B I – žádný titr
● Řádek 4 – Chřipka B II – žádný titr
● Řádek 5 – Parachřipka I – žádný titr
● Řádek 6 – Parachřipka II – žádný titr
● Řádek 7 – RS virus I 1 : 4
● Řádek 8 – RS virus II 1 : 8
● Řádek 9 – Adenovirus I – žádný titr
● Řádek 10 – Adenovirus II – žádný titr
● Řádek 11 – Mycoplasma pneumoniae I 1 : 8
● Řádek 12 – Mycoplasma pneumoniae II 1 : 128
112/12
Úkol 5: Stanovení KFR protilátek
proti nejčastějším původcům
respiračních nákaz (3)
● závěry:
– Mycoplasma pneumoniae je pravděpodobným
původcem onemocnění
– doporučena ATB léčba (např. doxycyklinem)
– pacient se již za života setkal s chřipkou A a RS
virem (respirační synciciální virus, pneumovirus)
– pacient se nikdy nesetkal s ostatními testovanými
viry
113/12
Úkol 6: Zjištění titru protilátek
proti viru klíšťové encefalitidy
pomocí HIT
● vyhodnoťte HIT
● na destičce jsou vyšetřena párová séra čtyř pacientů
● POZ = sedimentace erytrocytů
● NEG = hemaglutinace
● za signifikantní považujte čtyřnásobný vzestup titru
● ředění v prvním sloupci je 1:5
● zkontrolujte kontrolu antigenu a erytrocytů v dolních
rozích destičky
114/12
Úkol 6: Zjištění titru protilátek
proti viru klíšťové encefalitidy
pomocí HIT
● závěry:
– jeden pacient se s klíšťovou encefalitidou vůbec
nesetkal
– dva ji prodělali (třeba i bez příznaků/možné
očkovaní
– jeden je pravděpodobně ve fázi akutního
onemocnění (16× vzestup titru)
115/12
Úkol 11: Diagnostika HAV
● úkol 11a stanovujeme anti-HAV IgM
● úkol 11b stanovujeme celkové protilátky anti-HAV
(IgM + IgG + ostatní)
● výpočet cut off:
– průměr „c. o.“ důlků C1 a D1 = cut off
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
● stanovení IgM + celkových protilátek je alternativou ke
stanovení IgM a IgG
116/12
Úkol 12: Diagnostika HBV
● úkol 12a + b: stanovení HBsAg a HBeAg
● úkol 12c + d: stanovení anti-HBs a anti-HBe
● výpočet cut off: průměr C1 a D1
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
● HBsAg (přítomnost viru v organismu v jakémkoli období
infekce
● HBeAg (vylučována pouze během replikace viru)
● anti-HBs (po prodělané infekci nebo očkovaní)
● anti-HBe (po prodělané infekci)
117/12
Úkol 13: Diagnostika HCV
● úkol 13a: PCR, elektroforéza
● úkol 13b: průkaz anti-HCV metodou ELISA
● výpočet cut off: průměr negativních kontrol (důlku B1,
C1 a D1) + 0,050
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční)
118/12
Dodatečné indicie k úkolu č. 14
● Pacient C – ikterický stav trvá několik týdnů, přetím
potíže neměl
● Pacient D – ikterický stav již přetrvává několik let, ale
neřešil to
● Pacient E – ultrazvuk ukazuje přítomnost útvarů v oblasti
žlučníku. Urobilinogen negativní, stolice acholická
● Pacient G – z anamnézy: před deseti dny byl v kontaktu
s kamarádem, u kterého se později potvrdila virová
hepatitida A
● Pacient H – u pacienta snížená sérová hladina
ceruloplasminu a zvýšené vylučování mědi močí.
Přítomna též anémie a neurologické projevy
119/12
a-HAV
IgM
a-HAV
TOTAL
HBsAg HBeAg a-HBs a-HBe HCV
PCR
a-HCV
A + + – – – – – –
B – – – – – – + +
C – – + + – – – –
D – + + – – +/– – –
E – + – – – – – –
F – – – – + + – –
G – – – – – – – –
H – – – – – – – –
Úkol č. 14 – souhrn výsledků
120/12
Úkol č. 14 – závěr k pacientům
● A: akutní hepatitida A
● B: akutní hepatitida C
● C: akutní hepatitida B
● D: chronická (neaktivní) hepatitida B; v dětství prodělal
VHA (nebo je očkován)
● E: současný ikterus zřejmě způsobily kameny; také on
kdysi asi prodělal VHA (nebo je očkován)
● F: původ současné žloutenky nejasný, nutno vyšetřovat
dále; prodělal VHB, vyléčen
● G: příliš čerstvá hepatitida A, ještě nemá vytvořeny
protilátky
● H: Wilsonova choroba (nejde o infekci) 121/12
Úkol 15: Vyšetření protilátek antiHIV
metodou ELISA
● výpočet cut off:
– průměr „c. o.“ důlků C1 a D1 = cut off
– hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní
– hodnoty 90 % cut off a méně = negativní
– hodnoty 90–110 % cut off = hraniční
● pozitivní či hraniční séra je třeba konfirmovat (zaslat do
NRL v Praze k ověření)
● v ČR registrujeme více než 2500 HIV pacientů
122/12
Úkol 16: Diagnostika virů čeledi
Herpesviridae
● vyplněno za vás
● tvorba tzv. poků – viditelných struktur na
chorioalantoidní membráně
123/12
Úkol 17: Praktická diagnostika
infekční mononukleózy
● zhodnoťte výsledky daných pacientů proti EB-virovým
antigenům a vyplňte následující tabulky s výsledky
● VCA – virový kapsidový antigen – u čerstvých infekcí
jsou typické protilátky IgM a nízkoavidní IgG
● EBNA – Epstein-Barr (virový) nukleární antigen – nejsou
přítomny u čerstvých infekcí, většinou jsou přítomny
u latence a reaktivace
● interpretujte podle tabulky v protokolu
124/12
Po tomto cvičení byste měli umět
● klasifikovat viry na základě jejich NK a obalů, stručně
popsat replikaci virů
● popsat agens způsobující atypické pneumonie, včetně
diagnostických možností
● popsat viry spalniček, příušnic a zarděnek
● popsat viry hepatitid, virus HIV a herpetické viry včetně
možných zdrojů nákazy
● popsat metody očkování do jednotlivých částí kuřecího
zárodku
● rozeznat buněčné kultury s přítomností CPE
● správně posoudit výsledky různých laboratorních
vyšetření
125/12