P13
Klinická mikrobiologie IV
Infekce ran a krevního
řečiště, biofilm na cévních
katetrech
Bi7170c (podzim 2018)
Osnova
● infekce ran + úkoly
● infekce krevního řečiště + úkoly
● průkaz mikrobů kolonizující cévní katetry +
úkoly
● udělení zápočtů
2/45
Infekce ran
● nesourodá skupina (různý původ a lokalizace)
● závažné případy (mikroby pronikly přes tělní povrch na
místa normálně sterilní)
● hnisavé infekce ran:
– bakteriální infekce rány doprovázena infiltrací
polymorfonukleárních granulocytů (odpovědi IS)
– hnis = tekutina obsahující odumřelé leukocyty,
bakterie (živé i mrtvé), rozkládající se tkáň, aj.
● hnisavá povrchová zranění (S. aureus,
β-hemolytické streptokoky)
● těžká poranění (hrozí klostridiové anaerobní infekce,
tetanus)
3/45
Infekce ran (2)
● infekce operační rány:
– SSI – surgical site infection – „infekce v místě
chirurgického výkonu“
– S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes
– kolorektální chirurgie: Enterobacteriaceae,
ananeroby (B. fragilis, porfyromonády, prevotely,
peptostreptokoky)
– vzrůstá zastoupení C. albicans
– prevence a léčba jedním z důležitých témat pro
chirurgy
4/45
Infekce ran (3)
● poranění ve vodě:
– sladká voda: pseudomonády, aeromonády
– slaná voda: halofilní vibria, atypické mykobakterie
● popáleniny: velmi snadná infekce (P. aeruginosa,
S. aureus, S. pyogenes, aj.)
● infekce po pokousání:
– člověkem: příslušníci normální ústní mikroflóry
(aerobní i anaerobní) a S. aureus
– zvířetem: psi a kočky (nejčastěji stafylokoky a
pasteurely), počítat s možností přenosu vztekliny
5/45
Úkol 1: vzorky u infekcí ran
● odebírající lékař (sestra) musí vždy pečlivě vyplnit
žádanku, nestačí „stěr z rány“
● nutno specifikovat:
– typ (původ) rány – operační rána, rána po
pokousání, bodná rána apod.
– lokalizaci rány na těle
– důležité anamnestické údaje (návrat ze zahraničí,
práce v zemědělství)
– případně i požadovaná speciální vyšetření
6/45
Úkol 1: vzorky u infekcí ran (2)
● hluboké ložiskové infekce:
– hnis či jiná tekutina v ložisku v dostatečném
množství (výpotek, obsah cysty apod.) má přednost
před stěrem
– u podezření na anaerobních infekci (zejména hnis
z dutiny břišní) zaslání ve stříkačce (uzavření
stříkačky tzv. kombi zátku (na obrázku)
– nezasílat stříkačky s jehlou zabodnutou do sterilní
gumové zátky (dřívější doporučení, opuštěno z
bezpečnostních důvodů)
7/45
Úkol 1: vzorky u infekcí ran (3)
● hluboké ložiskové infekce:
– není-li možno poslat tekutinu (je nedostatek
tekutiny), bezpodmínečně nutné použití soupravy
s transportní půdou
– v poslední době tzv. E-swaby
– v některých případech je také vhodný nátěr,
případně otisk tkáně na sklíčko (zachytí se i
patogeny, které se nepodařilo vypěstovat)
– v zvláště závažných případech může chirurg přizvat
mikrobiologa i přímo na operační sál
8/45
E-swab (1)
● sterilní a obsahuje dvě části:
– polypropylénovou šroubovací zkumavku
s kapalným Amiesovým transportním médiem
– tampon pro vlastní odběr vzorku
● tampon zakončen nástřikem měkkých nylonových
vláken
● vyráběn technologií nástřiku rovnoběžně orientovaných
nylonových vláken v elektrostatickém poli (není to
námotek jako u klasických souprav)
● mikroorganismy jsou při odběru aktivně zachyceny
elektrostatickými silami (u klasického odběru jen
pasivně ulpívají v námotku)
9/45
E-swab (2)
● obsahuje tekuté Amiesovo médium bez aktivního uhlí
● lze použít i na PCR (neobsahuje nic, co by mohlo
inhibovat amplifikaci)
10/45
Odběry u povrchových ran
● klasická metoda: stěr odběrovou soupravou
s transportní půdou (kvalitativní)
– odebírat tak, aby byl zachycen předpokládaný
patogen (je potřeba se dostat až k ložisku infekce)
– nekontaminovat vzorek okolní mikroflórou, zejména z
kůže
● otisková metoda:
– na ránu plošného charakteru (např. diabetický vřed)
přiložit čtvereček sterilní gázy
– přenést na kultivační půdu (krevní agar)
– v laboratoři se přenese i na další půdy
– semikvantitativní vyhodnocení (počet/plocha)
11/45
Úkol 2: Otisk – provedení
● chirurg obdrží sterilní kultivační půdu a čtvereček o
rozměrech 25 cm2
12/45
Úkol 2: Otisk – provedení (2)
● chirurg nebo sestra přemístí čtvereček do rány tak, aby
se všude dotýkal (ponechá ho tak 10 sekund až minutu)
13/45
Úkol 2: Otisk – provedení (3)
● čtvereček se přemístí zpět na půdu
14/45
Úkol 2: Otisk – vyhodnocení
● v laboratoři je filtrační papír s otiskem umístěn na dvě
nebo tři další kultivační půdy
● vyhodnocení po 24 hodinách
● určují se mikroby (zejména s využitím média URI)
● kromě identifikace kolonií také kvantifikace (počet
CFU/25 cm2)
15/45
Diagnostika infekcí ran
● výtěry:
– v ráně není žádná „běžná flóra“
– využíváme větší množství půd (odhalení širší škály
patogenů)
● KA, ENDO, KA s NaCl (stafylokoky), KA s
amikacinem (streptokoky a enterokoky)
● pomnožovací tekuté půdy (v ráně může být jen
menší množství mikrobů)
● tekuté vzorky:
– mikroskopie (mikroby, množství leukocytů apod.)
– pomnožovací tekuté půdy, selektivní půdy
16/45
Výtěr z rány: diagnostické schéma
● podle okolností se může v praxi lišit
● Den 0: pouze nasazení kultivací
● Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, Endo, KA
s 10 % NaCl a KA s amikacinem
– v případě negativity všech pevných půd se prohlíží
bujón (je-li zakalený, vyočkuje se, tzv. subkultivace)
● Den 2: expedice všech negativních a mnohých
pozitivních výsledků – pro komplikace, rezistence apod.
zdaleka ne všech
● Den 3: expedice dalších pozitivních výsledků
17/45
Výtěr z rány: interpretace
● běžná flóra: žádná není (vše se považuje za možného
patogena)
● patogena je v podstatě jakákoli bakterie nebo
kvasinka (výjimka koagulázanegativní stafylokoky a
korynebakteria u povrchových kožních ran)
● kolonizace: u povrchových ran může jít o kolonizaci
(hlavně pseudomonáda a proteus)
– kritická kolonizace: rána, která se nehojí z
důvodu mikrobiálního množení, zároveň však bez
napadení tkáně nebo zjevné imunitní odpovědi
pacienta
● laboratoř testuje citlivost na ATB všech nálezů
18/45
Léčba hnisavých infekcí
● vždy lokální ošetřování rány (lokální aplikace
různých preparátů, pravidelné čištění a převazování,
podpora hojení, odstraňování nekróz – možností je zde
i larvoterapie)
● nepředpokládáme-li anaeroby, je nejvhodnější naslepo
k celkové léčbě oxacilin (klasické protistafylokokové
antibiotikum)
● pravděpodobný streptokokový původce, lékem volby
klasický penicilin ve vysokých dávkách
● u nemocničních nákaz nutná cílená léčba
19/45
Úkol 3: Vyhodnocení kultivace z
hlubší rány
● vyhodnoťte výsledky kultivace, vezměte v potaz
anamnézu
● oxidázový test bude na bočním stole
20/45
Přítomnost mikrobů v krvi
● přítomnost bakterií v krvi za normálních okolností
přechodná (transientní bakteriémie např. při čištění
zubů)
● infekce krevního řečiště (IKŘ) zpravidla pro bakteriální,
případně mykotické (kvasinkové) infekce
● bakteriémie: přítomnost bakterií v krvi (bez
dalšího hodnocení klinického významu)
● virémie (přítomnost virů v krvi): součástí různých
virových onemocnění (zejména hepatitidy a HIV)
● krevní paraziti: malarická plasmodia, trypanosomy
a filárie (vlasovci)
21/45
Bakteriální infekce krevního řečiště
● bakteriémie jako spouštěcí mechanismus sepse
● produkty mikroorganismů interagují s IS → SIRS
● SIRS (syndrom systémové zánětlivé odpovědi)
– zánětlivá odpověď organismu na infekční nebo
neinfekční podnět
● sepse = SIRS + infekce
– primární (tyfus)
– sekundární (katetrové, urosepse, abdominální sepse)
– subaktutní bakteriální endokarditidy (sepsis lenta)
22/45
Diagnostika sepse
● komplexní vyšetření:
– biochemická: zánětlivé ukazatele (CRP,
prokalcitonin, diferenciální krevní obraz) známky
diseminované intravaskulární koagulopatie
(trombocytopenie, snížení antitrombinu III, apod.)
– fyzikální: RTG srdce a plic, ORL vyšetření, jícnový
ultrazvuk (pro ložiska na srdci), CT
– neurologické
– mikrobiologické
● hemokultury další mikrobiologický materiál
(katetry, moč, sputum, lumbální punkce, atp.)
23/45
Hemokultura – odběr krve
● hemokultura = kultivační vyšetření krve na přítomnost
bakterií (kvasinek)
● nesrážlivá (!) krev (prokazujeme živé mikroby, nikoliv
antigeny nebo protilátky jako v sérologii)
● odběr do speciálních lahviček s transportně-kultivačním
médiem pro automatickou kultivaci
● nutno zabezpečit tak, aby se minimalizovalo riziko
pseudobakteriémie (falešně pozitivní výsledek)
● u dospělých se odebírá 20 až 30 ml krve, u dětí
zpravidla 1–5 ml podle věku (odběr náročnější než u
dospělých, u dětí má význam i méně bakterií)
● nutné vyznačit čas a místo odběru (!)
24/45
Úkol 4: druhy hemokultivačních
nádobek
● různé typy podle toho, které mikroby mají být
především zachyceny (aerobní, anaerobní, kvasinky)
● některé nádobky s aktivním uhlím (určeny zejména ke
kultivaci krve pacientů, kterým jsou již nasazena ATB),
aby se snížilo procento falešně negativních výsledků
(ATB by potlačilo růst)
● nejběžnější nádobky:
– aerobní standardní
– aerobní s aktivním uhlím
– anaerobní s aktivním uhlím
● nutné vyznačit čas a místo odběru (!)
25/45
Příklady nádobek na hemokultivaci
26/45
BACTECBacT/ALERT
Automatické kultivátory
● kultivátor napojený na počítač
● automatický udržuje optimální podmínky
kultivace
● vyhodnocuje stav nádobky a indikuje případný růst
(např. změna reflektance, tj. optických vlastností
lahvičky)
● růst je zvukově a opticky signalizován
● pokud ani po týdnu nic neroste, signalizuje negativní
výsledek
27/45
Automat na hemokultury
28/45foto: O. Z.
Automat na hemokultury (2)
29/45foto: O. Z.
Princip automatického kultivátoru
BACTEC
30/45
Pseudobakteriémie – příčiny
● pseudobakteriémie = falešně pozitivní výsledek
● nevhodně provedený odběr (nedodržení zásad
asepse)
● odběr pouze ze zavedených vstupů (záchyt bakterií
kolonizujících příslušný vstup – nemusí být skutečným
původcem bakteriémie)
● důsledek: pacient je zbytečně léčen pro neexistující
infekci nebo pro infekci jiným druhem mikroba →
zastaveno hledání skutečného patogenu
31/45
Kontaminace katetrů a implantátů
● při podezření na kontaminovaný cévní katetr se mění
● starý katetr poslat bakteriologii
● existují metody schopné odhadnout, zda jde o
skutečné osídlení katetru či náhodný nález
● platí pro jakékoli implantáty, které se vyjímají z těla
– jejich mikrobiologické vyšetření může přinést
podstatnou informaci pro další léčbu
32/45
Pseudobakteriémie – protiopatření
● odebírat cíleně, když je přítomnost bakterií v krvi
pravděpodobná (neodebírat, když je indikováno jiné
vyšetření)
● odebírat v dostatečné kvantitě: jedna hemokultura
nemá dg. význam, dvě mají malý význam, tři jsou
optimum
● odebírat z vhodných míst: nejméně jednu z nové
venepunkce (ideálně tři venepunkce a odběr z žilního
katetru)
● odebírat ve vhodnou chvíli, u septických stavů typicky
při vzestupu teploty
● asepse + správná nádobka + správně vyplněná
průvodka (čas a místo odběru)
33/45
Rozpoznání pseudobakteriémie
● typické znaky pseudobakteriemie (falešná pozitivita
hemokultury)
– pozitivní jen některé ze tří hemokultur
– pozitivní všechny, ale z každé vyroste jiný kmen
(různý vzhled kolonií na půdách, různá ATB citlivost)
za různě dlouhou dobu (odpovídá různé kvantitě;
normální rozmezí do 5–6 hodin)
– klinické potíže pacienta neodpovídají nálezu
– stejný kmen se najde i na kůži pacienta
34/45
Posouzení času pozitivity
● TTD = time to detection (čas do pozitivity)
● čas od odběru do okamžiku, kdy automat hlásí pozitivitu
● kratší v případě masivní přítomnosti bakterií v krvi
a delší tehdy, když je bakterií málo
● u skutečných bakteriémií je čas většinou kratší
(do 48 hodin) a u všech odebraných hemokultur
přibližně stejný
● může být kratší u hemokultury z místa, které je zdrojem
infekce (například hemokultura z CVK, když tento CVK
je zdrojem katetrové sepse)
● nelze vyhodnotit bez času a místa odběru (!)
35/45
Pozitivní hemokultura
● lahvička vyjmuta z přístroje
● nutno zaevidovat čas, resp. dobu od příjmu do
pozitivity (čím delší doba, tím pravděpodobnější je
kontaminace)
● vyočkování na pevné půdy a nátěr na sklo barvený
Gramem
● orientační diskový test citlivosti na ATB podle
výsledků Gramova barvení (místo standardní suspenze
se použije přímo tekutina z lahvičky → pouze orientační
výsledky)
● další den vyšetření citlivosti na ATB kvantitativní
metodou (mikrodiluční test, už máme standardní
inokulum)
36/45
Úkol 5, 6 a 7: Hemokultury
● úkolu 5: prohlédněte si výsledek hemokultury
v mikroskopu, popište bakterie (G+, G-, koky, tyčinky,
popsat jejich uspořádání)
● úkolu 6: popište výsledky kultivačních testů,
vyhodnoťte výsledky předběžného testu na ATB
(kvantitativní testování citlivosti na ATB mikrodiluční
metodou nebudeme ve cvičení provádět)
● úkol 7: pokuste se vhodně interpretovat vzorky
hemokultur (soustřeďte se nejen na nalezený patogen,
ale i na TTD a místo, kde byla krev odebrána)
37/45
Úkol 7: Interpretace nálezů
● Jan Bílý:
– odebraly se tři hemokultury, všechny jsou pozitivní,
všechny po zhruba stejném čase po odběru
(10/13/13,5 h), kmeny vypadají podobně, je
pravděpodobné, že nález je skutečným patogenem
– vzorek krve s kratším časem (10 h) byl odebrán
z centrálního žilního katetru – to by nás mohlo vést
k domněnce, že právě tento katetr je zdrojem infekce
38/45
Úkol 7: Interpretace nálezů (2)
● Jakub Černý:
– odebraly se tři hemokultury, všechny jsou pozitivní,
avšak jedna po 8 hodinách, druhá po 26 hodinách
a třetí po 38 hodinách
– kmeny jsou fenotypově odlišné (včetně různých
antibiogramů), dokonce patří k různým druhům
stafylokoka, je velmi pravděpodobné, že jde o kožní
kontaminanty
39/45
Průkaz mikrobů kolonizujících
katetry
● kvalitativní pomnožení v bujonu:
– citlivé (prakticky 100%), ale nelze rozlišit
kolonizaci od kontaminace (proto se metoda
nedoporučuje)
– negativní výsledek vylučuje kontaminaci
● semikvantitativní metoda (Makiho metoda):
– katetr je válen po povrchu agaru sterilní pinzetou
– pro krátce zavedené katetry (vnější kolonizace)
– pro déle zavedené katetry není vhodná (kolonizovány
zevnitř → falešně negativní výsledky)
– kolonizace při >15 koloniích
40/45
Průkaz mikrobů kolonizujících
katetry (2)
● sonifikační metoda:
– katetry sonifikovány v ultrazvukové vaně
– uvolněné bakterie kvantifikovány vyočkováním na
KA, zjišťuje se počet CFU
– hranice pozitivity: >100 (1000) CFU
41/45
Úkol 8: průkaz mikrobů
kolonizujících katetry
● porovnejte jednotlivé metody a rozhodněte o možné
kolonizaci katetru
● kvalitativní metoda
● semikvantitativní metoda ( >15 CFU)
● sonifikace katetru (>100 CFU)
42/45
Eradikace biofilmů, citlivost k ATB
● ATB léčba často potlačí pouze symptomy infekce
způsobené buňkami uvolněnými z matrix biofilmu
● buňky uložené v matrix biofilmu není schopna
zasáhnout
● k eradikaci biofilmu je možno využít vysokých
koncentrací ATB či jejich kombinací (např. ATB zátka
katétru), pokud léčba selhává, je nutno vyjmout ložisko
biofilmu
● hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro
daná antibiotika (tzn. bakterie jsou k nim rezistentní)
● hodnoty MBEC zpravidla několikanásobně vyšší
než MIC
43/45
PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN
Kontrola
růstu
Úkol 9: Citlivost biofilmpozitivních
mikrobů k ATB
● zákal/žluté důlky
znamenají růst mikrobů
● odečtěte hodnoty MIC
(planktonická forma) a
MBEC (biofilm)
● porovnejte hodnoty
mezi sebou
44/45
Po tomto cvičení byste měli umět:
● vysvětlit diagnostické postupy infekcí ran a krevního
řečiště, vč. správného odběru materiálu
● vysvětlit postup při kultivaci hemokultur, vysvětlit
detailně pojem pseudobakteriémie
● popsat možnosti zpracování kolonizovaného katetru
● porovnat hodnoty MIC a MBEC pro planktonickou formu
bakterií resp. pro biofilm, vysvětlit důsledky pro léčbu
45/45