P02
Diagnostika streptokoků
Bi7170c (podzim 2019)
Osnova
● rod Streptococcus
● dg. rodu Streptococcus
● úkoly
2/36
Rod Streptococcus
● G+ koky, KAT-, OXI●
dvojice, řetízky
● nepohyblivé
● kultivace na KA
● rozdělení dle hemolýzy (α – viridující, β – hemolitické,
γ – nehemolytické)
● dělení dle Lancefieldové: antigenní skupiny, nejčastěji
A, B, C, E, F, G, H, ...
(skup. D – dnes enterokoky, S. bovis)
3/36
Přehled streptokoků
Změny na KA
α-hemolýza
(viridace)
Streptococcus pneumoniae
skupina „ústních streptokoků“
β-hemolýza Streptococcus pyogenes (sk. A dle
Lancefieldové)
Streptococcus agalactiae (sk. B dle
Lancefieldové)
skupina „non-A-non-B“ streptokoků
γ-hemolýza
(žádná)
streptokoky bez hemolýzy
4/36
Streptococcus pyogenes
● streptos = ohebný, zkroucený jako řetěz; puon = hnis;
gennao = tvořit
● group A streptococcus (GAS)
● úplná β-hemolýza,
drobné kolonie
● PYR test, bacitracinový test
● původce akutní tonsilitidy (angíny), hnisavých
zánětů měkkých tkání (nekrotizující fasciitis),
spály, erysipelu (tzv. růže) a flegmón
(neohraničených bakteriálních zánětů), pneumonií,
meningitid, sepsí;
● pozdní následky (revmatická horečka, akutní
glomerulonefritida) - ASLO 5/36
Akutní tonsilitida (angína)
● nejčastější bakteriální původce S. pyogenes
● další původci: S. pneumoniae, staphylokoky, hemofily,
influenza virus, herpes viry, coxsackie viry, EBV, ...
● horečka, oboustranná bolest v krku, zduřené uzliny
6/36
Spála (scarlatina)
● angína s exantémem a projevy na sliznici (petechie)
● streptokok produkuje pyrogenní (erytrogenní) toxin
7/36
Erysipel (růže)
● ostře ohraničený zánět, nejčastěji v oblasti bérců a
obličeji
● infekce kůže se šíří do kožních lymfatických cév, při
opakovaném poškození chronické lymfatické otoky
8/36
Streptococcus agalactiae
● agalactia = porucha tvorby mléka (záněty mléčné žlázy
především u krav)
● group B streptococcus (GBS)
● neúplná β-hemolýza, větší kolonie
● pozitivní CAMP test
● původce močových infekcí (u žen
v urogenitálním traktu a GIT)
● infekce novorozenců (sepse, pneumonie,
meningitidy)
● infekce gravidních žen
9/36
„non-A-non-B“ streptokoky
● β-hemolýza, ale nepatří ani do GAS (S. pyogenes) ani
do GBS (S. agalactiae)
● faryngitidy (záněty hltanu), často přítomny bez
klinických projevů
● S. dysgalactiae, S. equi
● obyčejně se neurčují, v případě potřeby se blíže
identifikují průkazem antigenu
10/36
Streptococcus pneumoniae
● „pneumokok“, dříve Diplococcus pneumoniae
● dvoří dvojice (nikoli řetízky), lancetovitý (kopíčkovitý)
tvar buněk
● α-hemolýza
● opouzdřené buňky mají hlenovité kolonie (kapky oleje)
● v R-fázi netvoří pouzdro
● v malém množství i u zdravých osob
● sinusitidy, pneumonie, otitis media, meningitidy,
sepse, endokarditidy
● nepovinné očkování (Pneumo23, Prevenar13, Synflorix)
11/36
Streptococcus pneumoniae (2)
12/36
„Ústní streptokoky“
● též alfa streptokoky nebo viridující streptokoky (obvykle
α-hemolytické streptokoky, kromě pneumokoka)
● normální součástí mikroflóry ústní dutiny a částečně i
faryngu
● fyziologicky se neustále dostávají v malém množství do
krve (ve velkém množství způsobují subakutní
bakteriální endokarditidy - adherují na poškozené
srdeční chlopně)
● útvar na chlopni = „vegetace“ - forma biofilmu (matrix
tvoří krevní destičky a fibrin)
● S. mutans – zubní kaz (nejrychleji tvoří org. kyseliny)
● S. salivarius, S. sanguinis, S. mitis
13/36
„Ústní streptokoky“ (2)
14/36
Streptococcus salivarius K12
adherovaný k HEp-2 buňkám
Léčba
● lék volby penicilin
● při prokázaných alergiích makrolidy
● léky další volby doxycyklin, kotrimoxazol, ampicilin, aj.
● rezervní ATB vankomycin (zatím žádné rezistence)
● testování in vitro citlivosti – difuzní diskový test na MH
agaru s krvinkami (na obyčejném MH agaru prakticky
nerostou)
15/36
Diagnostika streptokoků
● mikroskopie: G+ koky
● kultivace: na KA kolonie šedé až bezbarvé, většinou
drobné, S. agalactiae má větší kolonie
● hemolýza: α- β- i γ-hemolýza
● nerostou na KA s 10 % NaCl (půda pro stafylokoky), ani
na Slanetz-Bartley či žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky)
● KAT-, OXI●
rezistentní na aminoglykosidy (společně s
enterokoky)
16/36
Diagnostika streptokoků (2)
● streptokoky s αhemolýzou
(viridací)
lze dále určovat
biochemickými testy
● např. při nálezu v
hemokultuře nebo likvoru
dourčujeme původce
● vzorek z dutiny ústní či
krku nikoliv, jsou tam
běžnou flórou
17/36
● streptokoky s β- a γhemolýzou
lze dále
určovat latexovou
aglutinací (protože mají
slabou biochem. aktivitu)
● určení non-A-non-B
streptokoků dle
Lancefieldové
Diferenciální dg. streptokoků
● hodnotíme hemolýzu (viridace, hemolýza částečná či
úplná, bez hemolýzy)
● β-hemolýza:
– S. pyogenes (poz. PYR test a bacitracinový test)
– S. agalactiae (poz. CAMP test)
● α-hemolýza:
– S. pneumoniae poz. optochinový test na rozdíl od
ostatních viridujících streptokoků
18/36
Diferenciální dg. streptokoků (2)
19/36
G+ kok
stafylokok streptokok enterokok
streptokok
s viridací
streptokok
s hemolýzou
streptokok
bez hemolýzy
S. pneumoniae
ústní streptokok
S. pyogenes (SAG)
S. agalactiae (SBG)
non-A-non-B streptokok
Vyhledávání respiračních
patogenů
1) očkováno tamponem
2) očkováno kličkou
3) stafylokoková čára
4) disk BH (bacitracin pro
hemofily)
5) disk V+K (vankomycin a
kolistin pro meningokoky)
na celé naočkované ploše
pátráme po hemolytických
streptokocích (bezbarvé) a
po stafylokocích (spíše bílé
či zlatavé)
20/36
Vyhledávání respiračních
patogenů (2)
bacitracinový disk může být umístěn buďto
na stafylokokovou čáru, nebo cca 1 cm od ní,
používají se oba způsoby
21/36
v těchto místech hledáme hemofily
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
● obarvěte podle Grama všech osm kmenů
● jeden z kmenů bude G- tyčinka (výsledek si
poznamenejte a dále s ním nebudeme pracovat)
22/36
Úkol 2: Kultivační a biochem. testy
● Úkol 2a: Katalázový test k odlišení stafylokoků
– kolonie vmícháme do kapky H2O2
– POZ = bublinky (stafylokok → dále s kmenem
nepracujeme)
– NEG (streptokok nebo enterokok)
● Úkol 2b: Růst na Slanetz-Bartleyově agaru
– POZ = růst kmenu (enterokok → dále s kmenem
nepracujeme)
– stejnému účelu sloužila i žluč-eskulinová půda
23/36
Úkol 3: Kultivace na KA
● pozorujte a zapište typ hemolýzy (viridace,
částečná hemolýza, úplná hemolýza, beze změny)
● popište další vlastnosti kolonií (snažte si
povšimnout rozdílů mezi jednotlivými kmeny, tj.
různých velikostí, pigmentace, typu hemolýzy apod.)
24/36
Úkol 4: Streptokoky s viridací
● Úkol 4a: Optochinový test
– odlišení S. pneumoniae od ostatních viridujících
streptokoků
– pneumokok je citlivý k optochinu, neměříme zónu
inhibice (optochin se dnes již nepoužívá léčebně,
zůstal jen v diagnostice)
● Úkol 4b: Biochemické určení „ústního“ streptokoka
– streptokoky z likvoru a hemokultur
– STREPTOtest 16 (17 reakcí: 1. je VPT, 2. až 9. jsou
v prvním řádku, 10. až 17. jsou ve druhém řádku)
25/36
Úkol 5: Streptokoky s hemolýzou
● Úkol 5a: PYR test
– diagnostický proužek
– kolonie se umístí na reakční plošku proužku, po 10
minutách se přikápne činidlo
– POZ = červené zbarvení
● Úkol 5b: CAMP test
– příklad synergického působení dvou hemolyzinů,
a to hemolyzinu S. agalactiae a β-hemolyzinu
S. aureus
– nelze použít k dg. S. aureus (ne všechny zlaté
stafylokoky produkují β-hemolyzin)
26/36
Úkol 5b: CAMP test
27/36
● na agar se naočkuje laboratorní kmen zlatého
stafylokoka tvořící β-hemolyzin, kolmo k němu se
očkují testované kmeny
Úkol 6: test citlivosti na ATB
● odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a
porovnejte s referenčními hodnotami
● horší patogeny většinou citlivější než mírnější
patogeny
● využíváme MH agar s krvinkami (na běžném MH by
většina streptokoků nevyrostla)
28/36
Precipitace, aglutinace, aglutinace
na nosičích
● precipitace: antigeny jsou ve formě izolovaných
makromolekul (rozpustné koloidní antigeny)
● aglutinace: antigen je součástí buňky mikroba
(pracujeme s celými mikroby, antigen je
korpuskulární)
● aglutinace na nosičích: precipitace převedená na
aglutinaci; původně izolované koloidní antigeny
jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt,
polycelulóza atp.)
29/36
Úkol 7a: aglutinační test
● lahvičky se směsí latex.
částic s navázanými
protilátkami
● z obrázku určete, se
kterým testovaným
sérem kmen aglutinuje
30/36
Neutralizační reakce
● serologické metody, při nichž protilátka brání
běžným projevům antigenu (nejčastěji viru)
– virus neutralizační test:
● Ab neutralizuje infekčnost viru
● buněčná (tkáňová) kultura naočkovaná směsí viru
s Ab zůstane beze změny (metabolický efekt, pH,
fenolová červeň)
– hemaglutinačně inhibiční test (HIT)
● v přítomnosti Ab není virus schopen aglutinovat
erytrocyty (nikoli hemolyzovat!)
– ASLO = průkaz antisteptolyzinu O (protilátky
schopné vyvolat autoimunitní reakci), není to
nepřímý průkaz
31/36
Úkol 7b: ASLO (dg. pozdních
následků streptokokových infekcí)
● po každé streptokokové infekci tvorba Ab, vč. Ab proti
streptolyzinu O (streptokokový toxin)
● v případě, že množství těchto protilátek po infekci
stoupá, zkříženě reagují s některými strukturami
organismu → pozdní následky streptokokových
infekcí
● revmatická horečka, akutní glomerulonefritida
● ASLO: zjištění míry protilátkové odpovědi po
prodělané streptokokové infekci (neprokazujeme tedy
infekci – ta už proběhla – ale zda nedochází k vývoji
autoimunitní reakce)
● hledáme přímo protilátky (ne patogen) → ASLO tedy
není nepřímý průkaz (patogenu)
32/36
Úkol 7b: Dg. pozdních následků
streptokokových infekcí - ASLO
● po každé streptokokové infekci protilátky, vč. protilátek
proti streptolyzinu O (streptokokový toxin)
● v případě, že množství těchto protilátek po infekci
stoupá, zkříženě reagují s některými strukturami
organismu → pozdní následky streptokokových
infekcí
● revmatická horečka, akutní glomerulonefritida
● ASLO: zjištění míry protilátkové odpovědi po
prodělané streptokokové infekci (neprokazujeme tedy
infekci – ta už proběhla – ale zda nedochází k vývoji
autoimunitní reakce)
33/36
Úkol 7b: ASLO
● neutralizace hemolýzy
● streptolyzin O za běžných okolností (nepřítomnost
protilátek) hemolyzuje červené krvinky
NEG = hemolýza
● v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází
k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat
POZ = zábrana hemolýzy
● titr nad cca 200 m.j. riziko pozdních následků
34/36
Jamka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hodnota
m.j.
100 120 150 180 225 270 337 405 506 607 759 911
Pozdní
následky
nehrozí
hra-
ničn
í
hrozí
Úkol 7b: ASLO (2)
● destička se odečítá naležato, první řádek je
pozitivní kontrola
● další řádky jsou jednotliví pacienti
● hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu
35/36
Po tomto cvičení byste měli umět:
● popsat zástupce rodu Streptococcus, vč. diagnostických
postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
● zhodnotit možnost tvorby biofilmu na srdečních
chlopních a případných následků tohoto stavu
● vysvětlit význam testu ASLO a vysvětlit vztah
k pozdním následkům streptokokových infekcí
36/36