P06
Diagnostika některých
dalších gramnegativních
bakterií
Bi7170c (podzim 2019)
Osnova
● čeleď Pasteurellaceae
● zástupci gramnegativních nefermentujících
bakterií (GNFB)
● diagnostika Pasteurellaceae a GNFB
● G– koky, diagnostika
● „jiné“ G– tyčky, diagnostika
● úkoly
2/62
Pasteurellaceae
● čeleď G– tyček, většinou fakultativně anaerobní,
OXI+
● komenzálové na sliznicích savců a ptáků, hlavně HCD
● rody: Actinobacillus, Aggregatibacter, Haemophilus,
Pasteurella, …
● změny v nomenklatuře: od roku 2006 nový rod
Aggregatibacter (obsahuje A. actinomycetemcomitans,
původně Actinobacillus actinomycetemcomitans
a A. aphrophilus, původně Haemophilus aphrophilus)
3/62
Pasteurella multocida
● G– pleomorfní kokobacil,
OXI+, KAT+
● roste na KA, neroste na ENDO
● patogenní pro skot, ovce a drůbež;
nepatogenní pro psy a kočky →
infekce po kousnutí
● infekce ran s komplikacemi
(abscesy, celulitida, osteomyelitida, …), pneumonie,
endokarditidy, …
● citlivá na penicilin (u G – bakterií nezvyklé),
rezistentní na vankomycin
4/62
Rod Haemophilus
● drobné pleomorfní G– tyčky, fakultativně anaerobní
● kultivačně náročné, potřebují k růstu faktor X
(hemin) a/nebo faktor V (NAD)
– faktor X (hem) nutný pro funkci respiračních enzymů,
katalázy, peroxidázy apod.
– faktor V (NAD) nutný pro oxidačně redukční procesy
v buňce
– hynou při chladničkové teplotě → důsledky pro
transport a zpracování vzorků
● na sliznicích člověka i zvířat (nosohltan), většina se
považuje za normální mikroflóru
5/62
Rod Haemophilus (vybraní zástupci)
● Haemophilus influenzae
– pouzderný typ b (Hib) – hexavakcína
● epiglotitidy, pneumonie, sinusitidy, faryngitidy,
meningitidy, sepse, ...
– pouzderné typy a, c, d, e, f
● lokalizované infekce respiračního traktu
– neopouzdřené kmeny (nízká patogenita)
● Haemophilus parainfluenzae (běžnější a méně
patogenní)
● Haemophilus aphrophilus (lehké infekce HCD)
● Haemophilus ducreyi (pohlavně přenášená choroba
ulcus molle)
6/62
Ulcus molle
● pohlavní choroba,
vyskytující se především
v subtropických a tropických
oblastech
● ulcus molle – měkký vřed (chancroid/šankroid) –
způsoben Haemophilus ducreyi, bolestivé
● ulcus durum – tvrdý vřed (chancre/šankr) – jeden
z příznaků syfilis, způsobené Treponema pallidum,
nebolestivé
7/62
www.fmt.am.gov.br
Skupina HACEK
● skupina G– bakterií způsobující bakteriální
endokarditidy
● obsahuje některé zástupce čeledi Pasteurellaceae:
– Haemophilus parainfluenzae, H. paraphrophilus
– Aggregatibacter (Actinobacillus)
actinomycetemcomitans
● další členové jiných čeledí:
– Cardiobacterium hominis
– Eikenella corrodens
– Kingella kingae
8/62
G– nefermentující bakterie
● nesourodá skupina G– tyček
● neschopnost fermentovat glukózu (ale mohou ji
štěpit aerobně, čímž získají více energie!)
● nejdůležitější rody Pseudomonas, Acinetobacter,
Burkholderia, Stenotrophomonas, dále např.
Bordetella, Eikenella, Kingella, Moraxella, …
● adaptovány na vnější prostředí, často rostlinné
patogeny (aerobní respirace, pigmentace, nižší
teplotní optimum okolo 30 °C)
● patogenita obecně nízká (kromě oslabených osob, tj.
imunokompronitovaní, dlouhodobě hospitalizovaní,
popáleniny, ...)
● nozokomiální infekce zejm. respiračního traktu 9/62
Pseudomonas aeruginosa
● G– tyčky, aerobní, OXI+, KAT+, typická zelená
pigmentace (lat. aerugo – měděnka), typický zápach
po jasmínu, starší kultury po amoniaku, pestrá
biochemická aktivita
● napadá oslabené jedince (popáleniny,
imunosuprese, jiná závažná onemocnění jako
diabetes, cystická fibróza, …)
● zdravé lidi může kolonizovat → vektor šíření
nozokomiálních nákaz
● nejhorší prognózy u infekcí popálenin, sepsí
novorozenců, osteomyelitidy a devastujících
infekcí oka (proteolytické enzymy)
● časté rezistence, protipseudomonádová ATB
10/62
Pseudomonas aeruginosa (2)
11/62
Výjimečný kmen pseudomonády
s modrým pigmentem
textbookofbacteriology.net
Typický kmen pseudomonády
se zeleným pigmentem
Rod Burkholderia
● Burkholderia cepacia
– nozokomiální nákazy (především dýchacích cest,
pacienti s cystickou fibrózou)
● pacienti s cystickou fibrózou časté (i trvalé)
záněty dýchacích cest, nejčastěji:
– Pseudomonas aeruginosa
– Staphylococcus aureus
– Haemophilus influenzae
– Burkholderia cepacia
– Aspergillus sp.
12/62
Rod Burkholderia (2)
● Burkholderia mallei
– vozhřivka (malleus)
– lymfadenopatie se sepsí
– výskyt u koní, oslů a ovcí
– v případě přenosu
na člověka fatální
● Burkholderia pseudomallei
– melioidóza (pseudomalleus) – často
bezpříznakově, v případě klinické manifestace
sepse (neléčená má mortalitu 95 %)
13/62
Další GNFB
● rod Acinetobacter (OXI–)
– A. baumannii – nozokomiální infekce, respirátorové
pneumonie, sepse
● rod Stenotrophomonas (OXI–)
– S. maltophilia – u oslabených nozokomiální
infekce s vysokou mortalitou (časté rezistence na
ATB)
14/62
Diagnostika hemofilů a pasteurel
● přímé metody
– mikroskopie – krátké G– tyčky
– kultivace – pasteurely nerostou na Endově
agaru (rostou Enterobacteriaceae, Vibrionaceae a
GNFB), hemofily ani na obyčejném KA,
používámě čokoládový nebo Levinthalův agar
(testy ATB citlivosti) (s výjimkou současné
kultivace s jiným mikrobem – satelitový fenomén);
typický zápach nebo citlivost k ATB
– biochemická identifikace – možné ji použít
– antigenní analýza – u hemofilů (Hib)
– detekce DNA – rutinně se nepoužívá
● nepřímé metody se téměř nepoužívají 15/62
Satelitový fenomén
● hemofily potřebují růstové faktory z erytrocytů
● nejsou samy schopny je narušit → narušit je může
přítomnost dalšího mikroba (zlatý stafylokok s
hemolýzou) nebo je narušíme laboratorně
(čokoládový, Levinthalův agar apod.)
● růst hemofila pouze okolo
stafylokokové čáry
(popř. se užívá bacitracinový
disk ve vyšší koncentraci
k odclonění ostatních bakterií)
16/62
http://phil.cdc.gov
Růst hemofilů na ČA a KA
17/62
ČA KA
Hemofily – vlevo na čokoládovém agaru, vpravo jako satelit na KA
Foto: Mikrobiologický ústav FNUSA
Vyhledávání respiračních
patogenů
1) očkováno tamponem
2) očkováno kličkou
3) stafylokoková čára
4) disk BH (bacitracin pro
hemofily)
5) disk V+K (vankomycin a
kolistin pro meningokoky)
na celé naočkované ploše
pátráme po hemolytických
streptokocích (bezbarvé) a
po stafylokocích (spíše bílé
či zlatavé)
18/62
Vyhledávání respiračních patog. (2)
bacitracinový disk může být umístěn buďto
na stafylokokovou čáru, nebo cca 1 cm od ní,
používají se oba způsoby
19/62
v těchto místech hledáme hemofily
Růstové faktory hemofilů
● specifické potřeby růstových faktorů hemofilů:
– H. parainfluenzae faktor V (NAD)
– A. (H.) aphrophilus faktor X (hemin)
– H. influenzae oba faktory (X+V)
● používáme disky s těmito faktory:
– jeden s faktorem X
– druhý s faktorem V
– třetí se směsí X a V
20/62
Růstové faktory hemofilů (2)
21/62
Růstové faktory hemofilů (3)
22/62
H. influenzae (vlevo), H. parainfluenzae (vpravo)
Antigenní analýza hemofilů
● dnes komerční soupravy pro analýzu
● dříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se
stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání
stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi
23/62
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Citlivost rodu Pasteurella k ATB
● G– bakterie nejsou citlivé na vankomycin
● vankomycin lze použít jen u G+ (všechny streptokoky a
většina stafylokoků a enterokoků je citlivá)
● málo bakterií je citlivých na penicilin, obzvláště
mezi G– tyčinkami
● kombinace citlivosti k penicilinu a rezistence
k vankomycinu poměrně specifická pro rod Pasteurella
24/62
Diagnostika GNFB
● přímé metody
– mikroskopie – G– tyčky, Acinetobacter je G– kok
– kultivace – rostou na většině půd vč. KA a ENDO
(nefermentují Glc a většinou ani Lac → tmavé
zbarvení kolonií na ENDO je dané případným
pigmentem)
– biochemická identifikace – možná, ale je potřeba
použít testy, zjišťující aerobní respiraci (ne
fermentaci); nutno použít sníženou teplotu a
prodlouženou inkubaci
– antigenní analýza, detekce DNA – rutinně se
nepoužívají
● nepřímé metody se používají zřídka
25/62
Diferenciální diagnostika GNFB
● pseudomonády:
– typická vůně (mladé kultury)
– tvoří pigmenty (nejčastěji zelené – pigment
pyoverdin, někdy modré či rezavé), nejlépe viditelné
na MH (na KA a ENDO perleťový lesk kolonií)
– OXI+
● ostatní nefermentující, (případně sporné
pseudomonády) rozlišíme biochemicky
– např. NEFERMtestem 24 (v kombinaci s oxidázovým
testem)
26/62
Oxidázový test GNFB
● Pseudomonas OXI+
● Burkholderia většinou OXI+
● Stenotrophomonas většinou OXI–
● Acinetobacter OXI–
27/62
NEFERMtest 24
● pro biochemickou identifikaci GNFB užíváme
většinou Nefermtest 24 (nebo podobný jiných výrobců
● 24 reakcí (trojstrip)
● kód se tu tvoří jiným způsobem:
– první číslice je 0 (OXI–) nebo 1 (OXI+)
– dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
– sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení)
28/62
NEFERMtest 24 (2)
● do jednoho rámečku
lze vložit čtyři trojřádky
pro čtyři kmeny,
každý se identifikuje
pomocí 24 reakcí
29/62Foto: Mikrobiologický ústav, O. Z.
Citlivost GNFB k ATB
● GNFB rostou ochotně na nejrůznějších médiích
● pro testování i léčbu používáme poměrně silná
antibiotika, nevhodná pro léčbu infekcí způsobených
běžnými bakteriemi
– cefalosporiny 3. generace* (jen některé, tzv.
„protipseudomonádové“, jako je ceftazidim)
– protipseudomonádové peniciliny, monobaktamy
a karbapenemy* (imipenem, piperacilin/tazobactam)
– aminoglykosidy (gentamicin, amikacin)
– fluorochinolony (ciprofloxacin, ofloxacin)
– polypeptidy (kolistin)
*a jejich kombinace s inhibitory betalaktamáz
30/62
Rod Neisseria
● G– koky až kokobacily, často ve dvojicích, aerobní,
mikroaerofilní (či kapnofilní)
● KAT+, OXI+
● kultivačně poměrně náročné:
– ústní neisserie: KA
– N. meningitidis: obohacený KA
– N. gonorrhoeae: ČA
31/62
Neisseria gonorrhoeae
● G– diplokok, tvar kávového zrna,
často intracelulárně (leukocyty)
● původce kapavky, infekce
nezanechává trvalou imunitu →
není možné očkování
● citlivý na vnější vlivy (přenáší se
pouze pohlavně), nutné omezit teplotní šok
(předehřáté medium, rychlý transport atp.)
● z důvodu citlivosti se zasílají výtěry: ústí urethry,
cervix (nikoli pochva!), rektum (možný rezervoár
infekce), v případě podezření výtěr z faryngu
● kredeizace – prevenze novorozenecké
keratokonjunktivitidy (Septonex, dříve AgNO3)
32/62
Intracelulární uložení gonokoků
33/62
Neisseria meningitidis
● G– diplokok, citlivý na teplotu
● časté bezpříznakové nosičství, může způsobit
faryngitidy, pneumonie, až meningitidu a sepsi
● meningitida málo častá, ale vysoce letální (nutná
kombinace vysoce virulentního kmenu a oslabené
imunity)
● rychlý průběh (z plného zdraví chřipkovité příznaky,
vyrážka, petechie, meningeální příznaky, sepse)
● nejčastější seroskupiny: A, B, C, W135, a Y
– možné očkování (v ČR nejčastější seroskupiny
B a C, jinde častější ostatní typy, viz mapa)
– očkování proti seroskupině B pokrývá ¾ kmenů
34/62
Neisseria meningitidis (2)
● „meningitis belt“ v Africe
35/62
„Ústní“ neisserie
● běžná mikroflóra dutiny ústní a faryngu
● obyčejně nepatogenní, při poruše imutiny
endokarditidy, meningitidy
● koky, kokobacily (nemusí se jednat o diplokoky)
● kultivace málo náročná, postačí KA
● N. lactamica, N. subflava
36/62
Srovnání neisserií
37/62
In vivo In vitro
gonokok nejchoulostivější,
přenos jen sexuální
nejchoulostivější,
roste jen na
čokoládovém agaru
meningokok méně choulostivý,
přenos na krátké
vzdálenosti i
kapénkami
méně choulostivý,
je-li krevní agar
obohacen, může na
něm růst
„ústní“
neisserie
nejméně
choulostivé
roste i na chudém
krevním agaru
Rod Moraxella
● krátké tyčky, kokobacily, M. catarrhalis diplokok
● KAT+, OXI+, INAC+ (indoxylacetátový test)
● sliznice nasofaryngu, spojivkového vaku, genitální trakt
● Moraxella catarrhalis (dříve rod Branhamella):
– záněty HCD u dětí (sinusitis, otitis media)
● Moraxella lacunata
– konjunktivitida
38/62
Diagnostika G– koků
● u podezření na kapavku důležité provést správně
odběry (vysoce citlivé mikroorganismy)
– časté, že patogen nepřežije transport
– doporučováno poslat také nátěr na sklíčko
z cervixu a urethry (ne z rekta a faryngu)
● purulentní meningitida
– odebírá se mozkomíšní mok, případně krev na
hemokultivaci
– mozkomíšní mok lze vyšetřit biochemicky,
cytologicky a mikrobiologicky (mikroskopie,
přímý průkaz antigenu)
– nejdůležitější co nejrychlejší zahájení léčby pacienta!
39/62
Kultivace G– koků
● drobné, bezbarvé nebo nažloutlé kolonie, rostoucí
(podle druhu) na krevním či čokoládovém agaru
● KA či ČA nezbytný i pro difusní diskový test
40/62
KA KA+ ČA
gonokoky NE NE ANO
meningokoky NE ANO ANO
ústní neisserie a
moraxelly
ANO ANO ANO
Legionella pneumophila
● kultivačně náročná G− tyčka,
více sérotypů, speciální půda BCYE
● nejčastější původce legionářské
nemoci (pneumonie)
● pontiacká horečka (lehké chřipkové
onemocnění s bolestmi hlavy a svalů,
bez postižení plic)
● rezervoár ve vodovodech, klimatizaci, atp. → nutné
pečlivé plánování vodovodní sítě
● přenos inhalací kontaminovaného aerosolu
● průkaz antigenu v moči
41/62
Legionella pneumophila (2)
42/62
Rod Bordetella
● G– kokobacily, Bordetova-Gengouova půda
● řasinkový epitel HCD, přenos kapénkově
● B. pertussis a B. parapertussis, původci pertusse
(dávivý neboli černý kašel), resp. parapertusse
● B. bronchiseptica (primárně zvířecí patogen, vyvolává
respirační onemocnění psů,
prasat, atd., ojedinělý přenos
na člověka, obtíže podobné
pertussi)
● pro diagnostiku se používá
pernasální výtěr
43/62
Rod Brucella
● G– kokobacily
● pro člověka patogenní B. abortus, B. melitensis,
B. suis a B. canis
● Bangova choroba (neboli brucelóza, undulující
horečka či maltská horečka)
– místem vstupu nejčastěji poraněná kůže nebo
sliznice
– intracelulární parazit fagocytujících buněk,
v makrofázích jsou roznášeny po celém těle → široká
škála příznaků (horečka, zimnice, pocení, únava,
myalgie, svalová slabost, nechutenství...)
– diagnostika zejména hemokultivace a serologie
na specializovaném pracovišti
44/62
Francisella tularensis
● G– kokobacily, intracelulární parazit
● původce tularémie
– primárním rezervoárem hlodavci a klíšťata
– charakteristické fokálním vředem v místě
vniknutí do organizmu a zvětšením místních
mízních uzlin
– podle brány vstupu různá
klinická manifestace
(od nejčastější formy
ulceroglandulární
až po septickou)
45/62
Diagnostika „jiných G– tyček“
● mikroskopie: G – kokotyčky
● kultivace: zpravidla speciální půdy (BG pro
bordetely, BCYE pro legionely atd.)
● biochemická identifikace: některé znaky mohou být
využity
● antigenní analýza: někdy se využívá
● nepřímé metody: využívají se, např. aglutinace u
tularémie
● diferenciální diagnostika neprobíhá algoritmicky
(vzorky zasílány na vyšetření přímo s podezřením na
legionelózu, dávivý kašel, Bangovu chorobu apod.)
46/62
Úkol 1: Mikroskopie suspektních
kmenů
● obarvěte kmeny podle Grama a do tabulky vepište
výsledky
● kmen, který není G–, nebude studován v úkolech 3 až 5
47/62
Úkol 2: Kultivace na agarových
půdách
● popište kolonie na KA, pokud na KA nerostou, popište je
na KA+ nebo ČA
● popište růst na ENDO
● zhodnoťte nárůst na MH agaru (pigmentace)
48/62
Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae
● úkol 3a: Satelitový fenomén (zakreslete a popište,
jak vypadá satelitový fenomén)
● úkol 3b: Identifikace hemofilů podle potřeby
růstových faktorů (určete kmeny podle potřeby různých
růstových faktorů)
49/62
http://phil.cdc.gov
Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae
● úkol 3c: Detekce kapsulárních antigenů H. influenzae
● úkol 3d: Detekce P. multocida pomocí typického
vzorce citlivosti (citlivé k penicilinu, rezistentní k
vankomycinu
50/62
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Úkol 4: Hajnova půda
Úkol 5a: Oxidázový test
● kmen, který fermentuje glukózu (žlutá barva)
označte jako „+“;
kmeny nefermentující (červená) jako „–“
● oxidáza:
– Pseudomonas OXI+
– Burkholderia většinou OXI+
– Stenotrophomonas většinou OXI–
– Acinetobacter OXI–
● Pseudomonas (pigment, typická vůně, OXI+)
51/62
Úkol 5: Základní biochemické testy
u G– koků
● testy budou prováděny demonstračně na bočním stole
● úkol 5a: Oxidázový test k odlišení neisserií a
moraxel od případných jiných G- koků
● úkol 5b+c: Indoxylacetátový test k odlišení
Moraxella catarrhalis od neisserií
– proužkový test, pozitivní je modrozelené zbarvení po
několika minutách
52/62
Úkol 5b: Podrobné biochemické
testování (NEFERMtest 24)
● vyhodnoťte předložené výsledky NEFERMtestu 24
● kultivace 2 dny při 30 °C
● sedmimístný kód:
– první číslice je 0 (OXI–) nebo 1 (OXI+)
– dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
– sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení)
53/62
Úkol 5b: Diagnostika neisserií a
moraxel biochemickými testy
● v naších podmínkách NEISSERIAtest
● povšimněte si slabé biochemické aktivity
patogenních neisserií
● gonokok štěpí
jen glukózu
● meningokok
jen glukózu
a maltózu
54/62
Úkol 6: Testy citlivosti patogenů
na antibiotika
● odečtěte test pro pseudomonádu
55/62
Úkol 7: Přímý průkaz antigenů
původců meningitid
● prohlédněte si soupravu a zapište názvy mikrobů,
které mohou být touto metodou diagnostikovány:
– Neisseria meningitidis A (teenageři, batolata)
– Neisseria meningitidis B (teenageři, batolata)
– Neisseria meningitidis C (teenageři, batolata)
– N. meningitidis Y/W135 (teenageři, batolata)
– Haemophilus influenzae b (dříve batolata)
– Streptococcus pneumoniae (senioři)
– Streptococcus agalactiae (novorozenci)
– (nejtypičtější věková skupina uvedena v závorce)
● prohlédněte si videoklip a zapište určený patogen
56/62
Úkol 8: Diagnostika bordetel,
brucel, legionel a francisel
● úkol 8a: Kultivační diagnostika bordetel
– výtěr je smíchán s kapkou
– očkován ve směru spirály
– poté jsou očkovány radiální paprsky kličkou
57/62
Úkol 8: Diagnostika bordetel,
brucel, legionel a francisel
● úkol 8b: Demonstrace kultivační půdy na
legionely (Buffered Charcoal Yeast Extract)
58/62
některé legionely
fluoreskují v UV světle
Úkol 8: Diagnostika bordetel,
brucel, legionel a francisel
● úkol 8c: Průkaz protilátek proti tularémii
– aglutinace je mapovitý povláček na dně důlku
(buňky jsou provázány protilátkami)
– negativní reakce je kompaktní pravidelná tečka
(sedimentované bakteriální buňky)
59/62
pozitivní negativní
1:2 1:4 1:8
Úkol 8: Diagnostika bordetel,
brucel, legionel a francisel
● úkol 8c: Průkaz protilátek proti tularémii
– 1. řada:
aglutinát je viditelný
v ředění 1:2 a 1:4,
nikoli však již 1:8 a vyšším
titr je 1:4
– 2. řada:
v žádném důlku
není aglutinace →
žádný titr,
negativní reakce
60/62
Úkol 8: Diagnostika bordetel,
brucel, legionel a francisel
● úkol 8d: Diagnostika protilátek proti brucelóze
– provedena ELISA ve třídách IgG i IgM
– pokuste se o závěrečnou interpretaci
● pozitivní IgM → akutní infekce
● pozitivní igG → prodělaná/chronická infekce
61/62
Po tomto cvičení byste měli umět:
● popsat nejdůležitější zástupce čeledi Pasteurellaceae a
nejvýznamnější zástupce gramnegativních nefermentujících
bakterií (GNFB), vč. diagnostických postupů, které vedou k
úspěšné identifikaci, vysvětlit co je satelitový fenomén a na
základě čeho vzniká
● vysvětlit použití ATB a typické vzorce citlivosti čeledi
Pasteurellaceae a GNFB, využít specifické růstové faktory pro
rozlišení hemofilů
● popsat nejdůležitější zástupce rodů Neisseria a Moraxella, vč.
diagnostických postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
● zhodnotit nároky na transport a výživu rodů Neisseria a Moraxella,
popsat „jiné“ G– tyčky, jejich nároky na kultivaci a možné
diagnostické metody
● jmenovat původce purulentních meningitid, vč. diagnostických
postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
62/62