P08
Acidorezistentní bakterie
Spirochety
Bi7170c (podzim 2019)
Osnova
● acidorezistence
● rod Mycobacterium (TBC, lepra,
mykobakteriózy)
● Actinomyces spp., Nocardia spp.
● spirochety
2/57
Acidorezistence
● vysoký obsah lipidů v buněčné stěně
– vysoce hydrofobní
– tvoří fosfolipidy, glykolipidy a lipoproteiny
– mykolové kyseliny
● obtížná barvitelnost (hydrofilními) organickými
barvivy (nebarví se Gramovým barvením)
● odolnost ke kyselinám (využití při Ziehl-Neelsenově
barvení), zásadám (využití při kultivaci) i alkoholům
● typická pro mykobakterie
● částečně pozorováno u aktinomycet a nokardií
3/57
Acidorezistence (2)
4/57
Rod Mycobacterium
● považovány za G+, nepohyblivé, nesporulující, aerobní
● dlouhá generační doba → kultivace až v řádu týdnů
● acidorezistence, alkalirezistence
● přežívání uvnitř makrofágů (hlavní roli má buněčná
imunita → minimum protilátek)
● odolné k vyschnutí a dezinfekčním látkám (nestačí
spektrum A; T = TBC, M = atypické mykobakterie)
● M. tuberculosis – TBC
● M. leprae – lepra (malomocenství)
● M. bovis; M. bovis BCG (očkovací kmen)
● atypické mykobakterie
5/57
Tuberkulóza (TBC)
● Mycobacterium tuberculosis (bacil Kochův, BK),
vzácně M. bovis
● obvykle vstup přes plíce (vzácně přes GIT nebo ránou)
● vznik primárního komplexu (zánětlivé ložisko v
plicním parenchymu, zánět a zvětšení příslušné
regionální mízní uzliny) → buněčná imunita → hojení
fibrotizací nebo kalcifikací
● spontánní celkové zhojení
● ložiska infekce (granulomy neboli tuberkly)
kaseifikují (latentní forma) → jádro se rozpadne a
zkapalní → infekční obsah se uvolňuje to bronchů
→ vykašlávání (otevřená TBC)
● šíření krví (inf. kteréhokoli orgánu) – miliární TBC
6/57
Postprimární TBC
● za několik týdnů až mnoho let po primární infekci
(reaktivace primární infekce, někdy superinfekce)
● reaktivace po opakované infekci mykobakteriemi,
progrese primární infekce např. po těžké respirační
infekci, u oslabených jedinců (stáří, alkoholici,
imunokompromitovaní)
● otevřená TBC
– kašel, hemoptýza
(chrchlání krve),
zvýšená teplota,
hubutí
– někdy bezpříznaků
7/57
Léčba TBC
● vždy kombinace antituberkulotik (vznik rezistence)
● 1. řada: izoniazid, rifampicin, pyrazinamid,
etambutol, streptomycin
● 2. řada: amikacin, kanamycin, capreomycin, ofloxacin,
ciprofloxacin, cykloserin, rifabutin, …
● MDR (multidrug-resistant): izoniazid a rifampicin
● XDR (extensively drug-resistant): izoniazid, rifampicin,
fluorochinolony, amikacin/kanamycin/capreomycin
● léčba 4 až 12 měsíců:
– iniciální: čtyřkombinací po 2 měsíce (snížení množ.)
– pokračovací: dvojkombinací (sterilizace ložiska)
8/57
Očkování proti TBC
● donedávna povinné očkování novorozenců živou
vakcínou BCG (kalmetizace, bacille Calmette-Guérin)
– připraveno z kmene M. bovis pasážováním
● donedávna povinné přeočkování při negativním výsledku
kožního tuberkulinového testu
● 2010 – plošné očkování zrušeno → selektivní očkování
– povinně očkovaní jen ohrožení novorozenci
(např. předchozí výskyt v rodině, rodiče udávají delší
pobyt v zemích se zvýšenou incidencí TBC)
– ve vzácných případech defektu imunity docházelo po
kalmetizaci ke generalizované infekci očkovacím
kmenem
9/57
asd
● asd
10/57
asd
● asd
11/57
asd
● asd
12/57
Lepra (malomocenství)
● Mycobacterium leprae (Hansenův bacil)
● extrémně dlouhá generační doba (cca 2 týdny),
inkubační doba několik let
● růst při nižší teplotě (30 °C) → okrajové části těla
● často bez příznaků, málo nakažlivá (kromě kožní formy s
vředy)
● může se vyvinout destruktivní forma (napadá
Schwannovy bb. a makrofágy v PNS, ničí imunitní bb.)
● neexistuje vakcína, ale ochranný účinek má očkování
proti tuberkulóze
● léčba: dapson + rifampicin + clofazimin (měsíce až léta)
13/57
Lepra (projevy)
14/57
léze na končetinách
vředy a nekróza na
tváři (facies leontina)
Atypická mykobakteria
● podmíněně patogenní (tzv. mykobakteriózy)
● rezistentní na řadu antituberkulotik
● M. avium komplex (M. avium ssp. avium, M. avium
ssp. paratuberculosis, M. intracellulare)
– lymfadenitidy, plicní procesy podobné TBC
● M. kansasii, M. xenopi (plicní infekce)
● M. marinum – kožní léze (fish tank granuloma,
swimming pool granuloma)
● M. ulcerans – burulský vřed
● M. smegmatis – nepatogenní, součást mikroflóry
15/57
Přímý průkaz TBC
● mikroskopie: Ziehl-Neelsenovo barvení
(modifikace dle Kinyouna)
● kultivace: speciální vaječné půdy (moření louhem
kvůli usmrcení ostatních bakterií)
● automatická kultivace: kultivace v automatech,
které detekují pozitivitu dříve
● biochemické rozlišení: pouze specializované laboratoře
● pokus na zvířeti: morče (na ústupu)
● PCR diagnostika: nabývá na důležitosti
16/57
Nepřímý průkaz TBC
● tvorba protilátek je minimální (pozitivní nález je
známkou infekce, negativní nález nemá hodnotu)
● testování buněčné imunity
● kožní (tuberkulinový) test dle Mantouxové
– testování po vakcinaci
– pozitivní nález: mírné zarudnutí a zatvrdnutí v okolí
místa vpichu po 3 dnech
● test uvolňování INFγ (reakce pacientových buněk na
antigen) – test QuantiFERON-TB
17/57
QuantiFERON-TB
● vyšetření indukovaného uvolňování INFγ
● při TBC (i latentní) tuberkulózní antigeny aktivují
T-lymfocyty, které tvoří velké množství INFγ
● odebírá se nesrážlivá (heparinizovaná) krev do tří
zkumavek:
– 1. zkumavka: obsahuje mitogen (MIT)
phytohemagglutinin – zde by mělo dojít ke stimulaci
tvorby INFγ vždy (kromě nedostatku/snížené aktivity
lymfocytů)
– 2. zkumavka: obsahuje antigeny TBC (TB) – ke
stimulaci tvorby INFγ dojde při infekci TBC
– 3. zkumavka: pro odečet pozadí (NIL)
(nespecifický INFγ, heterofilní protilátky)
18/57
QuantiFERON-TB - hodnocení
● pozitivní: ve zkumavce TB T-lymfocyty reagují na
stimulaci antigenem, ve zkumavce NIL (pozadí)
nedochází k tvorbě interferonu
● negativní: T-lymfocyty reagují na stimulaci mitogenem
(MIT) ale nereagují na stimulaci antigenem
mykobakterie (TB)
● neurčitý výsledek: T-lymfocyty nereagují na stimulaci
mitogenem (MIT) nebo ve zkumavce NIL (pozadí)
dochází k tvorbě interferonu
19/57
Actinomyces spp.
● anaerobní vláknité grampozitivní bakterie (částečně
acidorezistentní → špatně se barví Gramovým barvením)
● běžně v dutině ústní, nosohltanu, střevě, vagině, …
→ endogenní nákazy
● aktinomykóza (A. israeli, A. naeslundi)
– cervikofaciální, intrathorakální, abdominální,
kožní, děložní
– abscesy (chronické podkožní
abscesy) a píštěle
● osteomyelitida (A. israeli)
20/57
Nocardia spp.
● G+ aerobní tyčky až vlákna, částečně acidorezistentní
● půdní bakterie (subtropy, tropy) → exogenní nákazy
● chronické kožní abscesy
● N. asteroides - plicní infekce (možná diseminace,
mozkové abscesy)
● N. brasiliensis
(podkožní abscesy)
21/57
Spirochety
● rody Borrelia, Treponema, Leptospira
● spirální pohyblivé bakterie (axiální bičíky
v periplazmatickém prostoru)
● buněčná stěna podobná G- bakteriím, ale nebarví se
podle Grama, velice obtížná kultivace
● mikroskopie v zástinu, fluorescenční mikroskopie
22/57
Rod Borrelia
● původci lymské boreliózy
– B. burgdorferi sensu lato
● B. burgdorferi sensu stricto (USA + Evr.;
postižení kloubů a myokardu)
● B. afzelii (Evr. + Asie; kožní příznaky)
● B. garinii (Evr. + Asie; neurologické projevy)
● původci návratných horeček
– B. recurrentis
– B. duttoni
– B. hermsii
23/57
Lymeská borelióza
● zoonóza, přenos klíšťaty (v ČR Ixodes ricinus),
rezervoár hlodavci, ptáci
● incidence v ČR: 40/100 000 obyvatel
● často spontánní uzdravení
● protilátky asi u 10 % zdravých osob
● prodělané onemocnění
chrání jen částečně
● ATB: beta-laktamy,
tetracykliny
24/57
Stádia lymské boreliózy
● časné lokalizované
– erythema migrans (3–30 dní)
– nespecifické příznaky
● časné diseminované
– borreliový lymfocytom (často uši)
– neurologické, kardiální, revmatologické projevy
● pozdní diseminované
– chronická encelafomyelitida, artritida
– acrodermatitis chronica atrophicans (degenerace
podkoží, ztenčená kůže)
25/57
Rod Treponema
● Treponema pallidum
– ssp. pallidum – syfilis (pohl. nemoc, přenos sex.)
– ssp. endemicum – endemická syfilis (bejel) – léze na
ústní sliznici
– ssp. carateum – pinta – kožní léze (Lat. Am.)
– ssp. pertenue – framboesie – kožní léze (Afr., JV
Asie, J. Am.)
● Treponema denticola – nepatogenní, popř.
periodontitida
26/57
Syfilis (lues)
● T. pallidum ssp. pallidum
● klasická pohlavní nemoc (přenos sexuálně)
● časná syfilis
– primární (ulcerace v místě vstupu – na genitálu,
ulcus durum, tvrdý vřed
– sekundární (diseminace, horečka, bolesti hlavy,
artralgie, anorexie, generalizovaná vyrážka +
kondylomata – kožní a slizniční léze)
– časná latentní (během 1. roku po překonání
sekundárního stadia, asymptomatické období, možné
relapsy sekundárního stadia)
27/57
Syfilis (2)
● pozdní
– pozdní latentní (není
epidemiologické riziko,
možné pozdní příznaky)
– terciální
● gummata – měkké záněty
(nejčastěji játra, kosti, kůže)
● neurosyfilis – meningitida, progresivní paralýzy,
demence, tabes dorsalis (poruchy polohocitu,
chůze, čití, ...)
● kardiovaskulární záněty, aneurysma (aorta)
● vrozená syfilis (potrat nebo sekundární stadium)
28/57
Diagnostika syfilis – přímý průkaz
● přímý průkaz se provádí zřídka
● mikroskopie: nativní preparát (mikroskopie v
zástinu, fluorescenční mikroskopie
● kultivace a biochemie: nepoužívá se
● průkaz antigenu imunofluorescenčně
● pokus na zvířeti: rabbit infectivity test (RIT), očkování
do varlat novozélandského bílého králíka (orchitida za
10 dní) – dnes raritní
● PCR diagnostika
29/57
Diagnostika syfilis – nepřímý průkaz
● netreponemové testy:
– RRR (rychlá reaginová reakce) RPR (rabbit-plasma
reagin test) VDRL (venereal disease research
laboratory)
– zjišťuje se přítomnost nespecifických protilátek
proti kardiolipinu
– detekovatelné cca 4 týdny po infekci
● treponemové testy
● antigen je z T. pallidum
● TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test
(TPPA – T. p. particle agglutination), anti-TP
● ELISA, FTA-ABS, western blotting
30/57
Přehled testů na syfilis
Historický
BWR – Bordet
Wassermann Netreponemové
Screening
RRR/RPR/VDRL
TPHA/TPPA/anti-TP
Treponemové
Konfirmace
ELISA
FTA-ABS
Western blotting
Historický
(superkonfirmace)
TPIT (Treponema
Pallidum Imobilizační
Test) = Nelson
31/57
Leptospira interrogans
● jemné závity, na koncích ohnuté
● nákaza kontaktem s močí infikovaného zvířete –
hlodavci, prase, skot, … (koupání v přírodních vodních
zdrojích, konzumace kontaminované vody)
● vstup kůží (pravděpodobně i neporušenou) nebo
sliznicemi (typicky spojivkou)
● serovar Grippotryphosa – polní/žňová/blaťácká
horečka
– chřipkovité příznaky, anikterická forma
● serovar Icterohemorrhagiae – Weilova nemoc
– nejdříve podobné blaťácké horečce, poté ikterus,
krvácivé projevy na kůži a sliznicích, renální selhání
32/57
Úkol 08/1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie
● barvení dle Ziehl-Neelsena
– barvíme karbolfuchsinem (Gabbet) za horka až do
výstupu par (po odpaření části barviva ho
doplníme a opět zahříváme, opakujeme celkem 3x)
– zahřívání provádíme v dostatečné vzdálenosti, aby v
průběhu neprasklo podložní sklíčko)
– odbarvujeme cca 15 sekund kyselým alkoholem
(směs ethanolu s HCl nebo H2SO4), opláchneme
vodou
– dobarvujeme pozadí malachitovou zelení nebo
metylénovou modří
– barvení lze použít i pro střevní kokcidie
(kryptosporidia a cyklospory)
33/57
Úkol 08/1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie (2)
34/57
Úkol 08/1c: Mikroskopie kmenů
aktinomycet a nokardií (Gram)
35/57
aktinomycety – větvení
ve variabilní úhlu
nokardie – časté větvení
v pravém úhlu
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií
● M. tuberculosis:
● před kultivací moření louhem
● tekuté půdy: Šulova, Baničova (nárůst na dně
zkumavky – modrý/bílý
● pevné půdy: Ogawova či LöwensteinJenssenova
(půdy neobsahují agar – tuhost
dodává vaječný bílek)
● pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají
zátkou (vyschnutí půdy při dlouhé kultivaci)
● odečítání výsledků: za 1 týden (kontrola
kontaminace) 3 (rychle rostoucí mykobakterie),
6 (obvykle pozitivní nálezy) a 9 (pomalu rostoucí
mykobakterie) týdnů kultivace
36/57
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (2)
37/57
růst na pevné půdě
Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (3)
38/57
aktinomycety – nepravidelné kolonie
s lalůčky a výběžky
nokardie – nepravidelné
kolonie, suchý vzhled
Úkol 08/3a: Určení citlivosti
mykobakterií na antituberkulotika
● kombinace tří čtyř antituberkulotik (rychlý vznik
rezistencí, některá působí jen intracelulárně nebo
extracelulárně)
● nelze používat difúzní diskové testy
● antituberkulotika přidáváme přímo do (pevné) kultivační
půdy + zařadíme kontrolu růstu
● mykobakterium roste: rezistentní
● mykobakterium neroste: citlivé
39/57
Úkol 08/4: PCR v diagnostice TBC
40/57
Úkol 08/5: Diagnostika lepry
● pásovec devítipásý
● lepromin
– antigen z usmrcených
bakterií M. leprae
– získávaný z tkání
infikovaných lidí
nebo pásovce
● leprominový test
– kožní test (obdoba tuberkulinového testu u TBC)
41/57
Úkol 08/6: Nepřímý průkaz TBC
pomocí QUANTIFERON©-TB Gold
● pokuste se interpretovat výsledky testů u pacientů
(hodnoty uvedeny v IU/ml)
42/57
NIL TB mínus NIL MIT mínus NIL Konečná
interpretace
testu
Přítomnost
infekce
M. tuberculosis
≤ 8,0 < 0,35 ≥ 0,5 negativní Nepravděpodobná
≥ 0,35 jakákoli
hodnota
pozitivní Pravděpodobná
< 0,35 < 0,5 nejistá Nelze určit
> 8,0 jakákoli
hodnota
jakákoli
hodnota
Nelze určit
Úkol 09/1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA
● Pacient J: klinicky definované erythema migrans
(jasný obraz, ne jen podezření)
● Pacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže
nejsou přítomny
● Pacient L: neurologové nalezli typické klinické
příznaky neuroboreliózy
● Pacient M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a cítí
se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o
tomto riziku.
● Pacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu,
avšak není jasné
43/57
Úkol 09/1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA (2)
● průkaz protilátek ve třídách IgM a IgG
● výsledky reakce ve formě absorbance
● pozitivní hodnoty jsou vyšší než hodnota
kalibrace (CAL) (K+ a K- jsou kontroly, důlky B1 a C1)
44/57
Úkol 09/2: Průkaz protilátek proti
B. garinii pomocí WB
● konfirmace pokud je pozitivní reakce ELISA nebo
klinické důvody (J – klinické důvody)
● pozitivní WB:
– IgM: pozitivita v pruhu p25 a OspC
– IgG: pozitivita v pruhu VlsE
45/57
Úkol 09/3: Dg. borreliózy PCR
● PCR je přímý průkaz (průkaznější než hledání
protilátek) zvláště u čerstvé infekce, kdy ještě nejsou
vytvořeny protilátky
● k PCR jsou indikováni pacienti L a N
● pozitivita: svítící proužek
● IC nebyla použita, vpravo je ladder
46/57
Výsledky úkolů 09/1-3
ELISA WB PCR
IgM IgG IgM IgG
J (erythema migrans) - - - K
(klíště v létě) - + - +
L (příznaky neurobor.) + + + + +
M (zdravý) - + - +
N (podezření neurobor.) + - - - -
47/57
Závěry k úkolům 09/1-3
● J: nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je
seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně
pádným důvodem k léčbě)
● K: zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další
diferenciální diagnostika
● L: skutečně jde o neuroboreliózu, léčba ceftriaxonem
● M: pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal
bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má
pozitivní IgG)
● N: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR, zřejmě
zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných
neuroinfekcích
48/57
Úkol 09/4a+b+c:
Přímý průkaz syfilis
● rabbit infectivity test (RIT), očkování do varlat
novozélandského bílého králíka (orchitida za 10 dní)
● zástinová mikroskopie (pozorujeme světlo které se
ohnulo či odrazilo na preparátu)
● přímá imunofluorescence
(detekce antigenů pomocí
značených protilátek)
49/57
Úkol 09/5+6:
Nepřímý průkaz syfilis
● úkolu 09/5: screening pacientů vybereme ty, které
je třeba konfirmovat
● úkolu 09/6: potvrzení dg., konečný závěr
● vyšetřované osoby:
● A = těhotná žena (běžný screening, není
zvýšené riziko syfilis)
● B = pacient s dva dny trvající lézí, která
vypadá jako ulcus durum
● C = pacient se suspektní lues latens
● D = dárce krve (pouhý screening)
● E = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis
50/57
Úkol 09/5: RRR a TPHA
● RRR: pozitivní je důlek se zákalem
● TPHA
51/57
pozitivní kontrola
negativní kontrola
pacienti 1, 2 a 3
technické důlky negativní kontrola
každého pacienta
vlastní reakce
Úkol 09/5: RRR a TPHA
● screeningové reakce se dělají při každém
testování na syfilis (vč. těhotných)
● screeningové reakce se zpravidla provádějí jen
kvalitativně či semikvantitativně
● indikace ke konfirmaci:
– jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek
reakce RRR a/nebo TPHA
– přítomnost suspektních lézí na těle, nebo
anamnéza rizikového sexuálního styku (zde i
v případě negativity obou reakcí)
52/57
Úkol 09/5: RRR a TPHA (výsledky)
RRR TPHA závěr
A (těhotná) + - konfirmace
B (léze) - - konfirmace
C (susp. lues) - +++ konfirmace
D (dárce krve) - - bez konfirmace
E (dítě, vroz. lues) + +++ konfirmace
53/57
Úkol 09/6: Konfirmace syfilis
● výsledky reakce FTA-ABS:
54/57
konfirmace se
neprovádí
CBA D E
● hodnocení reakce ELISA:
– cut off hodnota: (C1 + D1)/2
– IgM: hodnoty vyšší než 0,494 jsou pozitivní
– IgG: hodnoty vyšší než 0,366 jsou pozitivní
● hodnocení Western blottu: za pozitivní v IgG i v IgM
považujte všechny pásky, na kterých umístění a
uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole
Úkol 09/5+6:
Nepřímý průkaz syfilis (výsledky)
FTA ELISA WB závěr
ABS IgM IgG IgM IgG
A (těhotná) - - - - nejde
o lues (falešně
poz., možná po očkování)
B (léze) - - - - PCR
nutné, u čerstvé
infekce možná
seronegativita
C (susp. lues) + - + - + lues latens
D (dárce) dárce je v pořádku
E (dítě, vroz.
lues)
+ + + + +
kongenitální syfilis,
vyšetřit krev matky
55/57
Úkol 09/7: Přímý průkaz
Leptospira spp.
56/57
Po tomto cvičení byste měli umět:
● vysvětlit co je to acidorezistence a jak se projevuje
● popsat zástupce acidorezistentních bakterií a spirochet,
vč. diagnostických postupů, které vedou k úspěšné
identifikaci
● zhodnotit význam přímých a nepřímých metod v
diagnostice acidorezistentních bakterií a spirochet, vč.
vhodnosti jejich použití pro konkrétní případy
57/57