P08
Laboratorní diagnostika
tuberkulózy, aktinomycet
a nokardií
VLLM0522c (podzim 2019)
Osnova
● acidorezistence
● rod Mycobacterium (TBC, lepra,
mykobakteriózy)
● Actinomyces spp., Nocardia spp.
● úkoly
2/32
Acidorezistence
● vysoký obsah lipidů v buněčné stěně
– vysoce hydrofobní
– tvoří fosfolipidy, glykolipidy a lipoproteiny
– mykolové kyseliny
● obtížná barvitelnost (hydrofilními) organickými
barvivy (nebarví se Gramovým barvením)
● odolnost ke kyselinám (využití při Ziehl-Neelsenově
barvení), zásadám (využití při kultivaci) i alkoholům
● typická pro mykobakterie
● částečně pozorováno u aktinomycet a nokardií
3/32
Acidorezistence (2)
4/32
Rod Mycobacterium
● G+ nepohyblivé, nesporulující, aerobní
● dlouhá generační doba → kultivace až v řádu týdnů
● acidorezistence, alkalirezistence
● přežívání uvnitř makrofágů (hlavní roli má buněčná
imunita → minimum protilátek)
● odolné k vyschnutí a dezinfekčním látkám (nestačí
spektrum A; T = TBC, M = atypické mykobakterie)
● M. tuberculosis – TBC
● M. leprae – lepra (malomocenství)
● M. bovis; M. bovis BCG (očkovací kmen)
● atypické mykobakterie
5/32
Tuberkulóza (TBC)
● Mycobacterium tuberculosis (bacil Kochův, BK),
vzácně M. bovis
● obvykle vstup přes plíce (vzácně přes GIT nebo ránou)
● vznik primárního komplexu (zánětlivé ložisko v
plicním parenchymu, zánět a zvětšení příslušné
regionální mízní uzliny) → buněčná imunita → hojení
fibrotizací nebo kalcifikací
● spontánní celkové zhojení
● ložiska infekce (granulomy neboli tuberkly)
kaseifikují (latentní forma) → jádro se rozpadne a
zkapalní → infekční obsah se uvolňuje to bronchů
→ vykašlávání (otevřená TBC)
● šíření krví (inf. kteréhokoli orgánu) – miliární TBC
6/32
Postprimární TBC
● za několik týdnů až mnoho let po primární infekci
(reaktivace primární infekce, někdy superinfekce)
● reaktivace po opakované infekci mykobakteriemi,
progrese primární infekce např. po těžké respirační
infekci, u oslabených jedinců (stáří, alkoholici,
imunokompromitovaní)
● otevřená TBC
– kašel, hemoptýza
(chrchlání krve),
zvýšená teplota,
hubutí
– někdy bezpříznaků
7/32
Léčba TBC
● vždy kombinace antituberkulotik (vznik rezistence)
● 1. řada: izoniazid, rifampicin, pyrazinamid,
etambutol, streptomycin
● 2. řada: amikacin, kanamycin, capreomycin, ofloxacin,
ciprofloxacin, cykloserin, rifabutin, …
● MDR (multidrug-resistant): izoniazid a rifampicin
● XDR (extensively drug-resistant): izoniazid, rifampicin,
fluorochinolony, amikacin/kanamycin/capreomycin
● léčba 4 až 12 měsíců:
– iniciální: čtyřkombinací po 2 měsíce (snížení množ.)
– pokračovací: dvojkombinací (sterilizace ložiska)
8/32
Očkování proti TBC
● donedávna povinné očkování novorozenců živou
vakcínou BCG (kalmetizace, bacille Calmette-Guérin)
– připraveno z kmene M. bovis pasážováním
● donedávna povinné přeočkování při negativním výsledku
kožního tuberkulinového testu
● 2010 – plošné očkování zrušeno → selektivní očkování
– povinně očkovaní jen ohrožení novorozenci
(např. předchozí výskyt v rodině, rodiče udávají delší
pobyt v zemích se zvýšenou incidencí TBC)
– ve vzácných případech defektu imunity docházelo po
kalmetizaci ke generalizované infekci očkovacím
kmenem
9/32
asd
● asd
10/32
asd
● asd
11/32
asd
● asd
12/32
Lepra (malomocenství)
● Mycobacterium leprae (Hansenův bacil)
● extrémně dlouhá generační doba (cca 2 týdny),
inkubační doba několik let
● růst při nižší teplotě (30 °C) → okrajové části těla
● často bez příznaků, málo nakažlivá (kromě kožní formy s
vředy)
● může se vyvinout destruktivní forma (napadá
Schwannovy bb. a makrofágy v PNS, ničí imunitní bb.)
● neexistuje vakcína, ale ochranný účinek má očkování
proti tuberkulóze
● léčba: dapson + rifampicin + clofazimin (měsíce až léta)
13/32
Lepra (projevy)
14/32
léze na končetinách
vředy a nekróza na tváři
(facies leontina)
Atypická mykobakteria
● podmíněně patogenní (tzv. mykobakteriózy)
● rezistentní na řadu antituberkulotik
● M. avium komplex (M. avium ssp. avium, M. avium
ssp. paratuberculosis, M. intracellulare)
– lymfadenitidy, plicní procesy podobné TBC
● M. kansasii, M. xenopi (plicní infekce)
● M. marinum – kožní léze (fish tank granuloma,
swimming pool granuloma)
● M. ulcerans – burulský vřed
● M. smegmatis – nepatogenní, součást mikroflóry
15/32
Přímý průkaz TBC
● mikroskopie: Ziehl-Neelsenovo barvení
(dle Kinyouna)
● kultivace: speciální vaječné půdy (moření louhem
kvůli usmrcení ostatních bakterií)
● automatická kultivace: kultivace v automatech, které
detekují pozitivitu dříve
● biochemické rozlišení: pouze specializované laboratoře
● pokus na zvířeti: morče (na ústupu)
● PCR diagnostika: nabývá na důležitosti
16/32
Nepřímý průkaz TBC
● tvorba protilátek je minimální (pozitivní nález je
známkou infekce, negativní nález nemá hodnotu)
● testování buněčné imunity
● kožní (tuberkulinový) test dle Mantouxové
– testování po vakcinaci
– pozitivní nález: mírné zarudnutí a zatvrdnutí v okolí
místa vpichu po 3 dnech
● test uvolňování INFγ (reakce pacientových buněk na
antigen) – test QuantiFERON-TB
17/32
QuantiFERON-TB
● vyšetření indukovaného uvolňování INFγ
● při TBC (i latentní) tuberkulózní antigeny aktivují
T-lymfocyty, které tvoří velké množství INFγ
● odebírá se nesrážlivá (heparinizovaná) krev do tří
zkumavek:
– 1. zkumavka: obsahuje mitogen (MIT)
phytohemagglutinin – zde by mělo dojít ke stimulaci
tvorby INFγ vždy (kromě nedostatku/snížené aktivity
lymfocytů)
– 2. zkumavka: obsahuje antigeny TBC (TB) – ke
stimulaci tvorby INFγ dojde při infekci TBC
– 3. zkumavka: pro odečet pozadí (NIL)
(nespecifický INFγ, heterofilní protilátky)
18/32
QuantiFERON-TB - hodnocení
● pozitivní: ve zkumavce TB T-lymfocyty reagují na
stimulaci antigenem, ve zkumavce NIL (pozadí)
nedochází k tvorbě interferonu
● negativní: T-lymfocyty reagují na stimulaci mitogenem
(MIT) ale nereagují na stimulaci antigenem
mykobakterie (TB)
● neurčitý výsledek: T-lymfocyty nereagují na stimulaci
mitogenem (MIT) nebo ve zkumavce NIL (pozadí)
dochází k tvorbě interferonu
19/32
Actinomyces spp.
● anaerobní vláknité grampozitivní bakterie (částečně
acidorezistentní → špatně se barví Gramovým barvením)
● běžně v dutině ústní, nosohltanu, střevě, vagině, …
→ endogenní nákazy
● aktinomykóza (A. israeli, A. naeslundi)
– cervikofaciální, intrathorakální, abdominální,
kožní, děložní
– abscesy (chronické podkožní
abscesy) a píštěle
● osteomyelitida (A. israeli)
20/32
Nocardia spp.
● G+ aerobní tyčky až vlákna, častečne acidorezistentní
● půdní bakterie (subtropy, tropy) → exogenní nákazy
● chronické kožní abscesy
● N. asteroides - plicní infekce (možná diseminace,
mozkové abscesy)
● N. brasiliensis
(podkožní abscesy)
21/32
Úkol 1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie
● barvení dle Ziehl-Neelsena
– barvíme karbolfuchsinem (Gabbet) za horka až do
výstupu par (po odpaření části barviva ho
doplníme a opět zahříváme, opakujeme celkem 3x)
– zahřívání provádíme v dostatečné vzdálenosti, aby v
průběhu neprasklo podložní sklíčko)
– odbarvujeme cca 15 sekund kyselým alkoholem
(směs ethanolu s HCl nebo H2SO4), opláchneme
vodou
– dobarvujeme pozadí malachitovou zelení nebo
metylénovou modří cca 30 sekund
– barvení lze použít i pro střevní kokcidie
(kryptosporidia a cyklospory)
22/32
Úkol 1a+b: Barvení dle
Ziehl-Neelsena, mikroskopie (2)
23/32
Úkol 1c: Mikroskopie kmenů
aktinomycet a nokardií (Gram)
24/32
aktinomycety – větvení
ve variabilní úhlu
nokardie – časté větvení
v pravém úhlu
Úkol 2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií
● M. tuberculosis:
● před kultivací moření louhem
● tekuté půdy: Šulova, Baničova (nárůst na dně
zkumavky – modrý/bílý
● pevné půdy: Ogawova či LöwensteinJenssenova
(půdy neobsahují agar – tuhost
dodává vaječný bílek)
● pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají
zátkou (vyschnutí půdy při dlouhé kultivaci)
● odečítání výsledků: za 1 týden (kontrola
kontaminace) 3 (rychle rostoucí mykobakterie),
6 (obvykle pozitivní nálezy) a 9 (pomalu rostoucí
mykobakterie) týdnů kultivace
25/32
Úkol 2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (2)
26/32
růst na pevné půdě
Úkol 2: Kultivace mykobakterií,
aktinomycet a nokardií (3)
27/32
aktinomycety – nepravidelné kolonie
s lalůčky a výběžky
nokardie – nepravidelné
kolonie, suchý vzhled
Úkol 3a+b: Určení citlivosti na
antimikrobiální látky
● kombinace tří čtyř antituberkulotik (rychlý vznik
rezistencí, některá působí jen intracelulárně nebo
extracelulárně)
● nelze používat difúzní diskové testy
● antituberkulotika přidáváme přímo do (pevné) kultivační
půdy + zařadíme kontrolu růstu
● mykobakterium roste: rezistentní
● mykobakterium neroste: citlivé
● odečtěte difúzní diskový test pro kmeny Nocardia a
Actinomyces
28/32
Úkol 4: PCR v diagnostice TBC
29/32
Úkol 5: Diagnostika lepry
● pásovec devítipásý
● lepromin
– antigen z usmrcených
bakterií M. leprae
– získávaný z tkání
infikovaných lidí
nebo pásovce
● leprominový test
– kožní test (obdoba tuberkulinového testu u TBC)
30/32
Úkol 6: Nepřímý průkaz TBC
pomocí QUANTIFERON©-TB Gold
● pokuste se interpretovat výsledky testů u pacientů
(hodnoty uvedeny v IU/ml)
31/32
NIL TB mínus NIL MIT mínus NIL Konečná
interpretace
testu
Přítomnost
infekce
M. tuberculosis
≤ 8,0 < 0,35 ≥ 0,5 negativní Nepravděpodobná
≥ 0,35 jakákoli
hodnota
pozitivní Pravděpodobná
< 0,35 < 0,5 nejistá Nelze určit
> 8,0 jakákoli
hodnota
jakákoli
hodnota
Nelze určit
Po tomto cvičení byste měli umět:
● vysvětlit co je to acidorezistence a jak se projevuje
● popsat zástupce acidorezistentních bakterií vč.
diagnostických postupů, které vedou k úspěšné
identifikaci
● zhodnotit význam přímých a nepřímých metod v
diagnostice acidorezistentních bakterií vč. vhodnosti
jejich použití pro konkrétní případy
32/32