P13 Klinická mikrobiologie IV Infekce ran a krevního řečiště, biofilm na cévních katetrech Bi7170c (podzim 2019) Osnova ● infekce ran + úkoly ● infekce krevního řečiště + úkoly ● průkaz mikrobů kolonizující cévní katetry + úkoly ● udělení zápočtů 2/45 Infekce ran ● nesourodá skupina (různý původ a lokalizace) ● závažné případy (mikroby pronikly přes tělní povrch na místa normálně sterilní) ● hnisavé infekce ran: – bakteriální infekce rány doprovázena infiltrací polymorfonukleárních granulocytů (odpovědi IS) – hnis = tekutina obsahující odumřelé leukocyty, bakterie (živé i mrtvé), rozkládající se tkáň, aj. ● hnisavá povrchová zranění (S. aureus, β-hemolytické streptokoky) ● těžká poranění (hrozí klostridiové anaerobní infekce, tetanus) 3/45 Infekce ran (2) ● infekce operační rány: – SSI – surgical site infection – „infekce v místě chirurgického výkonu“ – S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes – kolorektální chirurgie: Enterobacteriaceae, ananeroby (B. fragilis, porfyromonády, prevotely, peptostreptokoky) – vzrůstá zastoupení C. albicans – prevence a léčba jedním z důležitých témat pro chirurgy 4/45 Infekce ran (3) ● poranění ve vodě: – sladká voda: pseudomonády, aeromonády – slaná voda: halofilní vibria, atypické mykobakterie ● popáleniny: velmi snadná infekce (P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes, aj.) ● infekce po pokousání: – člověkem: příslušníci normální ústní mikroflóry (aerobní i anaerobní) a S. aureus – zvířetem: psi a kočky (nejčastěji stafylokoky a pasteurely), počítat s možností přenosu vztekliny 5/45 Úkol 1: vzorky u infekcí ran ● odebírající lékař (sestra) musí vždy pečlivě vyplnit žádanku, nestačí „stěr z rány“ ● nutno specifikovat: – typ (původ) rány – operační rána, rána po pokousání, bodná rána apod. – lokalizaci rány na těle – důležité anamnestické údaje (návrat ze zahraničí, práce v zemědělství) – případně i požadovaná speciální vyšetření 6/45 Úkol 1: vzorky u infekcí ran (2) ● hluboké ložiskové infekce: – hnis či jiná tekutina v ložisku v dostatečném množství (výpotek, obsah cysty apod.) má přednost před stěrem – u podezření na anaerobních infekci (zejména hnis z dutiny břišní) zaslání ve stříkačce (uzavření stříkačky tzv. kombi zátku (na obrázku) – nezasílat stříkačky s jehlou zabodnutou do sterilní gumové zátky (dřívější doporučení, opuštěno z bezpečnostních důvodů) 7/45 Úkol 1: vzorky u infekcí ran (3) ● hluboké ložiskové infekce: – není-li možno poslat tekutinu (je nedostatek tekutiny), bezpodmínečně nutné použití soupravy s transportní půdou – v poslední době tzv. E-swaby – v některých případech je také vhodný nátěr, případně otisk tkáně na sklíčko (zachytí se i patogeny, které se nepodařilo vypěstovat) – v zvláště závažných případech může chirurg přizvat mikrobiologa i přímo na operační sál 8/45 E-swab (1) ● sterilní a obsahuje dvě části: – polypropylénovou šroubovací zkumavku s kapalným Amiesovým transportním médiem – tampon pro vlastní odběr vzorku ● tampon zakončen nástřikem měkkých nylonových vláken ● vyráběn technologií nástřiku rovnoběžně orientovaných nylonových vláken v elektrostatickém poli (není to námotek jako u klasických souprav) ● mikroorganismy jsou při odběru aktivně zachyceny elektrostatickými silami (u klasického odběru jen pasivně ulpívají v námotku) 9/45 E-swab (2) ● obsahuje tekuté Amiesovo médium bez aktivního uhlí ● lze použít i na PCR (neobsahuje nic, co by mohlo inhibovat amplifikaci) 10/45 Odběry u povrchových ran ● klasická metoda: stěr odběrovou soupravou s transportní půdou (kvalitativní) – odebírat tak, aby byl zachycen předpokládaný patogen (je potřeba se dostat až k ložisku infekce) – nekontaminovat vzorek okolní mikroflórou, zejména z kůže ● otisková metoda: – na ránu plošného charakteru (např. diabetický vřed) přiložit čtvereček sterilní gázy – přenést na kultivační půdu (krevní agar) – v laboratoři se přenese i na další půdy – semikvantitativní vyhodnocení (počet/plocha) 11/45 Úkol 2: Otisk – provedení ● chirurg obdrží sterilní kultivační půdu a čtvereček o rozměrech 25 cm2 12/45 Úkol 2: Otisk – provedení (2) ● chirurg nebo sestra přemístí čtvereček do rány tak, aby se všude dotýkal (ponechá ho tak 10 sekund až minutu) 13/45 Úkol 2: Otisk – provedení (3) ● čtvereček se přemístí zpět na půdu 14/45 Úkol 2: Otisk – vyhodnocení ● v laboratoři je filtrační papír s otiskem umístěn na dvě nebo tři další kultivační půdy ● vyhodnocení po 24 hodinách ● určují se mikroby (zejména s využitím média URI) ● kromě identifikace kolonií také kvantifikace (počet CFU/25 cm2) 15/45 Diagnostika infekcí ran ● výtěry: – v ráně není žádná „běžná flóra“ – využíváme větší množství půd (odhalení širší škály patogenů) ● KA, ENDO, KA s NaCl (stafylokoky), KA s amikacinem (streptokoky a enterokoky) ● pomnožovací tekuté půdy (v ráně může být jen menší množství mikrobů) ● tekuté vzorky: – mikroskopie (mikroby, množství leukocytů apod.) – pomnožovací tekuté půdy, selektivní půdy 16/45 Výtěr z rány: diagnostické schéma ● podle okolností se může v praxi lišit ● Den 0: pouze nasazení kultivací ● Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, Endo, KA s 10 % NaCl a KA s amikacinem – v případě negativity všech pevných půd se prohlíží bujón (je-li zakalený, vyočkuje se, tzv. subkultivace) ● Den 2: expedice všech negativních a mnohých pozitivních výsledků – pro komplikace, rezistence apod. zdaleka ne všech ● Den 3: expedice dalších pozitivních výsledků 17/45 Výtěr z rány: interpretace ● běžná flóra: žádná není (vše se považuje za možného patogena) ● patogen je v podstatě jakákoli bakterie nebo kvasinka (výjimka koagulázanegativní stafylokoky a korynebakteria u povrchových kožních ran) ● kolonizace: u povrchových ran může jít o kolonizaci (hlavně pseudomonáda a proteus) – kritická kolonizace: rána, která se nehojí z důvodu mikrobiálního množení, zároveň však bez napadení tkáně nebo zjevné imunitní odpovědi pacienta ● laboratoř testuje citlivost na ATB všech nálezů 18/45 Léčba hnisavých infekcí ● vždy lokální ošetřování rány (lokální aplikace různých preparátů, pravidelné čištění a převazování, podpora hojení, odstraňování nekróz – možností je zde i larvoterapie) ● nepředpokládáme-li anaeroby, je nejvhodnější naslepo k celkové léčbě oxacilin (klasické protistafylokokové antibiotikum) ● pravděpodobný streptokokový původce, lékem volby klasický penicilin ve vysokých dávkách ● u nemocničních nákaz nutná cílená léčba 19/45 Úkol 3: Vyhodnocení kultivace z hlubší rány ● vyhodnoťte výsledky kultivace, vezměte v potaz anamnézu ● oxidázový test bude na bočním stole 20/45 Přítomnost mikrobů v krvi ● přítomnost bakterií v krvi za normálních okolností přechodná (transientní bakteriémie např. při čištění zubů) ● infekce krevního řečiště (IKŘ) zpravidla pro bakteriální, případně mykotické (kvasinkové) infekce ● bakteriémie: přítomnost bakterií v krvi (bez dalšího hodnocení klinického významu) ● virémie (přítomnost virů v krvi): součástí různých virových onemocnění (zejména hepatitidy a HIV) ● krevní paraziti: malarická plasmodia, trypanosomy a filárie (vlasovci) 21/45 Bakteriální infekce krevního řečiště ● bakteriémie jako spouštěcí mechanismus sepse ● produkty mikroorganismů interagují s IS → SIRS ● SIRS (syndrom systémové zánětlivé odpovědi) – zánětlivá odpověď organismu na infekční nebo neinfekční podnět ● sepse = SIRS + infekce – primární (tyfus) – sekundární (katetrové, urosepse, abdominální sepse) – subaktutní bakteriální endokarditidy (sepsis lenta) 22/45 Diagnostika sepse ● komplexní vyšetření: – biochemická: zánětlivé ukazatele (CRP, prokalcitonin, diferenciální krevní obraz) známky diseminované intravaskulární koagulopatie (trombocytopenie, snížení antitrombinu III, apod.) – fyzikální: RTG srdce a plic, ORL vyšetření, jícnový ultrazvuk (pro ložiska na srdci), CT – neurologické – mikrobiologické ● hemokultury další mikrobiologický materiál (katetry, moč, sputum, lumbální punkce, atp.) 23/45 Hemokultura – odběr krve ● hemokultura = kultivační vyšetření krve na přítomnost bakterií (kvasinek) ● nesrážlivá (!) krev (prokazujeme živé mikroby, nikoliv antigeny nebo protilátky jako v sérologii) ● odběr do speciálních lahviček s transportně-kultivačním médiem pro automatickou kultivaci ● nutno zabezpečit tak, aby se minimalizovalo riziko pseudobakteriémie (falešně pozitivní výsledek) ● u dospělých se odebírá 20 až 30 ml krve, u dětí zpravidla 1–5 ml podle věku (odběr náročnější než u dospělých, u dětí má význam i méně bakterií) ● nutné vyznačit čas a místo odběru (!) 24/45 Úkol 4: druhy hemokultivačních nádobek ● různé typy podle toho, které mikroby mají být především zachyceny (aerobní, anaerobní, kvasinky) ● některé nádobky s aktivním uhlím (určeny zejména ke kultivaci krve pacientů, kterým jsou již nasazena ATB), aby se snížilo procento falešně negativních výsledků (ATB by potlačilo růst) ● nejběžnější nádobky: – aerobní standardní – aerobní s aktivním uhlím – anaerobní s aktivním uhlím ● nutné vyznačit čas a místo odběru (!) 25/45 Příklady nádobek na hemokultivaci 26/45 BACTECBacT/ALERT Automatické kultivátory ● kultivátor napojený na počítač ● automatický udržuje optimální podmínky kultivace ● vyhodnocuje stav nádobky a indikuje případný růst (např. změna reflektance, tj. optických vlastností lahvičky) ● růst je zvukově a opticky signalizován ● pokud ani po týdnu nic neroste, signalizuje negativní výsledek 27/45 Automat na hemokultury 28/45foto: O. Z. Automat na hemokultury (2) 29/45foto: O. Z. Princip automatického kultivátoru BACTEC 30/45 Pseudobakteriémie – příčiny ● pseudobakteriémie = falešně pozitivní výsledek ● nevhodně provedený odběr (nedodržení zásad asepse) ● odběr pouze ze zavedených vstupů (záchyt bakterií kolonizujících příslušný vstup – nemusí být skutečným původcem bakteriémie) ● důsledek: pacient je zbytečně léčen pro neexistující infekci nebo pro infekci jiným druhem mikroba → zastaveno hledání skutečného patogenu 31/45 Kontaminace katetrů a implantátů ● při podezření na kontaminovaný cévní katetr se mění ● starý katetr poslat bakteriologii ● existují metody schopné odhadnout, zda jde o skutečné osídlení katetru či náhodný nález ● platí pro jakékoli implantáty, které se vyjímají z těla – jejich mikrobiologické vyšetření může přinést podstatnou informaci pro další léčbu 32/45 Pseudobakteriémie – protiopatření ● odebírat cíleně, když je přítomnost bakterií v krvi pravděpodobná (neodebírat, když je indikováno jiné vyšetření) ● odebírat v dostatečné kvantitě: jedna hemokultura nemá dg. význam, dvě mají malý význam, tři jsou optimum ● odebírat z vhodných míst: nejméně jednu z nové venepunkce (ideálně tři venepunkce a odběr z žilního katetru) ● odebírat ve vhodnou chvíli, u septických stavů typicky při vzestupu teploty ● asepse + správná nádobka + správně vyplněná průvodka (čas a místo odběru) 33/45 Rozpoznání pseudobakteriémie ● typické znaky pseudobakteriemie (falešná pozitivita hemokultury) – pozitivní jen některé ze tří hemokultur – pozitivní všechny, ale z každé vyroste jiný kmen (různý vzhled kolonií na půdách, různá ATB citlivost) za různě dlouhou dobu (odpovídá různé kvantitě; normální rozmezí do 5–6 hodin) – klinické potíže pacienta neodpovídají nálezu – stejný kmen se najde i na kůži pacienta 34/45 Posouzení času pozitivity ● TTD = time to detection (čas do pozitivity) ● čas od odběru do okamžiku, kdy automat hlásí pozitivitu ● kratší v případě masivní přítomnosti bakterií v krvi a delší tehdy, když je bakterií málo ● u skutečných bakteriémií je čas většinou kratší (do 48 hodin) a u všech odebraných hemokultur přibližně stejný ● může být kratší u hemokultury z místa, které je zdrojem infekce (například hemokultura z CVK, když tento CVK je zdrojem katetrové sepse) ● nelze vyhodnotit bez času a místa odběru (!) 35/45 Pozitivní hemokultura ● lahvička vyjmuta z přístroje ● nutno zaevidovat čas, resp. dobu od příjmu do pozitivity (čím delší doba, tím pravděpodobnější je kontaminace) ● vyočkování na pevné půdy a nátěr na sklo barvený Gramem ● orientační diskový test citlivosti na ATB podle výsledků Gramova barvení (místo standardní suspenze se použije přímo tekutina z lahvičky → pouze orientační výsledky) ● další den vyšetření citlivosti na ATB kvantitativní metodou (mikrodiluční test, už máme standardní inokulum) 36/45 Úkol 5, 6 a 7: Hemokultury ● úkolu 5: prohlédněte si výsledek hemokultury v mikroskopu, popište bakterie (G+, G-, koky, tyčinky, popsat jejich uspořádání) ● úkolu 6: popište výsledky kultivačních testů, vyhodnoťte výsledky předběžného testu na ATB (kvantitativní testování citlivosti na ATB mikrodiluční metodou nebudeme ve cvičení provádět) ● úkol 7: pokuste se vhodně interpretovat vzorky hemokultur (soustřeďte se nejen na nalezený patogen, ale i na TTD a místo, kde byla krev odebrána) 37/45 Úkol 7: Interpretace nálezů ● Jan Bílý: – odebraly se tři hemokultury, všechny jsou pozitivní, všechny po zhruba stejném čase po odběru (10/13/13,5 h), kmeny vypadají podobně, je pravděpodobné, že nález je skutečným patogenem – vzorek krve s kratším časem (10 h) byl odebrán z centrálního žilního katetru – to by nás mohlo vést k domněnce, že právě tento katetr je zdrojem infekce 38/45 Úkol 7: Interpretace nálezů (2) ● Jakub Černý: – odebraly se tři hemokultury, všechny jsou pozitivní, avšak jedna po 8 hodinách, druhá po 26 hodinách a třetí po 38 hodinách – kmeny jsou fenotypově odlišné (včetně různých antibiogramů), dokonce patří k různým druhům stafylokoka, je velmi pravděpodobné, že jde o kožní kontaminanty 39/45 Průkaz mikrobů kolonizujících katetry ● kvalitativní pomnožení v bujonu: – citlivé (prakticky 100%), ale nelze rozlišit kolonizaci od kontaminace (proto se metoda nedoporučuje) – negativní výsledek vylučuje kontaminaci ● semikvantitativní metoda (Makiho metoda): – katetr je válen po povrchu agaru sterilní pinzetou – pro krátce zavedené katetry (vnější kolonizace) – pro déle zavedené katetry není vhodná (kolonizovány zevnitř → falešně negativní výsledky) – kolonizace při >15 koloniích 40/45 Průkaz mikrobů kolonizujících katetry (2) ● sonifikační metoda: – katetry sonifikovány v ultrazvukové vaně – uvolněné bakterie kvantifikovány vyočkováním na KA, zjišťuje se počet CFU – hranice pozitivity: >100 (1000) CFU 41/45 Úkol 8: průkaz mikrobů kolonizujících katetry ● porovnejte jednotlivé metody a rozhodněte o možné kolonizaci katetru ● kvalitativní metoda ● semikvantitativní metoda ( >15 CFU) ● sonifikace katetru (>100 CFU) 42/45 Eradikace biofilmů, citlivost k ATB ● ATB léčba často potlačí pouze symptomy infekce způsobené buňkami uvolněnými z matrix biofilmu ● buňky uložené v matrix biofilmu není schopna zasáhnout ● k eradikaci biofilmu je možno využít vysokých koncentrací ATB či jejich kombinací (např. ATB zátka katétru), pokud léčba selhává, je nutno vyjmout ložisko biofilmu ● hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro daná antibiotika (tzn. bakterie jsou k nim rezistentní) ● hodnoty MBEC zpravidla několikanásobně vyšší než MIC 43/45 PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN Kontrola růstu Úkol 9: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k ATB ● zákal/žluté důlky znamenají růst mikrobů ● odečtěte hodnoty MIC (planktonická forma) a MBEC (biofilm) ● porovnejte hodnoty mezi sebou 44/45 Po tomto cvičení byste měli umět: ● vysvětlit diagnostické postupy infekcí ran a krevního řečiště, vč. správného odběru materiálu ● vysvětlit postup při kultivaci hemokultur, vysvětlit detailně pojem pseudobakteriémie ● popsat možnosti zpracování kolonizovaného katetru ● porovnat hodnoty MIC a MBEC pro planktonickou formu bakterií resp. pro biofilm, vysvětlit důsledky pro léčbu 45/45