P14
Opakování
VLLM0522c (podzim 2019)
Základní informace
● student si vytáhne jeden z 60 úkolů
● ke každému z praktik jarního a podzimního
semestru přináleží cca dva až čtyři úkoly
● některé úkoly náležejí k více praktikům (např. ASLO
k neutralizaci i ke streptokokům)
● některé informace nejsou přímo součástí zadání úkolů,
nicméně studenti na ně mohou být tázáni
2/74
J01: Mikroskopie
● znát principy optické mikroskopie (světelné pole
i tmavé pole)
● znát přípravu mikroskopických preparátů:
– kmene
– vzorku
– nativního preparátu
– barveného preparátu:
● Gramovo barvení
● Ziehl-Neelsen
● barvení pouzder dle Burriho
3/74
J01: Příprava mikroskopického
preparátu
vzorek
● tekutý vzorek na podložní
sklíčko kápneme
● nátěr na špejli buď
rozmícháme ve
fyziologickém roztoku, nebo
(pouze u barvených
preparátů) přímo natřeme
na sklíčko
4/74
kmen
● kápneme na podložní
sklíčko kapku fyziolog.
roztoku
● vyžíháme mikrobiologickou
drátěnou kličku v plameni
● po zchladnutí (!)
nabereme trochu hmoty
bakterií
● hmotu rozmícháme v
připravené kapce
J01: Mikroskopie vzorku a kmene
5/74
Foto: O. Zahradníček
J01: Příprava nativního preparátu
● kapku, ve které je vzorek či rozmíchaný kmen,
nesušíme
● přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme
objektivy, které zvětšují např. 4×, 10× či 40×.
● nepoužíváme imerzní olej (!)
6/74
J01: Gramovo barvení
7/74
Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní
Krystal. violeť obarví se fialově obarví se fialově
Lugolův roztok vazba se upevní upevní se méně
Alkohol neodbarví se odbarví se
Safranin zůstanou fialové obarví se červeně
J01: Gramovo barvení (2)
● krystalová violeť: (20 –) 30 sekund
● (opláchnout vodou – lze vynechat)
● Lugol. roztok: (20 –) 30 sekund
● (opláchnout vodou – lze vynechat)
● alkohol: do viditelného výstupu barviva
(cca 15 – 20 sekund)
● opláchnout vodou – nezbytné!!!
● safranin: 60 sekund
● opláchnout vodou
● osušit filtračním papírem (stačí papír z obou stran
přiložit)
8/74
J01: Barvení pouzder dle Burriho
● v barvení dle Burriho
byly nabarveny bakterie
na červeno a pozadí
dobarveno tuší
● mikroskopista pak tuší
pouzdro tam,
kde se nic neobarvilo
9/74
pathmicro.med.sc.edu
J02: Kultivace bakterií
● znát nejdůležitější půdy v klinické mikrobiologii
a jejich charakteristiku
● umět přeočkovat bakteriální kulturu z jedné pevné
půdy na jinou
10/74
J02: Půdy v klinické mikrobiologii
11/74
Název Druh Barva Typ Bakterie
bujon tekuté půdy nažloutlá pomno-
žovací
aeroby
VL-bujon anaeroby
selenitový
bujon
selektivně
pomnož.
salmonely
Sabouraudův
agar
pevné půdy
ve
zkumavce
skoro
bezbarvá
selektivní* houby
Löwentein-
Jensen
bílá až velmi
světle
zelená
obohacená mykobakteria
(pův. TBC)
krevní agar pevné půdy
v misce
červená obohacená
diagnostická
většinu bakterií
Endova
půda
růžová selektivně
diagnostická
především
enterobakterie
J02: Půdy v klin. mikrobiologii (2)
12/74
Název Druh Barva Typ Bakterie
MH pevné půdy
na Petriho
miskách
skoro
bezbarvá
speciální atb citlivost
NaCl červená
-hnědá
selektivní stafylokoky
VL-agar červená jako KA anaeroby
XLD (a blízký
MAL)
oranžová selektivně
diagnostická
salmonely
čokoládový
agar
hnědá obohacená hemofily,
neisserie
Levinthalův
agar
nažloutlá obohacená hemofily
Slanetz-
Bartley
světlounce
růžová
selektivně
diagnostická
enterokoky
J02: Přeočkování agarové kultury
● vyžíhejte kličku
● naberte kmen (pouze teď,
nikdy znovu v dalších krocích!)
● naočkujte první úsek
● vyžíhejte kličku
● rozočkujte druhý úsek
● vyžíhejte kličku
● rozočkujte třetí úsek
● vyžíhejte kličku
● rozočkujte „hádka“
13/74
J02: Přeočkování agar. kultury (2)
● důležité poznámky:
– zapomíná se na vyžíhání mezi jednotlivými kroky
– zapomíná se na to, že čáry se musí křížit
– nehodnotí technická dokonalost čar
– jde o pochopení (a případně i vysvětlení) principu
křížového roztěru, ne o dokonalé technické
provedení
14/74
J03: Biochemické identifikace
bakterií
● umět provést katalázový test, testy s
diagnostickými proužky (oxidáza, PYR, INAC)
a vědět v jakém případě se použijí (tedy význam
pro diagnostiku)
● umět použít Hajnovu půdu k odlišení fermentujících
a nefermentujících tyček
● umět odečíst biochemické testy typu ENTEROtest
(k úkoly dostanete vše potřebné, určíte druh
mikroorganismu, procento pravděpodobnosti
a index typičnosti)
15/74
J03: Oxidázový test
● filtrační papírek na diagnostickém proužku napuštěný
příslušným reagens přitiskněte na kolonie
testovaného kmene
● proužek položte do víčka Petriho misky otisknutými
koloniemi nahoru
● POZ = do 30 s intenzivní
modré zbarvení
● OPOŽDĚNĚ POZ = do 2 min
intenzivní modré zbarvení
● NEG = beze změny nebo
modrání až po uplynutí 2 min
16/74
J03: Hajnova půda
● Hajnova půda
– štěpení laktózy (nahoře)
(A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (dole)
(C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S
(POZ = zčernání půdy)
● v případě pozitivity H2S
v podstatě nelze posoudit
fermentaci glukózy!
– tvorba plynu
(POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá
nahoru)
17/74
J03: Vyhodnocení ENTEROtestu
18/74
1 2
H
3
G
4
F
5
E
6
D
7
C
8
B
9
A
10
H
11
G
12
F
13
E
14
D
15
C
16
B
17
A
První řádek panelu Druhý řádek panelu
+                 
–                 
?                 
? + – + + + – – – – – – – – + + + +
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2
5 3 0 0 6 3
ONPG
kmen 530 063 = E. coli; 99,89 % (pravděpodobnost s jakou
je tento kmen opravdu E. coli); Tin=1,00 (míra shody s „ideálním“
kmenem)
J04: Molekulárně biologické metody
● vědět, kdy a jak se používají v mikrobiologii (např.
mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není
vůbec možný)
● mít rámcový přehled o principech, není nutno znát
detaily
● znát interpretaci PCR
19/74
J04: Výsledky PCR s IC
20/74
Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace
negativní pozitivní negativní
negativní negativní inhibice
reakce
pozitivní pozitivní pozitivní
pozitivní negativní (vysoce)
pozitivní
J04: Detekce PCR produktu
21/74
IC
vlastní
reakce
Pacienti P3 a P4 – pozitivní, pacient P2 – negativní,
pacient P1 – inhibice reakce. IK = kontrola, PK = pozitivní
kontrola, NK = negativní kontrola; zcela vlevo ladder
J05: Dekontaminační metody
● znát rozdíl mezi růstovým optimem, inhibiční mezí
(mezí růstu) a baktericidní mezí (mezí přežití)
a možnosti ověření těchto parametrů
– růsti za extrémních podmínek (inhibiční mez)
– po působení extrémních podmínek mikroorganismy
přemístíme do růstového optima (baktericidní mez)
● vyhodnocení účinnosti dezinfekce:
– vyhodnotit, jaká koncentrace dezinfekce je
baktericidní
– zdůvodnit proč je baktericidní a nikoli jen
bakteriostatická (inhibiční)
22/74
J05: Účinnost horkovzdušné
sterilizace
● umět vyhodnotit účinnost horkovzdušné
sterilizace pro rezistentní sporulující bakterie
– 160 °C / 60 minut;
170 °C / 30 minut;
180 °C / 20 minut
23/74
J05: Výběr vhodného
dekontaminačního postupu
● dodatkový úkol k předchozím vyhodnocení dezinfekce
nebo sterilizace
● vytvoření dvojic z předložených lístečků (například
spárovat „sterilizace kovu, který nesnese vlhké teplo“
a „horkovzdušná sterilizace“)
24/74
J06: Antimikrobiální látky
● znalost kvalitativních i kvantitativních testů:
– difúzní diskový test
– E-test (znát teoreticky)
– mikrodiluční test
– betalaktamázy (běžné i širokospektré jako ESBL
a ampC) (znát teoreticky)
25/74
J06: Difúzní diskový test
26/74
Žádná zóna:
Mikrob je
rezistentní
Zóna je větší než
hraniční: Mikrob
je citlivý
Zóna existuje, ale je menší než
hraniční: Mikrob je rezistentní
J06: E-test
● kvantitativní test
● princip podobný difúznímu
diskovému testu
● místo disku proužek
● v proužku stoupající koncentrace
ATB od jednoho konce ke druhému
● zóna není kruhová, ale vejčitá
● na papírku je stupnice – jednoduché
odečítání
27/74
Mikrodiluční test
28/74
Foto O. Z.
sada antibiotik
koncentraceantibiotika
MIC
J07: Vliv přítomnosti sacharidů na
dynamiku růstu biofilmu
● úkol odečíst jako v praktiku, včetně vytvoření grafu
● posuďte vliv příjmu různého množství sacharidů ve
stravě na rychlost tvorby biofilmu u kariogenního druhu
Streptococcus mutans
● jaké závěry vyplývají z tohoto pokusu ohledně množství
sacharidů ve stravě, délce jejich setrvání v dutině ústní
apod.?
29/74
J07: Vliv přítomnosti sacharidů na
dynamiku růstu biofilmu (2)
● vyplňte přibližný průměr hodnot absorbance do tabulky
a sestrojte prostorový graf; učiňte závěr o množství
přidané glukózy a růstu biofilmu S. mutans
30/74
J07: Citlivost biofilmpozitivních
mikrobů k ATB
● MIC neodpovídá koncentracím antimikrobiálních látek
schopných zasáhnout biofilm
● MBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace
● MBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace
● zvýšená odolnost se týká dezinfekčních
i antimikrobiálních látek
● hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro
daná antibiotika (bakterie jsou k nim rezistentní)
● rozdíly v citlivosti (MBEC vs. MIC) až několik řádů
31/74
PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN
Kontrola
růstu
J07: Citlivost biofilmpozitivních
mikrobů k ATB (2)
● zákal/žluté důlky
znamenají růst mikrobů
● odečtěte hodnoty MIC
(planktonická forma) a
MBEC (biofilm)
● porovnejte hodnoty
mezi sebou
● vysvětlete princip
metody
32/74
J08 – J10: Serologie
Přímé vs. nepřímé metody
přímé
● hledáme mikroba, jeho
část či jeho produkt
(produktem může být
například nějaký bakteriální
antigen či jed – toxin)
● agens je přítomno nyní
33/74
nepřímé
● hledáme protilátky
● protilátka není součástí ani
produktem mikroba
(produkt makroorganismu,
odezvou na činnost mikroba)
● agens bylo přítomno někdy
v minulosti
J08 – J10: Serologie
● umět interpretovat nálezy přímých a nepřímých
metod (titr protilátek, dynamika titru, třídy
protilátek, avidita protilátek)
● znát principy jednotlivých reakcí a vědět jak
vypadají jejich výsledky: precipitace
(mikroprecipitace v agaru), aglutinace, aglutinace na
nosičích, komplementfixační reakce (KFR), neutralizační
reakce (ASLO, HIT, VNT), metody se značenými
složkami (imunofluorescence, ELISA, Western blot),
imunochromatografické testy
● umět provést a vyhodnotit sklíčkovou aglitunaci
(např. průkaz EPEC)
● popsat video aglutinace likvoru (vědět, proč se tu
nikdy neurčují titry, natož IgG a IgM!)
34/74
J08: Aglutinace (demontrace
různých možností provedení)
35/74
J09: KFR (princip reakce)
36/74
J09: ASLO
● zhodnotit význam tohoto testu
● vysvětlit princip
● destička se odečítá naležato, první řádek je pozitivní
kontrola
37/74
J09: HIT
38/74
J10: IMF vs. imunohistochemie
39/74
J10: ELISA
40/74
alkalická fosfatáza
J10: ELISA (2)
● umět vyhodnotit reakci ELISA
● vědět, že destička se odečítá spektrofotometrem
● když dostanete informace, jak určit cut of, být schopni
určit negativní a pozitivní hodnoty a interpretovat
(s ohledem na třídy protilátek)
● ze stavebnice sestavit schéma průkazu HBsAg a
anti-HBs při pozitivním a negativním průběhu reakce
● umět interpretovat nálezy dohromady (u borreliózy
a toxoplasmózy – vyhodnotit dohromady nejen různé
serologické reakce, ale také anamnézu)
● pacient, který nemá protilátky, není „zdravý
pacient“, pokud má potíže!
41/74
J10: Western blot
42/74
J10: Western blot (2)
43/74
medmicro.info
● vzhled proužku s přiloženou šablonou
J10: Imunochromatografické testy
44/74
J11, J12: Virologie
● větší část virologie totožná se serologií
(např. průkaz HBsAg apod.)
● přidané úkoly:
– přímý průkaz viru na vaječných zárodcích
a buněčných kulturách (a na sajících myšatech,
teoreticky)
– znát části oplodněného vejce
– poznat přítomnost cytopatického efektu
– vědět kdy je a kdy není vidět výsledek izolace
viru
– co se dá dělat, pokud výsledek vidět není
(hemaglutinace, hemadsorpce)
45/74
J12: Izolace a kultivace virů
● zvíře se používá dnes již méně často (sající myšata)
● kuřecí zárodek (asi 10 dnů staré embryo):
– pod skořápkou papírová blanka (uzavírá
vzduchovou bublinu)
– na papírovou blanku nasedá
chorioalantoidní
membrána, která
ohraničuje allantoidní
dutinu
– v allantois se vznáší
amniová dutina
s vlastním embryem
– žloutkový vak
46/74
J12: Izolace a kultivace virů (2)
● směry očkování do jednotlivých struktur
47/74
J12: Cytopatický efekt
● buněčná kultura bez a s CPE
48/74
http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/c
ellculture.php?menuID_=122
www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html
J12: Cytopatický efekt (2)
49/74
J12: Cytopatický efekt (3)
50/74
J12: Cytopatický efekt (4)
● swelling and clumping:
– infikované buňky se zvětšují a postupně shlukují do
střapcovitých (hroznovitých) útvarů, nakonec se
odloučí od podkladu
– adenoviry
51/74
J13: Parazitologie
● poznat následující vajíčka a články tasemnice
52/74
roup
(Enterobius
vermicularis)
škrkavka
(Ascaris
lumbricoides)
tenkohlavec
(Trichuris
trichiura)
tasemnice
(Taenia sp.)
J13: Parazitologie
● znát metody diagnostiky střevních parazitů:
– metoda dle Kato (dobarvení pozadí malachitovou
zelení, aby se paraziti zvýraznili )
– Faustova metoda je koncentrační
– Grahamova metoda se používá u roupů
● vědět, že se u tkáňových parazitů často používá
nepřímý průkaz (toxoplazmóza)
– popis pacientů dát dohromady s výsledky serologie
a vyhodnotit
53/74
J14: Mykologie
● zkouší se jako bakterie (viz dále)
● morfologie vláknitých hub (mikroskopie, nakreslit
a popsat)
54/74
J14, P01 – P06: Kvasinky, speciální
bakteriologie
● jednotný typ úkolů: „Z předložených kmenů
vyberte kmen … (např. stafylokoka), blíže určete,
popř. také určete test citlivosti na antibiotika.“
● úkol z větší části teoretický (Gramovo barvení se
provede teoreticky), ale některé části (kataláza,
oxidáza) se mohou provést i prakticky, je-li na to čas
● důležité je znát a dodržet algoritmus – postupovat
od obecného k detailnímu
55/74
J14, P01 – P06: Příklad
diagnostického schématu
56/74
G+ kok
stafylokok streptokok enterokok
streptokok
s viridací
streptokok
s hemolýzou
streptokok
bez hemolýzy
S. pneumoniae
ústní streptokok
S. pyogenes (SAG)
S. agalactiae (SBG)
non-A-non-B streptokok
J14, P01 – P06: Výjimky
● ASLO se zkouší jako serologický úkol, plus znalost
specifického významu tohoto testu (viz u serologie)
● Grampozitivní tyčinky se zkoušejí jinak – student si
prohlíží obrázky G+ tyčinek a má určit, který
obrázek morfologicky odpovídá korynebakteriím a
odpoví na doplňující otázky (např. „co by to mohlo
být, kdyby to nedělalo palisády a rostlo by to při 4 °C?“)
● zvláštní úkoly se také týkají anaerobů (P07),
mykobakterií (P08) a spirochet (P09)
57/74
P03: Corynebacterium
● G+ nesporulující tyčky kyjovitého tvaru, někdy
pleomorfní
● typické uspořádání v palisádách a tzv. havraních
křídlech
58/74
P07: Popis anaerostatu
59/74
vzduchotěsné víčko
palladiový katalyzátor
(pod víčkem)
konstrukce pro
ukládání Petriho misek
generátor anaerobiózy
(sáček s chemikáliemi)
tlakový
ventil
šroubovací
uzávěr
P07: Popis anaerobního boxu
60/74
Mikrobiologický ústav, foto O. Z.
zdroj anaerobních
plynů
prostor pro
vkládání misek
vstupy pro ruce
personálu
P07: Morfologie Clostridium tetani
● G+ tyčka, anaerobní, rovné, štíhlé, terminální
endospora („paličky na buben“)
● poznat na obrázcích od ostatních bakterií
61/74
P07: Anaerobní kultivace, pokus
na zvířeti, imunochromatografie
● pokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu:
– u tetanu se myš svíjí v křeči,
– u botulismu patrné parézy
– u toxinu Clostridium perfringens se pokus na zvířeti
nepoužívá, zde využíváme kultivační průkaz
lecitinázy na žloutkovém agaru
62/74
P08: Barvení dle Ziehl-Neelsena
● barvení dle Ziehl-Neelsena
– barvíme karbolfuchsinem (Gabbet) za horka až do
výstupu par (po odpaření části barviva ho
doplníme a opět zahříváme, opakujeme celkem 3x)
– zahřívání provádíme v dostatečné vzdálenosti,
aby v průběhu neprasklo podložní sklíčko)
– odbarvujeme cca 15 sekund kyselým alkoholem
(směs ethanolu s HCl nebo H2SO4), opláchneme
vodou
– dobarvujeme pozadí malachitovou zelení nebo
metylénovou modří cca 30 sekund
– barvení lze použít i pro střevní kokcidie
(kryptosporidia a cyklospory)
63/74
P08: Barvení dle Ziehl-Neelsena (2)
64/74
● znát postup, vědět jak vypadá pozitivní výsledek
(odlišit od Gramova barvení)
● znát další postupy dg. TBC (kultivace, PCR,
Quantiferon), odlišnosti v testování citlivosti
● dg. antinomycet a nokardií pro dodatečné dotazy
P08: Kultivace mykobakterií
● vědět, že před kultivací musí být provedeno moření
(znát postup)
● znát půdy (Šula, Banič a vaječné půdy Ogawovu či
Löwenstein-Jenssenovu).
● pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají
zátkou (není to jen kvůli ohrožení personálu, ale
především kvůli vyschnutí půdy)
● výsledky se odečítají po 1 (kontrola kontaminace),
3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace (pozitivní
výsledky se obvykle nacházejí po šesti týdnech)
65/74
P09: Spirochety (screening,
konfirmace)
● přehled testů na syfilis
66/74
Historický
BWR – Bordet
Wassermann
Netreponemové
Screening
RRR/RPR/VDRL
TPHA/TPPA/anti-TP
Treponemové
Konfirmace
ELISA
FTA-ABS
Western blotting
Historický
(superkonfirmace)
TPIT (Treponema
Pallidum Imobilizační
Test) = Nelson
P09: Spirochety (screening,
konfirmace)
● vyhodnotit výsledky v kombinaci s klinickými
příznaky, pozor na různé klinické situace:
– těhotné s pozitivním RRR nelze říct, že „má asi
syfilis“, je potřeba vyšetření konfirmovat
– negativní nález serologie boreliózy u pacienta
s erythema migrans neznamená, že bude považován
za zdravého a nebude léčen
– atp.
67/74
P10 – P13: Klinická mikrobiologie
● čtyři úkoly: lístečky se třemi „minikasuistikami“
– úkolem je rozhodnout se, jaké vyšetření provést
a vybrat pro ně vhodné typy odběrových souprav
– rozlišovat krev na hemokultivaci × krev na serologii,
vědět, že u vaginálních výtěrů je vhodný CAT, ale
také Amies, apod.
● najít patogeny mezi běžnou orofaryngeální
mikroflórou (nutno vědět, která to je, a jak se tam
patogeny hledají)
68/74
P11: Vyhledávání respiračních
patogenů
1) očkováno tamponem
2) očkováno kličkou
3) stafylokoková čára
4) disk BH (bacitracin pro
hemofily)
5) disk V+K (vankomycin
a kolistin pro meningokoky)
na celé naočkované ploše
pátráme po hemolytických
streptokocích (bezbarvé)
a po stafylokocích (spíše
bílé či zlatavé)
69/74
P11: Vyhledávání respiračních
patogenů (2)
bacitracinový disk může být umístěn buďto
na stafylokokovou čáru, nebo cca 1 cm od ní,
používají se oba způsoby
70/74
v těchto místech hledáme hemofily
P10 – P13: Klin. mikrobiologie (2)
● odečíst semikvantitativní a kvalitativní vyšetření
moče (určení kvantity je podmínka nutná, ale nikoli
dostačující, ještě nutno zjistit druh mikroba)
● vyhodnotit výsledky tří různých metod zpracování
cévních katetrů u dvou pacientů a interpretovat
je
– kvalitativní metoda
– semikvantitativní metoda ( >15 CFU)
– sonifikace katetru (>100 CFU)
71/74
Počet
kolonií
Počet CFU
v 1 µl moče
Počet CFU
v 1 ml moče
Interpretace
(zjednodušeno)
Méně
než 10
Méně než
10
Méně než 104
Kontaminace
10–100 10–100 104
–105
Hraniční
Více než
100
Více než
100
Více než 105
Infekce
P12: Vyhodnocení
semikvantitativní kultivace moče
72/74
● vyhodnoťte za předpokladu, že byl v moči nalezen
jeden druh mikroba, vyhodnoťte ENTEROtest 16
a ATB citlivost
P10 – P13: Klin. mikrobiologie (3)
● vyšetření stolice (sledování výsledku na různých
půdách)
● prohlédnutí poševního nátěru, počítání
Nugentova skóre
● prohlédnutí poševního výtěru (kultivace)
● prohlédnutí výtěru z rány (odběry, otisková metoda)
● prohlédnutí hemokultur (mikroskopie + kultivace)
73/74
Hodně štěstí u zkoušky!
74/74