RECEPTAfi PťľD Receptář je sestaven tak, že jako první jsou uvedeny půdy obecné a půdy pro kultivaci enterobakteriaceí (1—34), zpracované PhMr J. Motthm. Další půdy jsou vyňaty z kapitol speciální části a jsou seřazeny podle jejich pořadí. Půdy pro testování antibiotik a sulfamidů jsou v příslušné kapitole (viz str. 152), rovněž tak předpisy na substráty, užívané v precipitaei v gelu. RECEPTÁŘ Buj on 1 maso................................. 500 g pepton................................ lOg natrium ehloratum ISTaCl........................ 5 g voda................................. 1000 ml Maso, pečlivě zbavené tuku, šlach a kostí, rozemeleme a přidáme vodu (1 : 2). Přes noc necháme macerovat v lednici. Druhý den maso za občasného míchání asi 30 min. povaříme. Odpařené množství vody musíme dolitím nahradit. Odvar z masa scedíme přes plátěnou tkaninu a zbylé maso mírným tlakem vymačkáme. Takto získané dekoktum dáme opět přes noc do lednice. Příštího dne odvar zfiltrujeme přes vatu a k 1000 ml filtrátu přidáme 10 g peptonu a 5 g soli. Krátce povaříme a po rozpuštění přidaných ingrediencí upravíme pH na 7,2. Var udržujeme ještě asi 30 min., po odstavení necháme bujón asi 20 min. v klidu ustát a potom jej opatrně zfiltrujeme přes papír tak, abychom u dna usazený sediment nezvířili a filtraci tak nezpomalili. Zfiltrovaný bujón rozplníme do zásobních lahví a vysterilisujeme 30 min. v páře pod tlakem. Fosfátový bujón 2 kalium phosphoricurn monobasic. sice. KH2P04.............. 1,5 g kalium phosphoricurn dibasic. sice. TCjHPC^................ 5 g glukosa ............................... lOg bujón ................................ 1000 ml Povaříme 20 min.v proudící páře, zfiltrujeme přes papír a rozplníme do Blackových nádobek nebo zkumavek. Následuje sterilisaco v Arnoldově přístroji 3 dny po 20 min. pH půdy je 7,2. Glukosový bujón { 3 připraví se z bujónu přidáním 0,5— 1% glukosy. Sterilisuje se frakcionovaně. ~> Játrový bujón 4 Vařená morcecí, králičí nebo telecí játra rozkrájíme na kostičky, opláchneme studenou vodou a po 2—3 kouscích vkládáme do zkumavek. Potom přidáme po 8—10 ml bujónu a půdu vysterilisujeme 30 min. v páře pod tlakem. Sérový bujón 5 K bujónu přidáme 10 % koňského nebo hovězího sera a rozplníme do zkumavek. Pracujeme se sterilními součástmi a za přísného dodržování všech podmínek sterility. Přes noc půdu inkubujeme v thermostatu při 37 °C, Patočkovy nádobky pro hemokulturu 6 Vařená morcecí (telecí) játra nebo ledvinky rozkrájíme na kostičky a po 2 —3 kouscích vkládáme do nádobek, které vysterilisujeme 3x 15 min. v proudící páře. Potom přidáme 2 — 3 ml 10% vod. rozt. cifcronanu sodného (Na3CGH507 . 2 HaO) do každé nádobky. Nádobky, dosud uzavřené vatovým tamponem, zazátkujeme sterilními speciálními gumovými zátkami, které ještě převážeme navlhčeným pergamenovým papírem. Následuje konečná sterilisace 20 min. v proudící páře. Kauffmannova pomnožovací půda 7 bujen . . .............................. 900 ml calcium carbonicum CaC03 (suše steril.).................. 45'g Lugolův roztok........................... 20 ml 50% rozt. natrium hyposulphurosum Na2S£03. 5 H20 ..........' . 100 ml hovězí žluč.............................. 50 ml 0,1% roztok brilantové zeleně...................... 11 mí Postupně smícháme jednotlivé součásti a za stálého míchání (nerozpuštěný uhličitan se usazuje u dna) rozplníme půdu po 8—10 ml do zkumavek a vysterilisujemo 2x20 min. v proudící páře. Zásobní roztoky; a) Lugolův roztok: iodum I............................... 20 g kalium iodatum KI .......................... 25 g voda................................. 100 mí b) 50% vodný roztok sirnatanu sodného kryst., sterilisovaný 30 min. v páře pod tlakem. c) Hovězí žluč filtrovaná papírem a sterilisovaná 2 x 20 min. v proudící páře. d) 0,1% vodný roztok brilantové zeleně, připravený rozpuštěním barviva v deštil, vodě a po 2|t hod. sbání v thermostatu při 37 "O sfiltrovaný přes papírový filtr. Tetrathionátový bujón 8 Roztok A: natrium hyposulphurosum NaaS203 . 5 H30................ BO g voda sterilní.............................. 100 ml 'Roztok jodu: iodum I ............................... 30 g kalium iodatum KI.......................... 25 g voda................................. 100 ml Zhotovení půdy: roztok A............................... 100 ml roztok jodu.............................. 20 ml calcium carbonicum CaCOB (suše steril.).................. 25 g bujón ................................ 900 ml Postupně smícháme jednotlivé složky půdy a rozplníme po 5 — 10 ml do zkumavek. Steri-lisujeme 20 min, v proudící páře dva dny za sebou. Půdu připravujeme těsně před použitím. Živný agar 20 g agarové řasy dobře propereme přes cedník v tekoucí studené vodě, vymačkáme a přidáme k 1000 ml bujónu (2% agar). Dáme rozvařit do proudící páry a upravíme pH na hodnotu 7,2. Znovu asi 20 min. povaříme, zfiltrujeme přes vatu a vysterilisujeme 30 min. v páře pod tlakem. Agarové plotny: vyléváme sterilně do Petriho misek po rozvaření a zchladnutí agaru asi na 50 °C. Agar šikmý: plníme do zkumavek asi po 10 ml. Následuje 30 min. sterilisace v páře pod tlakem a po Částečném zchlazení se zkumavky ukládají v šikmé poloze. Krevní agar 10 K rozpuatěnému sterilnímu živ. agaru, zchlazenému na 45 — 30 °C sterilně přidáme 5 — 7% defibrinované berani krve. Směs se dobře promíchá (opatrně, aby se netvořila pěna)a vylévá do ploten nebo plni nad plamenem do zkumavek. Endova půda (modif.) 11 a) Príprava, agarové hase: voda.................................. 650 ml hovězí dekoktvun ........................... 350 ml pepton................................ 10 g natrium chloratum NaCl........................ 5 g vypraná agarová řasa ......................... 20 g Rozvaříme v proudící páře a upravíme reakci na 6,9 (konečná fáze má mít pH 7,0). Znovu 30 min. povaříme a zfiltrujeme přes vatu. Vysterilisujeme 30 min. v páře pod tlakem. b) Zhotovení půdy: Postupně smícháme*. 1000 ml rozpuštěné steril. agarové base, 1,2 g siřičitanu sodného bezvodého (Na2S03). 50 ml 20% vodného roztoku laktosy (sterilni), 1,7 ml 10% alkohol, roztoku basického fuohsinu. Po důkladném smíchání povaříme půdu 15 min. v proudící páře a vyléváme do ploten, Vizmut-sulfitový agar podle Wilsona-Blaira (modif.) 12 a) Príprava agarové base: voda................................. 650 ml hovězí dekoktum ........................... 350 ml pepton................................ 10 g vypraná agarová řasa.......................... 20 g Rozvaříme v proudící páře a upravíme reakci na 7,1. Opět 30 min. povaříme a zrUtrujeme přes vatový flitr. K filtrátu přidáme 0,5% glukosy a sterilisujeme 30 min. v proudící páře. h) Príprava vizmut-sulfitového roztoku: 1. 80 g siřičitanu sodného bezvodého (NajSO.,) rozpustíme za horka v 200 ml deštil, vody. Po rozpuštění doplníme objem deštil, vodou do 400 ml. 2. 24 g vizmut-citrátu rozpustíme v 40 ml deštil, vody a přidáme 12 ml roztoku amoniaku. Při přidávání amoniaku směsí stále třepeme, až se stane téměř čirou. Potom objem roztoku doplníme deštil, vodou do 200 ml. 3. 4gsíranu železnatéhokryst. (FeSOi.7HaO) rozpustíme v 50 ml deštil, vody, kníi přidáme 3 kapky kone. kyseliny solné. Roztok má být čirý. 4. Smísíme roztoky 1. a 2. a přidáme 40 ml roztoku 3. Nakonec ještě přidáme 42 g středního fosforečnanu sodného kryst. (Na2HP04 . 12HaO) a opatrně nad plamenem asi 3 min. povaříme, až směs dostane sedavou baxvu. c) Zhotovení půdy: Postupně smícháme: 1000 ml rozpuštěné steril. agarové base, 70 ml vizmut-sulfitového roztoku, 4 ml 1 % vodného roztoku brílantové zeleně. Po důkladném promíchání povaříme půdu 15 min. v proudící páře. Plotny uložené v temnu a chladu jsou použitelný asi 5 dní. Půda s desoxych.olan.em sodným 13 a) Příprava agarové base: voda................................. 650 ml hovězí dekoktum ........................... 350 ml pepton............................... 5 g vypraná agarová řasa ......................... 20 g Rozvaříme v proudící páře a upravíme reakci na 7,3. Opět krátce povaříme a zflltrujeme přes vatu. Následuje konečná sterilisace 30 min. v páře pod tlakem. b) Příprava díl&ích roztoků: 1. Citrátový roztok: natr. citrioum NaaC5H60, . 2H20................... 17 g natr. hyposulphurosum Na2SaOs . SH20................ 17 g ferrum citricum cryst. (Fe • • *)................... 2 g v°da ............................ 100 ml Po rozpuštění jednotlivých součástí ve sterilní deštil, vodě krátce (asi 3 min.) povaříme nad plamenem. 2. Ve 100 ml sterilní vody rozpustíme za tepla 10 g desoxycholanu sodného a roztok krátce nad plamenem povaříme. 3. 20% roztok laktosy, sterilisovaný v proudící páře 3 dny po 15 minutách. 4. 1% vodný roztok neutrální červeně, připravený rozpuštěním barviva ve sterilní deštil. vo'dě. c) Zhotovení půdy: Postupně smícháme: 1000 ml rozpuštěné steril. agarové base. 50 ml citrátového roztoku (1), 50 ml roztoku desoxycholanu (2), 50 ml roztoku laktosy (3), 3 ml roztoku červeno (4). Po důkladném promíchání povaříme půdu 15 min. v proudící páře a vyléváme do ploten. Dorsetol-a vaječná půda 14 Čerstvá vejce za pomoci kartáčku a mýdlové vody řádně omyjeme a osušíme. Oba póly potřeme 70% alkoholem a sterilní pinsetou nabodneme. Obsah necháme vytéci do sterilní nejlépe graduované nádobky s perličkami a důkladně roztŕepeme. Po odečtení vrstvy perliček přidáme 10% sterilní deštil, vody a opět dobře protřepeme. Nádobku s homogenní směsí uložíme na 2 —3 hod. do lednice (při větším množství nejlépe přes noc). Potom půdu sterilně rozplníme (nad plamenem) bud po 2 ml do krevních nebo po 8 ml do bakteriologických zkumavek. Půdu srážíme v šikmé poloze při 80— 85 «0 v proudící páře po dobu 60 minut. Očkovací plocha musí být naprosto hladká a klička se nesmí do zkoušené půdy bořit. Peptonová voda X5 Pepton................................ 10 g natrium chloratum NaCl..............{.......... 5 g v°da................................. 1000 ml Po rozpuštění peptonu a soli za tepla upravíme pH na hodnotu 7,2 a krátce povaříme. Zfiltrujeme přes papír, rozplníme do Blaekových nádobek nebo zkumavek a vysterilisujeme 30 min. zahřátím v páře pod tlakem. Hottingerův bujón \$ natrium chloratum NaCl........................ 5 g kalium phosphoricum dibasic. sice. K2HP04 ............... 1 g trypsin-pepton............................. 9 g voda................................. 1000 ml Přidané ingredience rozpustíme zahřátím v proudící páře a reakci upravíme na 7,4. Znovu povaříme (20 min.), zfiltrujeme přes papír a rozplníme po vhodných množstvích do Blaekových nádobek nebo zkumavek. Následuje sterilisace v proudící páře 3 dny po 30 min. Tryptický bujón 17 trypsin (1:250)............................ 0,2 g chloroform.............................. 10 ml bujón................................ 1000 ml Upravíme pH na 8,0 a v láhvi se zabroušenou zátkou směs dobře protřepeme a za občasného promíchání uložíme na 24 hod. do thermostatu při 37 °C. Potom krátce {10 min.) povaříme v páře, upravíme reakci na 7,4 a zfiltrujeme papírovým filtrem. Filtrát zředíme fysiologickým roztokem v poměru 1 : 3, upravíme pH a rozplníme do zkumavek nebo Bíackových nádobek. Sterilisujeme v proudící páře 3 dny po 30 minutách. O dobré jakosti tráveného bujónu se přesvědčíme provedením t. zv. tryptofanové reakce: Zfiltrujeme 10 — 20 ml bujónu a filtrát okyselíme 10% kyselinou solnou. Z okyseleného nitrátu odpipetujeme do 2 zkumavek po 1 — 2 ml a přidáme po kapkách bromovou vodu. Ďervenavé zabarvení je ukazatelem tryptofanu. V opačném případě musíme stravovací prooes prodloužit nebo použít čerstvého trypsinu (dlouhým skladováním ztrácí svoji úěinnost). Ulilovodanové půdy 18 K Hottingerovu bujónu přidáváme různé uhlovodany v množství 1%, jenaesculin a inulin v množství 0,5%. Jako indikátor přidáváme 1,5 ml roztoku bromthymolové modře na 100 mí půdy. Po rozpuštění oukru a přidání indikátoru rozplníme půdu do zkumavek-cukrovek a aterilisujeme 3 dny po 15 minutách v proudící páře (neautoklávovat!). Půdy s plynovkami; Burhamovy rourky (plynovky) vkládáme otvorem dolů do Kusselo-vých zkumavek, které pak normálně naplníme uhlohydrátovou půdou. Varem při sterili-saci se z plynovek vypudí vzduch a tyto klesnou ke dnu. Pozn.: Některé mikrobiální kmeny produkují z peptonu malá množství plynu, proto malá bublinka v plynovee po kultivaci ještě neznamená, že jde o kvašení cukru nebo chybu při přípravo půdy. Příprava indikátoru: OJN-NaOH- natr. hydro oxy datum.................... 25 ml brom thymolová modř......................... 1 g deštil, voda.............................. 475 ml Roztok postavíme na 1 — 2 dny do thermostatu pří 37 °C, až se barvivo úplně rozpustí. Během této doby roztok několikrát denně důkladně protřepáme. Kásleduje filtrace přes papírový filtr. Nesterilisovat! Půdy k zjišíování produkce indolu 19 Základní půdy užívané k zjišťování tvorby indolu jsou: peptonová voda, Hottingerův bujón, tryptický bujón. Ehrlichovo modif. činidlo: p-dimethylaminobenzaldehydum .................... 5 g 1 acidum hydrochloricum conc. HC1.................... 25 ml aleohol aethylicus 96%......................... 75 ml nebo: Kovacsovo činidlo: p-dimethylaminobenzaldehydum .................... 2,5 g acid. hydrochloricum conc. HC1..................... 15 ml aleohol amylicus ........................... 75 ml Půda pro nitrátový test 20 pepton................................ 5 g kalium nitricum KN08..................... 0,2 g dest. voda .............................. 1000 ml Rozpustíme za horka a upravíme pH na hodnotu 7,4. Opět krátce povaříme a zfiltrujeme přes papír. Potom půdu rozplníme do zkumavek (5 ml) a vy sterilisujeme v páře pod tlakem. Půda podle Hajný 21 agar................................. 15g pepton................................ 20 g natr, chloratum NaCl.......................... 5 g voda................................ 1000 ml Rozpustíme v proudící páře a upravíme pH na 7,5. Potom přidáme: laktosa................................ 10 g saceharosa.............................. 10 g glukosa - . ;............................ 1 g natrium hyposulphurosum JSTagSaOs . 5H30................. 0,2 g ferro-ammon. sulphuricum Fe(NH4)2(SOJ2. 6H20............. 0,2 g 1% vodný roztok fenolcerveně...................... 2,5 ml Půdu krátce povaříme, zfiltrujeme vatou a rozplníme do zkumavek po 5 ml. Následuje sterilisace v proudící páře 3 dny po 15 min. Půdu necháme ztuhnout v šikmé poloze. Agar s octanem olovnatým 22 K 50*0 ml rozpuštěného živného agaru přidáme roztok: plumbumaceticumPb(CH8COO)2. 3H20................. 0,5 g deštil, voda.............................. 3 ml (rozpustíme krátkým povařením nad plamenem). Směs se dobře promíchá a za sterilních podmínek rozplní do zkumavek asi po 3 ml. Nechá se ztuhnout v kolmé poloze. Želatina s ferrochloridem 23 100 ml želatínové půdy v zásobní baňce (Rp 32) rozpustíme ve vodní lázni a sterilní pipetou přidáme 0,5 ml 10% vodného roztoku chloridu železnatého (FeCl2. 4H20). Směs dobře protřepáme a sterilně rozplníme do zkumavek po 6— 8 ml. Okamžitě po naplnění zkumavky s půdou zchladíme ve studené vodě a uložíme do lednice. Půda ke zkoušce s methylovou červení (MRT) 24 pepton................................ 5 g kalium phosphoricum dibasic. sice. K2HP04............... 5 g .. glukosa ............................... 5 g deštil, voda.............................. 1000 ml Přidané ingredience rozpustíme zahřáfcím v proudící páře, roztok zfiltrujeme papírovým filtrem, přidáme 5 kapek indikátoru a po rozplnění do zkumavek půdu vysterilisujeme zahřátím v proudící paře 3 dny po 15 min. Konečné pH půdy je 6,9. Indikátor: methylčerveň............................ 0,1 g aleohol aethylicus 96%........................ 300 ml deštil, voda.............................. 500 ml Po 24 hod. stání v thermostatu při 37 °C zfiltrujeme přes papír. Voges-Proskanerova půda 25 pepton............................... 5 g ammonium chloratum NH4C1..................... 2 g magnesium sulphuricum MgS04 . 7HaO ................ 0,2 g natrium phosphoricum dibasic. Na2HP04 . 2HaO............. 0,6 g kalium phosphoricum monobasic, sice. KHaP04............. 5 g glukosa .............................. 5 g deštil, voda............................. 1000 ml Rozpustíme v proudící páře, event. zfiltrujeme přes papír. Půdu rozplníme asi po 3 ml a frakcionovaně vysterilisujeme v proudící páře (Š X 15 min.). Reakce půdy je 6,9. Barritlovo činidlo: Roztok 1.: 6% roztok alfa-naftolu v absol. alkoholu. Roztok 2.: 40% roztok hydroxydu draselného. Rustigian-Stuartova půda s močovinou (modif.) 26 urea pura ............................. 20 g kalium phosphoricum monobasic. sice. KH2P04............. 9,1 g kvasnicový extrakt (spissum)..................... 0,1 g 1 % vodný roztok fenolčerveně..................... 1 ml deštil, voda............................. 1000 ml Nezahřívat! Po rozpuštění ingrediencí půdu vysterilisujeme Seitzovým filtrem a sterilně (nad plamenem) rozplníme asi po 2 ml do zkumavek. Před použitím inkubujeme 24 hod. v thermostatu při 37 °0. Christensenova půda pro průkaz ureasy 27 I. pepton............................... 1 g natrium chloratum NaCl....................... 5 g kalium phosphoricum monobasic. sice. KH2P04............. 2 g agarová řasa............................ 20 g deštil, voda............................. 1000 ml Rozpustíme zahřátím v proudící páře a upravíme pH na 6,9. Opět krátce povaříme a zfiltru-jome přes vatu. Přidáme 6 ml vodného roztoku fenolčerveně (kone. 1 : 500) a vysterílisu-jemo 30 min. v páře pod tlakem. II. urea pura............................. 20 g glukosa.............................. 1 g deštil, voda............................. 20 ml Po rozpuštění zfiltrujeme bakteriálním filtrem (Seitz) a přidáme k rozpuštěné sterilní asi 50 °C teplé základní agarové směsi (I.). Dobře promícháme a sterilně (nad plamenem) rozplníme do zkumavek. Půdu necháme ztuhnout v šikmé poloze. Amoniový agar (Simmonsův agar) 28 natrium chloratum NaCl.....................■ • 5 g magnesium sulphuricum MgS04 . 7H,0................. 0,2 g kalium phosphoricum dibasic, sicc. K2HP04............... lg ammonium phosphoricum monobasic. !NH4H2P04............. lg agarova fasa ............................ 20 g destil. voda............................. 1000 ml Bozpustíme zahřátím v proudící páře a jako indikátor přidáme 40 ml 0,2% roztoku bromthymolové modře. Dále přidáme podle druhu prováděného testu: a) Test citrátový: V malém množství destil. vody rozpuštěných 6 g (0,5%) eitronanu sodného (NaaC6K607. . 2H20). b) Test amonium - glukosový: V malém množství destil. vody rozpuštěných 5 g (0,5%) glukosy. Podle druhu prováděného testu přidáme k agarové basi roztok citrátu (a) nebo roztok glukosy (b), směs dobře promícháme a rozplníme do zkumavek po S ml. Půdu vysterilisujeme frakcionovaně (3X 15 min.) v proudící páře a necháme ztuhnout v šikmé poloze. Sternův glycerinový bujón 29 glycerol kone.............................. 10 ml 10% vodný roztok natrium sulphurosum Na2S03 . 7H„0.......... 20 ml bujón................................ 1000 ml indikátor............................... 3 ml Reakci půdy upravíme na 8,0 a po filtraci přes papír rozplníme do zkumavek po 3—5 ml. Vysterilisujeme v proudící páře 3 dny po 15 minutách. Indikátor: alcohol aethylieus 98%......................... 100 ml fuchsin basioký..........................., ■ 1° 8 K alkoholu v láhvi se zabroušenou zátkou přidáme fuchsin a uložíme do thermostatu při 37 °C. Občas důkladně nrotřeneme. Po 24 hod. zflltruieme rjřes papír. Gardová plotna k zjišťování pohyblivosti (0,5% živný agar) 30 K 1000 ml bujónu přidáme 5 g proprané agarové řasy, rozvaříme v proudící páře, upravíme pH na 7,2, opět krátce povaříme a zfiltrujeme přes vatu. Vysterilisujeme 30 min. v páře pod tlakem a vyléváme do Petriho misek. ,,U" rourky podle Hajný 31 „TJ" rourky si zhotovíme ohnutím skleněných trubek, kterých se užívá k vytahování Pasteurových pipet. Otvory v obou ramenech zazátkujeme vatou a rourky v horkovzdušné sterilisaci vysterilisujeme. Potom je postavíme do lepenkové krabičky, jejíž víko má vystřižené obdélníkové otvory, nebo do zvláště k tomuto účelu vyrobených plechových stojánků. Rozpuštěný sterilní 0,5% živný agar rozplníme za sterilních podmínek do rourek tak, aby vrstva a.garu sahala 1-—2 cm od vatových zátek. Želatina 32 V 1000 ml bujónu rozpustíme opatrným zahřátím v Arnoldově přístroji 15—20 % žela-tiny a'.podle druhu kultivovaných mikrobů zastavíme pH (všeobecně 7,4—7,6). Roztok ochlazený na 50 — 55 °C se vyjasní bílkem: na 1000 ml půdy použijeme 1 bílku. Vajíčko s pomocí kartáčku a mýdlové vody dobře omyjeme a po osušení skořápku opálíme nad plamenem. Rovněž opáleným nožíkem nebo pinsetou skořápku mezi oběma póly vajíčka naklepneme, vajíčko rozlomíme a přeléváním žloutku z jedné poloviny skořápky do druhé bílek oddělíme do sterilní třecí misky. Bílek smísíme se stejným množstvím sterilní destil. vody a rovněž sterilní třenkou rozšleháme na sníh. Sníh dobře smísíme s ochlazeným živným roztokem a povaříme v proudící páře. Bílek se srazí a utvoří na povrchu tekutiny povlak, který pozvolna klesá ke dnu nádoby, při čemž strhne všechny znečiště-niny. Znovu upravíme pH a roztok při pokojové teplotě zfiltrujeme. Želatínovou půdu plníme do zkumavek po 8—10 ml a sterilisujeme 3 dny po 15 min. nebo lépe 1X 45 min. Ihned po sterilisaci postavíme košíček se zkumavkami do studené vody, aby plda ryohle a dobře tuhla. Uchovává se v lednici. Pozn.: Po několikadenním stání půdy se může bod tání posunout na 29 — 30 °0. Braunuv test 33 pepton................................ 10g natrium chloratum NaCl........................ 6 g kalium phosphoricum monobasic, sicc. KHaP04 .............. 0,226 g natrium phosphoricum dibasic. Na2HP04 . 2H20 ............. 5,637 g destil. voda.............................. 1000 ml agarova fasa.............................. 20 g Po rozvaření upravíme pH na 7,4—7,5, opět krátce povaříme a zfiltrujeme přes vatu. Pipetou přesně rozplníme do zkumavek po 2,1 ml a vysterilisujeme 20 min. zahřátím v páře pod tlakem. činidlo: 0,5% vodný roztok kyanidu draselného, připravený rozpuštěním ~K.GN v sterilní destil. vodě (bez zahříváni!). Sérový agar 34 K živnému 2% agaru přidáme 10 % koňského nebo hovězího sera a rozplníme do zkumavek. Pracujeme se sterilními součástmi a za přísného dodržování všech podmínek sterility. Půdu necháme ztuhnout v poloze kolmé. Přes noc inkubujeme v thermostatu při 37 °0. Peptonová voda (V. cholerae) 35 dobrý pepton............................. lOg natrium chloratum NaCl........................ 5 g destil. voda.............................. 1000 ml Po rozpuštění roztok povaříme, upravíme pH na 8,4—8,5, přefiltrujeme, rozplníme a 3krát frakcionovaně sterilisujeme. Konečné pH má být v rozmezí 8,3 — 8,5. Goharova půda (V. oholerae) 36 Ke 100 ml dobrého peptonového živného bujónu přidáme 0,2 ml 1% roztoku kalium tallu-ritu. Rozpřníme po 5—7 ml do zkumavek a sterilisujorae v autoklávu. Alkalický živný agar (V. cholerae) 37 Dobrý živný agar upravíme přidáním louhu sodného na. pH 8,5. Doporučuje se po případě přidat hemolysovanou beraní krev do koncentrace 0,2%. Alkalický krevní agar podle Dieudonné (V. oholerae) 38 Stejný díl defíbrinované beraní krve se smísí se stejným dílem vodného roztoku louhu draselného (4 g KOH na 100 ml dešti]. H«0). Po dobrém promíchání necháme směs stát 1 hod. a poté vaříme 30 minut. Tři díly této alkalické krve se smísi se 7 díly 3 % neutrálního agaru. Rozvařená půda se pak rozlévá do misek nebo zkumavek. Pro značnou alkalitu půdy lze toto použít teprve po 4S hodinách, je-li uložena při pokojové teplotě nebo po 5minutovém zahřátí na 65 °0. Půdy se může používat nejdéle 10 dni po přípravě. Chapman -Stoneova půda (Micrococcus pyogenes) 39 d-maiiitol Difco............................ 10 g Bacto-tryptone (Difco)......................... 10 g Bacto-agar.............................. 15 g Natrium chloratum NaCl (Merck).................... 55 g Baeto-yeast-extract (Difco)....................... 2,5 g kalium phosphoricum dibasicum sicc. K2HP04 bozvody (Merck)...... 5 g Bacto-želatina ........................... 30 g ammonium sulphuricum (NH4)äSOä (bez pyridinu!)............ 75 g 10% natr. hydrooxydatum NaÓH.................... 6 ml deštil, voda.............................. 1000 ml pH půdy 7,0 Půda se sterilisuje 10 minut při tlaku 1 atm., za tepla se roztřepe a z 1-1 se vylévá 40 misek. Půda se nesmí vylévat příliš studená, am během vylévání nechat na chladné desce. Správně připravená půda je za tepla stejnoměrně průsvitná, po zchladnutí stejnoměrně ka,Iná. Tuhá půda pro fagotypisaci (Micrococcus pyogenes) 40 Baeto agar............................. 20 g natrium chloratum NaCl....................... 7,5 g nutrient broth (Difco)......................... 20 g dastil. voda ad............................ 1000 ml pH se upraví nf- 7, 1 — 7, 2. Sterilisuje se v autoklávu. Biggerův agar (titrace stafylokokového antitoxinii) 41 pepton Witte............................ 8,9 g pepton proteose........................... 8,9 g pepton Bacto............................ 8,9 g agar................................ 26,7 g masová infuse............................ 1000 ml Směs zahříváme 60 min. a pak neutralisujeme draselným louhem na, pH 7,4. Vaříme dále po dobu 30 min. a filtrujeme. Na 1000 ml íiltrátu přidáme 133 ml glyoerolu, 111 ml 20 % směsi KfLjPO, a KjjHPČ^ a 89 ml Hso. Po řádném promíchání sterilisujeme v autoklávu 20 min. při jedné atmosféře. Parkerův bujón (titrace stafylokokového antitoxinu) 42 pepton Witte............................ 20 g kalium phosphoricom nucleobassicc. KHaPO^ ............. 0,2 g magnesium sulphuricum MgS04 . 7II30 ................ 0,3 g masový nálev............................ 1000 ml Směs po promíchání vaříme 30 min. Za pomoci KOH upravíme pH na-7,6 a po lOminuto-vém vaření filtrujeme přes papír. Nakonec sterilisujeme 20 min. při 1 atm. Modifikovaný čokoládový agar (gonokoky) 43 Základní agar: Hovězí maso, zadní, libové zbavíme šlach a tuku, rozemeleme a zvážíme. Přidáme stejný objem deštil, vody a tuto směs necháme přes noc v lednici. Druhý den za stálého míchání povaříme se stejným množstvím vody a přidáme k prvnímu. Infusi necháme znovu přes noe v lednici, další den zfiltrujemo pres papír a doplníme deštil, vodou na původní váhové množství. K 1000 ml infuse přidáme 20 g vyzkoušeného peptonu, 3 g kuchyňské soli (NaCl), 2 g střed, fosforečnanu sodného (NaaHP04), zahřejeme do varu, alkalisujeme 5N louhem (NaOH) na pH 8,2 (univ. papírkem), vaříme 20 min., zkusíme znovu pH, které má být po konečném 5 min. vaření 8,1—8,2. Vychladlý bujón dáme do druhého dne do lednice, poté zíiltrujeme přes papír, změříme objem a doplníme deštil, vodou na původní množství. K 11 bujónu přidáme 18 g vyzkoušeného agaru, va,říme 25 min., zíiltrujeme přes vatu, přidáme na 1000 ml 0,2 g cysteinu a 0,1 g kyseliny paraaminobenzoové rozpuštěné v trošce vody, rozplníme po 100 nebo 250 ml a autoklávujems 25 min. při 125 "C. Přídavek krve: K agaru ochlazenému na 58 °C přidáme 12 % defíbrinované koňské nebo lidské krve. Zahříváme ve vodní lázni pří 75— 78 °C (nikoli v Arnoldově přístroji) asi 20 min. Směs má nabýt barvy hořké čokolády, alo nesmí ssednout. Přídavek albuminu; K čokoládovému agaru ochlazenému na 56 °C přidáme 3 % sterilního 5% roztoku albuminu nebo stejné procento sterilního hovězího sera. Půdu vyléváme do Petriho misek nebo do zkumavek s transportními tampony. Příprava, sera nebo albuminu: Roztok albuminu nebo sérum sterilisujeme filtrací přes EK vložku. Ke 100 ml sterilního seraljpřidáme 7,5 ml 0,1% vodného roztoku nilské zeleně. Roztok nilské zeleně sterilisujeme autokiávováním. Langer doporučuje tyto chemikálie: Pepton: Organofarma některých šarží. Agar: Sanitas některých šarží. Agary vesměs provenience Iiobé a čínské agary. Albumin Biogena, vyrobený z odpadu výroby gamma-globulinu. Nilská modř fy Bayer „Nil Blue". Sérum bez přídavku formolu nebo jiných antiseptik. Nevhodný je Danagar, mleté anglické agary, Sachalin agar a Difco mletý agar. Fermentační půdy 44 a) Základní agar: vyzkoušený agar........................... 1 g vyzkoušený pepton.......................... 1 g natrium chloratum NaCÍ....................... 1,25 g deštil, voda ............................. 1000 ml Rozpustí se a doplní se vodou na 190 ml, rozplní po 30 ml. Sterilisuje se 20 min. při 125 °C. 1 g cukrů mikrobiologických kvalit se rozpustí v 2,5 ml vody a doplní na 5 ml vodou. Sterilisuje se 3 dny po sobě 20 min. při 100 °C. b) Příprava indikátoru: 0,1 g bromfenolové červeně se rozetře v misce s 28 ml N/100 NaOH, doplní vodou na 250 ml a sterilisuje po přefiltrování 20 min. při 125 °C. Zhotovení půdy: Do rozvařené základní půdy (30 ml) se přidá po ochlazení na 55 °0 2,5 ml storilního roztoku cukru, 5 ml sterilního sera bez nilské modře a 1,25 ml sterilního roztoku indikátoru. Sterilním N/10 NaOH upravíme pH na 7,4— 7,5 (mírně za barevný přechod ze žluté barvy do červené) a rozlijeme do zkumavek ke vpiehovému očkování. Polotekutá pomnožovací asoitová půda (meningokoky) 45 hovězí infuse............................. 500 ml agar................................. S g natrium chloratum NaCl........................ 5 g pepton................................ 10 g destil. voda.............................. 500 ml sterilní ascites............................. ää Agar rozpustímo ve vodě autoklávováníin, pepton a sůl v infusi. Smícháme, upravíme celkovou váhu a pH na 7,6. Filtrujeme přes vatu a gázu. Autoklávujeme 20 min. a uschováme. V případě potřeby rozpustíme agarovou basi, zchladíme na 50 °C, ascites zahřejeme na 50 °0 a sterilně smísíme ve stejných dílech. Dobře promísíme a rozdělíme sterilně po 4 ml do zkumavek (13 X 125 mm). Necháme ztuhnout v svislé poloze. Inkubujeme 48 hod. při 37 "O a 96 hod. při 20—27 °C na kontrolu sterility (při delším skladování půdy je třeba ji pokrýt asi 0,5 ml sterilního minerálního oleje). Půda se může nalévat i na Petriho misky, zvýšíme-li obsah agaru alespoň na 1 % konečné koncentrace. Ascitový agar můžew.e připravovat i jinak: 1 díl aseitu se přidá ke 3 dílům 2,5—3% neutrálního živného agaru. Doporučuje se přidat 0,5-3% glukosy. Glukosový mozkový bujón (Rosenow) 46 pepton................................ 5 g natrium chloratum NaCl........................ 8 g glukosa ............................... 2 g Andradeho indikátor (viz str. 62, půda č. 61)................ 10 ml masová infuse............................. 1000 ml Pepton a sůl rozpustíme v masové infusi opatrným zahříváním. Přidáme indikátor a glukosu. Upravíme pH na 7,0 až 7,5 a nalijeme půdu do širokých zkumavek (200 X 16 mm) tak, aby výška bujónu byla asi 12 cm. Přidáme 3 kostky telecího mozku o hraně 1 cm a 2 —3 kousky křídy do každé zkumavky (kousky mozku ponoříme před tím do vody, aby se předešlo jejich přilepení na stěnu zkumavky). Autoklávujeme při 120 °C 20 min. Sérový agar 47 2% živný agar (Rp 9, str. 49)...................... 1000 ml sterilní koňské sérum.......................... 100 ml 20% roztok glukosy........................... 50 ml Agarovou basi rozpustíme a ochladíme na 50 "O. Sérum a roztok glukosy zahřejeme na 50 °C, aseptický smísíme s rozpuštěným agarem, dobře promícháme a aseptický rozdělíme po 7 ml do zkumavek (19x150 mm). Necháme ztuhnout v šikmé poloze. Inkubujeme 48 hod. při 35 —37°C, potom 24 hod. při 20 —27"C. Zkontrolujeme sterilitu a uložíme. Todd-Hewittův bujón (streptokoky) 48 Z čerstvých hovězích srdcí nebo koňského masa se vykrájí všechen tuk. Libové maso se jemně rozemele a na každých 450 g se přidá 1050 ml destil. vody. Promíchá se, tuk se shora sebere. Přes noc se nádoba s masem uloží do lednice. Druhý den se zahřeje na 85 °C a teplota se udržuje 150 minut, nesmí však být překročena. Pak se provede filtrace papírovou vatou. Ke každému litru roztoku se přidá 20 g Neopeptonu (neboProteose-peptonu) Difco, pH se upraví na 8,0 s pomocí N-l louhu (NaOH) a přidají se 2 g soli (NaCl), 2 g kys. uhličitanu sodného (NaHG03), 0,4gbezvodého středního fosforečnanu sodného (Na2HP04) a 2 g glukosy. Vaří se 15 minut a pak se zfiltruje papírovým filtrem. Pvozplňuje se do zkumavek po 5—6 ml a sterilisuje v Arnoldově přístroji tři dny po sobě, vždy 20 minut. Konečné pH má být 7,8. Vznikne-li sraženina, odfiltruje se, pH se znovu upraví a bujón se znovu sterilisuje v Arnoldově přístroji. Půda pro průkaz tvorby amoniaku z argininu (streptokoky) 49 pepton............................... 0,5 g kvasnicový extrakt.......................... 0,5 g kalium phosphor dibaaioum sice. K2HP04............... 0,2 g glukosa .............................. 0,05 g arginin hydrochlorid......................... 0,3 g destil. voda............................. 100 ml Půda pro průkaz štěpení natrium hippurátu (streptokoky) 50 hippurát sodný............................ 10 g dextrosa............................... lOg bujón ............................... 1000 ml Pakulovapůdaprokultivaci Stroptomyoes albus (streptokoky) 51 Casitono (Difco)........................... 5 g glukosa .............................. 5 g natrium chloratum NaCl....................... 5 g kalium phosphor. dibasieum sice. K2HP04............... 2 g magnesium suiphuricum MgS04 . 7 HaO ................ Ig calcium chloratum sice. CaCl2 ..................... 0,04 g ferrum suiphuricum FeS04 . 7 HsO.................. 0,02 g zmcuňi suiphuricum ZnS04 . 7 H20.................. 0,01 g agar.............................. . . 12,5 g destil. voda............................. 1000 ml Jiná modifikace: asparagin ............................. 0,5 g glukosa .............................. 10 g kalium phosphor. dibasieum siec. K2HP04............... 0,5 g agar................................ 12.5 g destil. voda............................. 1000 ml Trypsino^vá emulse (streptokoky) 52 Očištěný a rozemletý vepřový pankreas.................. 800 g aloohol ethylicus 96%......................... 1000 ml destil. voda . . . . ;......................... 2400 ml Směs se třepe po tři dny při pokojové teplotě, přidá se kyselina solná do výsledné 0,1% koncentrace, směs se přefiltruje nejprve papírovým filtrem, pak Seitzovým filtrem s EK vložkou. Získaná emulse se uchovává ve zmraženém stavu. Bujón podle Kalbaka (streptokoky) 53 500 g masa (hovězí srdce, koňské maso, hovězí maso) se zbaví kostí, tuku a šlach, jemně rozemele a přelije 11 aquae fontis. Dá se přes noc do lednice při + 4 "C. Příští den se zahřeje na 100 °C na dobu 10 min. Maso se odfiltruje přes plátno. Do filtrátu se přidá 20 g neopeptonu (Difco), pH se upraví na 7,3 a sterilisuje se filtrací přes Seitzův filtr. Příprava solného roztoku s glukosou- glukosa.............................. 5 g natrium bicarbonicum NaHCOs.................... 5 g natrium chloratum .NaCl........................ 5 g natrium phosphor bibas. NaaHP04 .4-12 H,0............. 2,5 g destil. voda............................. 100 ml Rozpouští se za mírného zahřívání a sterilisuje se filtrací přes Seitzův filtr. 40 ml tohoto roztoku se těsně před naočkováním přidává kil bujónu, připraveného jak uvedeno sub a). . Lofflerovo sérum (Corynebaeterium diphteriae) 54 koňské (hovězí) sérum......................... 3 díly 1 % glukosový bujón.......................... 1 díl Rozplní se do zkumavek a koaguluje v šikmé poloze při 75 °C po dobu šesti hodin. Další dny za sebou se sterilisuje půda při 90 °C po dobu 20 min. v páře. Bylo-li užito sterilního sera, stačí je koagulovat 120 minut při 75 °C. Daleko výhodnější (zůstává větší kvantum kondensační vody) je koagulace Lofjlerova sera v autoklávu, z něhož nebyl vypuštěn vzduch, a který tedy dosahuje teploty něco přes 80 °0, a to pod tlakem. Pro tento postup však nutno každý autokláv zvláště vyzkoušet. Claubergova půda (Corynobacterium diphteriae) 55 Základní roztoky: 1. Glycerinová krev: 1 díl sterilního glycerolup. a. smícháme s 2 díly sterilní deflbrinované hovězí krve. Necháme zrát 6 týdnů v lednici při +2 až +4°0. Uchováváme v lednici. 2. Roztok cystinu: 1 g bezvodého uhličitanu sodného p. a. NVCO,, rozpustíme v 10 ml vroucí deštil, vody přidáme 1 g cystinu, znovu povaříme a objem doplníme do 100 ml sterilní deštil, vody. Roztok musí být čirý. 3. Telluritový roztok: Kalium tollurosum nutno rozetřít na jemný prášek. V odměrné baňce 250 ml sterilisujeme 240 mi deštil, vody. Po steriiisaci přidáme po malých množstvích a za stálého protřepávání 2,5 g jemně rozetřeného teluritu, aby se zcela rozpustil. Potom doplníme sterilní deštil, vodou do 250 ml. Roztok musí být čirý; maximálně vydrží 6 měsíců. Rovněž Kalium tellurosum v substancí stárne — nemá se užívat déle než 10 měsíců. 4. Roztok barviv: a) 2% roztok vodní modře v deštil, vodě b) 2 g metachromové žluti rozpouštíme ve 100 ml deštil, vody při pokojové teplotě za občasného protřepávání dva dny. Pak filtrujeme a užíváme čirého filtrátu. 5. Agarový základ: Dobrý bujón, obsahující 1% peptonu; 0,3% NaCl a 0,2% bezvodého NaHzP04 ztužírne 4% agaru, rozplníme po 210 ml a sterilisujeme v autoklávu 20 min. při 120 "C. Po steriiisaci je pH 7,2. Příprava půdy: a) Rozpustíme agarový základ (sub S.) v páře a po rozpuštění vložíme do vodní lázně při 48 °C. b) Do sterilní litrové baňky odměříme 165 ml sterilní deštil, vody a 82,5 ml sterilní deflbrinované hovězí krve. Promícháme a necháme stát až do ukončení hemolysy. Pak přidáme II ml glycerinované krve (sub. 1) a 18 ml roztoku telluritu (sub 3). Baňku postavíme do lázně při 48 °C. e) Do 100 ml sterilní baňky odvážíme 0,75 g octanu sodného p. a., 7,5 g glukosy, připipe-tujemo SO ml roztoku vodní modře (sub 4a), 10 ml roztoku metachromové žluti (sub 4b) 'o 5 ml roztoku cystinu (sub 2). Uložíme do vodní lázně při 48°0. d) Roztok sub c) vlijeme do roztoku sub b), obsah důkladně promícháme a přidáme 210 ml agarového základu 48 "C teplého, znovu promícháme a rozlijeme do ploten. Zahřívání při 48 °0 má být co nejkratší, nebot tcllurit se rozkládá, je-li zahříván s glukosou. Jedna várka má objem 531 ml. Škovránkova půda (Corynobacterium diphteriae) 56 1. Bujónový agar 3,5%, pH asi 7,2 (přesné pH není nutné), rozplněný po 150 ml v menších laboratořích nebo po 300 ml ve větších laboratořích, zhotovujeme z masa. 2. Odstředěné kravské mléko (mlékárenské), sterilisovanó v páře nebo i v autoklávu 20 min. (mírná karamelisace nevadí). 3. Serztm hovězí nebo koňské (stačí z jateční krve). Nemusí být absolutně sterilní. 4. Roztok 40% glukosy. Možno použít všech běžných druhů glukosy (dextrosy) i dextro-puru. 5. Indikátorový roztok: 200 ml převařené deštil, vody, 3 ml 10% louhu (NaOH), 0,1 g methyl, červené, 0,6 g cystinu, 1,1 g Kalium tellurosum (potassium tellurite). Postavíme na 5— 10 min. do vařící vody, občas promícháme, až se rozpustí zbytky krystalků methyl, červeně a roz.ok je čirý. Dále již nesteriUsujeme. Roztok vydrží asi 1 měsíc. 6. Roztok vodní modři 1,6% (Wasserblau 6B extra P. Grübler). Eozpustíme za horka, zfiltrujerne a pak převaříme v páře asi 10 minut. 7. Olyaerolát krevní: 1 díl glycerinu, 2 díly deflbrinované krve hovězí nebo koňské (stačí jateční) rozplníme do menších baniček a uschováme v chladu, čím starší, tím lepší. V nouzi se dá použít, glycerolátu již druhý den. Beraní krev je méně vhodná (je světlejší). S. 10% NaOH ke konečné úpravě pH půdy. Příprava půdy (celkové množství asi 600 ml): 1. Rozpustíme 300 ml agaru v zásobní baňce. 2. Ve drahé baňce o obsahu alespoň I 1 dáme převařit směs 200 ml odstředěného mléka 4-30 ml hovězího nebo koňského sera na 20 minut (ve vařiči vodě nebo v páře bez tlaku). 3. Vlijeme horký agar (bez ochlazování) do směsi mléka a sera za stálého míchání. 4. Přidáme hned nato 30 ml roztoku glukosy, 30 ml indikátorového roztoku, 30 ml roztoku vodní modře (vše stačí jednou pipetou). 5. Dobře promícháme a přidáme 20 ml glycerolátu. Opět promícháme, chvíli počkáme. 6. Na konec přidáme 10% louhu sodného (NaOH) tolik, aby půda měla olivově zelenavý, trochu okrový tón (zpravidla je množství louhu okolo 2 — 2,5 ml; přidání potřebného množství louhu je věcí krátkého cviku). Menší laboratoře vaří ze 150 m) a.garu s polovičním množstvím ostatních součástí. MoLeodova půda (Corynebacterium diphteriae) 57 Je to čokoládový agar, obsahující 0,04% telluritu. Od jiných půd se liší tím, že infuse není připravována za tepla, nezahřívá se nad 75 °C a sterilisuje se filtrací: 75 g rozemletého masa rozmělníme se 100 ml vody z vodovodu a macerujeme ve vodní lázni při 48 °0 60 minut. Přecedíme přes plátno, necháme přes noe v lednici a filtrujeme přes papír. Na 1000 ml filtrá,tu přidáme 20 g peptonu a 5 g soli NaOl a zahřejeme na 45°C, aby se pepton rozpustil. Z celého množství odebereme 50 ml půdy, zahřejeme 15 min. na 80 — 90 °C, přefiltrujeme přes papír, pak zjistíme, kolik ml N/10 louhu (NaOH) je zapotřebí k upravení 10 ml půdy na pH, 7,6. Zjištěné množství propočítáme na zbylých 950 ml půdy. Vypočítané množství louhu přidáime. Pak filtrujeme — nejdříve přes čeřicí, potom sterilisačni vložku Seit-zova filtru a uchováváme v chladu. Malá část filtrovaného bujónu se inkubuje tři dny v thermostatu, aby se zjistila event. kontaminace. Před upotřebením smícháme bujón se stejným dílem 5% agarového gelu ve vodě, přidáme 7—10% čerstvě odebrané králičí krve a přidá se 0,04% Kalium tellurosum (odpovídající množství čerstvě rozpuštěné v malém množství sterilní deštil, vody). Dobře promícháme, zahřejeme 10—15 min. na 75 °C a pak rozléváme do Petriho misek. Hissova sérová půda (Corynebacterium diphteriae) 58 1 díl sterilního koňského sera, 3 díly 0,1% peptonové vody. pH upravíme na 7,6, přidáme 1% Andradeho indikátoru (viz str. 62 půda č. 61) (lze použít i běžné koncentrace brom-thymolové modře nebo fenolové červeně, t. j. 1,5 — 2% "0,02% roztoku) a 1% substrátu (glukosa, saccharosa, škrob) rozplníme do zkumavek a sterilisujeme 30 min. v proudící páře po 3 dny. Tekutá půda pro Corynebacterium diphtheriae (Souček, 59 Novotný) Sterilní Hartleyův bujón pH 7,6—7,8................... 100 ml 3% vodný roztok CuS04 . 5HaO.................... 0,25 ml Koňské sérum............................ 5 m\ Roztok Kal. tellurosum........................ 2,5 ml Půda se rozplní po 2,3 ml do zkumavek 16 . 10 Roztok Kal. tellurosum: (Mueller db Miller) 20 ml 85% kyseliny mléčné se zředí na 50 ml destilovanou vodou, přidá se 1 kapka fenolové červeně a neutralisuje se 50% louhem sodným (NaOH) do červené barvy. Povaří se 5 minut a přidá se další louh je-li toho třeba, aby barva zůstala trvale červená. Pak se autoklavuje 15 minut při 120°O. Po vychladnutí se přidá: 10 ml ethanolu 0,5 mg calcium pantothenatu rozpuštěného v malém množství vody a autoklavovaného při 120° 15 minut r 50 ml sterilního koňského nebo hovězího sera 0,9 g čerstvého Kal. teílurosum rozpusteného v malém množství deštil, vody. Dojde-li k vysrážení, stačí mírně zalkalisovati roztok. Roztok se uchovává v lednici. Vj'drží asi 3 měsíce. Odebraný tampon se ponoří do půdy, inkubuje se v mírně nakloněné poloze tak, aby byl povrch půdy dobře provzdušněn a po 6 hodinách se přímo tamponem přeočkovává na krevní plotnu. Rozočkovává se kličkou. V případě, že budeme místo za 6 hodin vvočkovávat za 24, můžeme použít 7% vodný roztok CuSOä.5H20. Z krevní plotny můžeme ihned očkovat cukry, zhotovit preparát na metaehromatická tělíska a provést zkoušku toxicity. Bujón pro fagotypisaci salmonel 60 Připravíme bujón (viz str. 48, půda č. 1) a sterilisujeme 2 dny za sebou v Arnoldově přístroji po 60 min. Po rozplnění do zkumavek jej autoklávujeme 20 min. Uhlohydrátové půdy (P. pestis) 61 a) Andradeův indikátor: Připravíme 0,5% roztok kyselého fuehsinu v deetil. vodě. Do připraveného roztoku kyselého fuehsinu přiléváme postupně za pečlivého protřepávání K/1 roztok louhu (NaOH) v takovém množství, až roztok zrůžoví, poté zhnedne a konečně zežloutne (běžně asi po přidání 17 ml louhu). Takto připravený roztok se nechá stát při pokojové teploto 1 — 2 hod., zfiltruje se a uschovav tmavé nádobě. b) Zásobní roztoky uhlohydrátů připravíme jejich rozpuštěním do koncentrace 20% v deštil, vodě s výjimkou glycerolu. Roztoky se zfiltrují Seitzovým filtrem, rozplní do sterilních nádob a sterilisují varem po 30 min. Poznámka: Není-li možnost filtrace Seitzovým filtrem, je nutno sterilisaci varem opakovat ještě dva dny. Autoklávování poškozuje ulilohydráty (karamelisace). Príprava uhlohy drátový oh -půd Do 1 % peptonové vody připravené z dobrého peptonu se přidá Andradeův roztok (a) do koncentrace 1%. Po dobrém promísení se roztok sterilisuje v autoklávu po 20 minut při tlaku 1,5 kg/em2. Do vychladlého roztoku se přidá sterilně zásobní roztok příslušného uhlohydrátu (viz roztok b) do 1% koncentrace. Hotová půda se rozplní do zkumavek a sterilisuje varem (100 °C) po 30 minut. Hotové a rozplněné půdy se kontrolují na sterilitu 24hodinovou inkubací v thermostatu při 37 °C. Je možno použít také modifikace připravené přidáním 0,5 % agaru do tekuté půdy. Živný agar s hemolysovanou krví a s gentiánovou violetí 62 (P. pestis) A. 10% roztok gentiánové violeti v alkoholu. B. Krev hemolysovaná dvojnásobným zmražením. Půda se připraví tak, že k agaru (viz str. 49, půda č. 9) se přidají 2 % roztoku B a 0,01 % roztoku A. Nebo ja možno použít této půdy: K agaru s infusí z telecího masa přidáme 0,025 % natrium sulfitu NaaSOa (t. j. 0,25 ml z čerstvě připraveného 10% roľtoku) a 1/700% —1,400% gentiánové violeti (t. j. 1,5 — 2,5 ml z pečlivě připrat eného roztoku 1 : 1000 genti nové violeti) na 100 ml půdy. Množství gentiánové violeti musí být pečlivě předem vyzkoušeno, poněvadž ^někdy, už dávka 1/400 % inbibuje veškerý rnst. Vaječná půda podle McCoye (P. tularensis) 63 Vajíčka umyjeme kartáčem, mýdlem a pískem a sterilně rozklcpneme do láhve se zabroušenou zátkou. Dávají se 4 žloutky a 1 celé vejce (asi 150 ml půdy). K tomu přidáme objemových 40 % iysiol. roztoku 0,85%. Pak do láhve přidáme sterilně skleněné perličky a třepeme 15 minut. Necháme přes noc stát v lednici. Druhý den půdu sterilně plníme do zkumavek a pokládáme šikmo do inspisátom nebo Arnoldova přístroje, kde žloutky koa-gulují při 85 °C 45 minut. Kličkou zkoušíme, je-li půda po této době již dosti sražená. Klička se nesmí bořit. Vejce musí být čerstvá! Cystinový krevní agar podle Franoise (P. tularensis) 64 2% agar pH 7,2 rozvaříme a přidáme 0,1 — 0,2 g cystinu rozpuštěného ve 2 ml 10% sodnéhe louhu. K tomu přidáme 1 % glukosy (t. j. 5 ml 20% roztoku na 100 ml agaru) a sterilisujeme v proudící páře 20 minut. Po zchlazení na 50 °C přidáváme králičí defibrinovanou krev (5—10%) a plníme sterilně do zkumavek, které pokládáme šikmo; necháme ztuhnout.. Huddlesonův bujón z jater (bruoely) 65 Rozemeleme 500 g čerstvých (ihned po porážce) hovězích jater, přidáme 500 ml vody a vaříme 60 minut při častém míchání. Povařenou směs zahřejeme v autoklávu do 120 °C, přefiltrujeme, rozléváme do nádobek a sterilisujeme 20 min. při 115°C. Játrový agar (Huddlesonův) (bruoely) 66 agar ,................................. 20 g pepton (pro bručely netoxický) ................. X0g natrium chloratum NaOl........................ gg deštil, voda.............................. goo ml Směs vaříme v autoklávu 30 min., přidáme 500 ml játrového bujónu podle Huddlesona (viz půda č. 65), ochladíme na 60 °C, pH upravíme na 7,0. Kil půdy přidáme 1 vaječný bílek a vaříme 30 min. při 120 "C, filtrujeme přes několikrát složený mul, znovu zastavíme pH na 7,0, rozléváme do baněk a 20 min. sterilisujeme v autoklávu při 115 °0. Po sterilisaci klesá pH na 6,8—6,6. Kvalitu nové várky je vždy nutno ověřit kultivací sbírkových kmenů (ne příliš starých). Agar z jater a vemene podle Nikolského (bruoely) 67 Smísíme 400 g jemně mletého vemene a 400 g umletých hovězích jater a přidáme 1 litr deštil, vody. Vaříme v proudící páře, po 20 minutách nádobu vyjímáme, tekutinu velmi důkladně promícháme, znovu vaříme v proudící páře po 90 minut, filtrujeme přes několikrát složený mul, vývar rozléváme do baněk a sterilisujeme 20 minut při 115 °C. Pro zhotovení agaru přidáváme k 400 g vývaru z jater a vemene 600 ml deštil, vody, 25 g agaru, 10 g peptonu, 5 g soli (NaCl) a vaříme 30 minut, pH zastavíme na 7,0 — 7,2, ochladíme na 60 °C, vyčeříme vaječným bílkem a vaříme 60 — 90 minut do úplného prosvětlení. Filtrujeme přes několikrát složený mul rozléváme a sterilisujeme 20 minut při 115 C» v autoklávu. Půda pro záchyt bručel z kontaminovaného materiálu 68 Selektivní isolaci bručel (jde-li o Gp kontaminanty) zajistíme přidáním 2 — 5 jednotek penicilinu na 1 ml kultivačního prostředí (játrového agaru). Kenouxova půda (eliminace plísní, protea, pseudomonad, bac. subtilis při kultivaci bručel) 69 Albimi agar........................... . . 100 ml Actidion.............................. 10 mg Polymyxin B............................. 300 j. Bacitracin ............................. 1250 j. Circulin............................... 1500 j. ethylvioleť ............................1 : 800.000 Levinthalův agar (Hemophilus infl.) 70 200 ml 1,5% živného rozpuštěného agaru zchladíme na 60— 70°0, doplníme pomalu za stálého míchání 10 ml defibrinované králičí krve, krátce povaříme, rychle odstavíme, promícháme a znovu zahřejeme až na bod varu. Získaná tmavohnědá tekutina s vločkami sera se přefiltruje vatovým filtrem při teplotě 60 °C. Filtrát, který je bezbarvý, ihned vyléváme do Petriho misek nebo do zkumavek. Shopeho krevní vařený agar (Hemophilus in.fl.) 71 agar................................. 10 g natrium chloratum NaCl........................ 2,5 g pepton Witte............................. Cg bujón ................................ 500 ml pH půdy upravíme na 7,5, půdu sterilisujeme, po ochlazeni na 60 "C přidáme 25 ml čerstvé deflbrinované koňské krve, promísíme a zahříváme 60 minut na 60 — 65 °G ve vodní lázni. Pak půdu vyléváme do Petriho misek. Půda s X- a V-faktorem (Hemophilus infl.) 72 Půdu s X-faktorem připravíme z 5 ml peptonové vody a 1 ml 1 % roztoku hematinu. Půdu s V-faktorem lze zhotovit z 5 ml peptonové vody a 1 ml kvasnicového extraktu nebo z 5 ml 3denní kultury bílého mikrokoka v peptonové vodě, přefiltrované Seitzovým filtrem. Legrouxův výtažek z erythrocytů 73 Připravuje se z deflbrinované krve, která se smíchá s dvojnásobným množstvím fysiol. roztoku ve vodní lázni při 80 °C až do zahřátí krve na tuto teplotu. Pak se směs filtruje přes filtraéuí papír a nakonec přes ÍSeitzův íiltr. Modifikace Bordet-Gengouovy půdy (Hemophilus pert.) 74 A. Příprava extraktu z brambor: rozkrájené brambory................-.........500 g glycerolum conc. puriss......................... 40 nll deštil, voda.............................. 1000 ml Omyté a dobře okrájené brambory rozkrájíme na kostky (1x1 cm) a přidáme k směsi deštil, vody se 4 % glyceroiu. Po 30 min. povaření v proudící páře (100 °0) se extrakt zflltrujo přes gáz a doplní deštil, vodou na původní objem. Poznámka: Důležité je dodržení doby i stupně teploty při zahřívání. Při filtraci přes gáz se nechá extrakt, samovolně prokapat, bez násilného promačkávání. Extrakt má být pokud možno čistý. Výtažek z brambor se musí použít k přípravě agarové base téhož dne, kdy byl připraven. y Brambory se smí krájet nejdéle 18 hod. před použitím, jsou-li uchovány při 0 — 5 °C. B. Příprava agarové base: bramborový extrakt.......................... 1000 ml deštil, voda............................... 3000 ml natrium chloratum NaCl ....................... 18 g pepton (Organofarma)......................... 40 g agarová řasa ............................. 120 g Směs se povaří v proudící páře do rozpuštění ingrediencí, reakce se upraví s pomocí 20% roztoku sody na pH 7,4. Opět se krátce povaří (15 min.!) a zfiltruje přes vatu. Filtrát se rozplní do zásobních Érlenmayerových lahví ve vhodných množstvích a vysterilisuje se 30 min. zahřátím v páře pod tlakem (121 °C). Hotová base se uloží do lednice. Poznámka: Velmi důležitá je přesná úprava pH. Při nižších hodnotách pH ztrácí půda elektivitu, při vyšších hodnotách pak při inkubaei v thermostatu dochází k tmavému zbarvení půdy (čokoládový agar) a až k celkové hemolyse prostředí. Zpětná titrace pH není možná. Alkálie na žádanou hodnotu nutno přidávat pomalu a opatrně. Těsně před steriiisaci se autokláv předehřeje, aby v čase pokud možno nejkratším bylo dosaženo teploty 121 °C. Po skončení slerilisace se otevře výstupní kohout, aby teplota v autoklávu rýchle klesala. C. Příprava půdy agarová base.............................. 1000 ml beraní defibrinovaná krev........................ 250 ml Zahřátim v proudící páře 100 "O se base rozpustí a po ochlazení na 45 — 50 °C se přidá sterilní defibrinovaná krev, předem ve vodní lázni zahřátá na 45 — 50 °C. Půda se vylévá do ploten, které se musí upotřebit do 72 hod. Poznámka : Použitá krev má být čorstvá. Maximální hranice použitelnosti krve je 48 hod. po odběru. Před použitím sušíme půdy v thermostatu při 37 "O tak, aby nebyly zcela vysušeny. V f bujón (anaeroby) 75 4 kg libového rozemletého hovězího masa a 1 kg rozemletých hovězích jater se promíchá s 18 litry vody (studniční nebo destilované) ve smaltované nádobě. Zahřeje se na 50 °C, přidá se 200 ml 10% kyseliny solné (HOl), chemicky čisté, důkladně se promíchá a na povrch tekutiny se nasype odvážené množství pepsinu.*) Množství pepsinu se řídí podle jeho titru; vypočítané množství však zvyšujeme o polovinu (na př. máme-lipepsin o titru 1 : 10 000, pak bychom potřebovali 0,5 g — předpokládejme, že máme skutečně 5kgbílko-vin — užijeme však 0,75 g). Potom směs trávíme 20 hodin při 50 °0 ve vodní lázni. Po této době má být positivní reakce biuretová i reakce na tryptofan.**) Trávení přerušíme zahřátím na 85 °C. Potom tráveními přecedíme přes smaltovaný cedník, pH upravíme 5N louhem (NaOH) na 5,6 a zahřejeme do varu, který udržujeme 5 minut. Po vychladnutí přefiltrujeme filtračním papírem a upravíme SN.NaOH na pH 7,4. K části přidáme 1,5 % peptonu Organofarma (pro přípravu bujónů s játry, krevního agaru a j., část necháme bez peptonu (na Vf bujón s glukosou). Po rozpuštění znovu upravíme pff a sterilisujeme v autoklávu při 120 °C 20 až 30 minut. Vf bujón s glukosou (anaeroby) . 76 Na 11 Vf bujónu bez peptonu přidáme 8 g glukosy, rozplníme ve vysokých vrstvách (10 ml do zkumavek 14x180) a sterilisujeme po úpravě pH 20 minut při 120 "O v autoklávu. Robertsonova půda (půda s vařeným masem) (podle osobního sdělení B. C. J. G. Knighta) 77 Srdeční sval je lepší než maso, neboť obsahuje asi dvojnásob lipidů; ale může se užít obyčejného hovězího masa, není-li dostatek srdočního svalu: 500 g. čerstvého srdečního svalu se rozemele a po částech se vhazuje do 500 ml vroucího N/20 ÍTaOH ve smaltované nebo skleněné nádobě a nechá vařit 20 minut. Ke konci této doby se ukončí neutralisaco mléčné kyseliny a pH tekutiny má být asi 7,5. Tekutina se odstraní přes několikrát složený gáz a maso, dokud je teplé, se vymačká a nechá částečně oschnout rozprostřeno na plátně nebo na kusu filtračního papíru. Mletí masa mělo být jemné, aby po částečném osušení vznikaly částečky 1 — 2 mm v průměru, t. zn. ani příliš drobné, ani velké, aby nevznikaly hroudy. Po částečném oschnutí se částečky nasypou do zkumavek 16 cm v takovém množství, aby vznikl sloupec 5 cm vysoký; pak se přidá bujón s 1 % peptonu (pH 7,4), aby tekutina stála asi 2 cm nad masovými částmi. Pro některé účely stačí vrstva masových částic silná 2 cm (ale pak sahá výška bujónu 5 cm nad povrch masa). Po zazátkovánl se sterilisuje autoklávováním při 120 °C; před autoklávováním se však zkumavky zahřívají 30 minut ve vroucí vodní lázni, za občasného protřepávání, aby se vypudily vzduchové bubliny. Kdyby se to neudělalo, pak by masové částice neutvořily souvislý sloupec na dně zkumavky. Inokulum zavádíme na dno zkumavky! Hartleyův bujón 78 hovězí srdce nebo libové hovězí (bez tuku a jemně umleté) ......... 1500 g deštil, voda.............................. 2500 ml Smíchá se a zahřeje v parním sterilisátoru, až teplota dostoupí 80 °C. Pak se přidá: 0,8% roztok natrium oarbonieum sice. (studeného) NaaCOa ........ 2500 ml *) Místo pepsinu můžeme použít vepřových žaludků. Na uvedené množství masa potřebujeme jeden až dva čerstvé vepřové žaludky, které dobře očistíme, opláchneme vodou, jemně Tozemeleme a přidáme k suspensi masa. Použití vepřových žaludků má dokonce tu přednost, že žaludeční sliznice obsahuje nedefinované růstové faktory pro řadu anaerobů. **) Biuretová reakce: 5 ml tráveniny mírně zalkalisujeme N/20 NaOH a přidáme několik kapek velmi ředěného roztoku CuSN4 Při positivní reakci vznikne fialové zabarvení. XJtvoří-li se sraženiua Gu(OH2, odfiltrujeme ji. Reakce na tryptofan: 5 ml tráveniny se okyselí několika kapkami H2S04 a přidá se několik kapek (1—3) 5% roztoku p-dimethylaminobenzaldehydu ve zředěné H2S04. r Ochladí se na 45 °0 a přidá se: pankreatický extrakt podle Cole a Onslow................ 50 ml chloroform.............................. 50 ml Směs se pak inkubuje ve vodní lázni při 37 °C 6 hodin nebo při 45 "O 3 hodiny, za občasného protřepávání. Po ukončení trávení se přidá 40 ml konc. kyseliny solné (HC1) (chem. čisté), zahřívá 30 minut v páře a filtruje. Potom se pH upraví na 8,4 (fenolftalein) 5N louhem (Na OH) a zahřívá v páře 60 minut, aby precipitovaly fosfáty. Přefiltruje se za horka a nechá vychladnout. pH se upraví na 7,6 kyselinou solnou, rozplní podle potřeby a sterili-suje 20 minut při 120 °C v autoklávu. Pankreatický extrakt (Cole a Onslow): čerstvé vepřové pankreasy (bez tuku a rozemleté)............ . 500 g deštil, voda . ............................ 1500 g alcohol ethylicus 96%......................... 500 g Směs se promíchá ve velké zazátkované láhvi a nechá stát 3 dny při pokojové teploto, za občasného protřepávání. Pak se přecedí přes mul a filtruje přes papír. Filtrát se změří a přidá se chemicky čisté koncentrované kyseliny solné v množství 0,1 %. Tím vznikne precipitát, který sedimentuje během několika dní a může být odfiltrován. Je to však zbytečné. Extrakt vydrží v zazátkovaných lahvích měsíce. Používá-li se ihned, pak není třeba přidávat HC1, jíž se konservuje trypsin. Eildesův bujón s pepticky natrávenou krví 79 Směs 150 ml fysiol. roztoku, 6 ml čisté PICÍ, 50 ml defibrinované beraní krve a 1 g pepsinu se zahřeje na 55 °C v zazátkované láhvi na 2 — 24 hodin. Potom se přidá dostatek 20% roztoku NaOH (obyčejně kolem X2 ml), dokud vzorek směsi ředěný vodou nedává hyper manganové zabarvení s kresolovou Červení. Potom se přidá čistá HC1 po kapkách, až vzorek nemění barvu s kresolovou červení, ale jasně červeně se obarví červení fenolovou. Je nutno se vystříhat přebytku kyseliny. Přidá se 0,25 % chloroformu a důkladně se protřepe. Vydrží měsíce v zazátkované láhvi. Před upotřebením se zahřeje na 55 °C po dobu 30 minut, aby se odstranil chloroform, a přidává se k bujónu nebo agaru v množství 2-5 %. Bujón s játry (anaeroby) 80 Morěecí, králičí nebo telecí játra se rozkrájej í na přiměřeně velké kusy, vloží do velké Petriho misky a koagulují 30 minut v proudící páře. Po koagulaci se rozkrájejí na kousky velikosti drobné fazole a vhazují se po dvou až třech do zkumavek 14x 180 mm. Pak se přelijí Vf bujónem (s peptonem) o pH 7,4 a autoklávují 20 minut při 120 °C. Mléko s redukovaným železem (Spray) (anaeroby) 81 Čerstvé plnotučné (neegaíisované) mléko silně odcentrifugujeme, zbavíme smetany a roz-plníme do zkumavek 14x160 mm po 10 ml. Na dno zkumavek bylo předem nasypáno 0,05 — 0,1 g redukovaného železa (pro analysi). pH půdy kolem 6,8 —* pH však neupravujeme. Sterilisace 20 minut při 120 °C. Po sterilisaci se ihned vychladí ve vodě. Nepoužíváme starší než 7—10 dnů. Lze připravit i ze sušeného mléka (100jg na 1000 ml deštil, vody), avšak výsledky nejsou tak dobré jako s mlékem čerstvým. Zelatina (anaeroby); 82 želatina lístková......................,...... 50 g pepton................................ 10 g natrium phosphoricum bibas. Na2HP04................. 2 g glukosa . ,............................. 1 g deštil, voda.............................. 1000 ml pH se upraví po rozpuštění za tepla na 7,4. Je-li třeba, filtruje se přes papír v proudící páře. Rozplňuje se do zkumavek 14x 160 mm po 10 ml. Do zkumavek předem nasypáno po 0,05—0,1 g redukovaného železa. Pro některé nesporulující jsou vhodné kousky jater, jako u bujónu s játry. Mozková kaše (anaeroby) 83 Telecí nebo beraní mozky se zbaví plen a cév. Rozdrtí se v turmixu nebo rozemelou na masovém strojku. Na 100 g mozkové tkáně se přidá 100 ml vody, přidá se 1 % peptonu a0,l % glukosy a vaří se zvolna 30 minut. Za důkladného míchání se rozplriuje po lOmldo zkumavek 14 X 180 mm. Do zkumavek bylo předem nasypáno po 0,05—0,1 g redukovaného železa. Sterilisuje se 30 minut při 120 °G v autoklávu. Před autoklávováním se doporučuje zkumavky zahřívat ve vroucí vodní lázni za občasného protřepávání 30 minut, aby se vypudil vzduch a sloupec mozkové tkáně zůstal souvislý. Po sterilisaci nutná kontrola sterility inkubací při 37°0 nejméně 24 hodin. Půda z kukuřičné mouky pro klostridia butyl-butyrické skupiny (McClung a McGoy) (anaeroby) 84 50 g bílé nebo žluté kukuřičné mouky se suspenduje v 1000 ml vody. Zahřívá se v páře 60 minut za příležitostného třepání. Ochladí se na pokojovou teplotu, rozplní ve vysokých vrstvách do zkumavek a sterilisuje 45 minut při 120 °C v autoklávu. Půda drží anaerobiosu značně dlouho. Regenerace po 4—5 dnech. Bramborová půda pro klostridia butyl-butyrické skupiny (MeClung) (anaeroby) 85 Rozemele se 200 g čerstvě okrájených brambor. Přidáme 1000 ml vody a zahříváme 30 minut v páře nebo pozvolna vaříme až vznikne řídká kaše. Potom přecedíme přes smaltovaný cedník, přidáme 5 g glukosy, 3 g uhličitanu vápenatého OaOOs a 1 g síranu amonného (NH4)2 S04 doplníme na 1 1. Ochladíme a rozplníme za stálého míchání ve vysokých vrstvách do zkumavek tak, aby byly kousky brambor stejnoměrně rozděleny. Půda se dobře hodí pro sporulaci mikrobů butyl-butyrické skupiny. Breweroya půda (anaeroby) 88 Lze připravit takto: K Vf-bujonu (s peptonem)*) přidáme 0,1 % thioglykolátu sodného, 0,05 % agaru, až do 1% glukosy a 0,002 % methylenové modři (t. j. 1 : 500 000). Součásti rozpustíme za mírného zahřívání, upravíme pH na 7,4 a rozplňujeme po 12 ml do zkumavek 14 X 18 mm. Sterilisujeme autoklávováním při 120 °0 za 20 minut a skladujeme za pokojové teploty. Krevní plotny pro anaeroby 87 K Vf-bujonu s peptonem*) přidáváme 2 — 2,5 % agaru a 5 — 10 % defibrmované krve beraní, koňské nebo králičí. Můžeme použít i krve cítrátové (10 ml 10% roztoku citrátu sodného vysteriiisujeme v láhvi, do které se má odebrat 500 ml krve). Pro velice citlivé anaeroby, zejména nesporulující, je výhodné přidat 8 — 20% králičí krve t'sně před litím ploten odebrané kardiální punkcí. Rozléváme ve stejně vysoké vrstvě jako běžné krevní plotny. Zeissler doporučuje přidat pro diagnostiku sporulujících anaerobů ke krevnímu agaru glukosu. 1 % je dostatečné množství. Žioutková plotna (McClung, Toabe) (anaeroby) 88 Proteose-pepton č. 2 (Difco nebo jiný) ................. 40,0 g natrium phosphoricum dibas. Na3HP04................ 5,0 g kalium phosphoricum monobas. KH2P04................ 1.0 g kalium chloratum NaCl ....................... 2,0 g magnesium chloratum MgS04..................... 0,1 g glukosa............................... 2,0 g agar................................ 25.0 g deštil, voda............................. 1000,0 ml pH se upraví na 7,6 o sterilisuje se 20 minut při 120 °C Nemáme-H k disposici dobrý proteoaový pepton, připravíme půdu z Vf bujónu,*) ke *) Nebo jinému trávenému bujónu. kterému přidáme 3 % peptonu Organofarma a ostatní součásti podle shora uvedeného předpisu; nepřidáváme však NaCl (a samozřejmě — také žádný další pepton). Na každých 90 ml sterilní a na 50 °C vychladlé půdy se přidává 10 ml žloutkové suspense: čerstvá vejce se vydrhnou a spláchnou sublimátovým roztokem. Nechají oschnout. Bílek se odstraní a žloutek se vlije do sterilní nádoby, roztřepe, zředí stejným objemem fysiol. roztoku a promíchá po uzavření gumovou zátkou. Za sterilních podmínek vydrží suspense asi týden v lednici. Pak už ji nelze upotřebit. Rozlévá se do Petriho misek běžným způsobem. Tvrdá agarová plotna (anaeroby) 89 K Vf bujónu se 3—4 % peptonu se přidá 4—5—6 % agaru, upraví na pH 7,2 — 7,4 a sterilisuje po rozpuštění v proudící páře autoklávováním 20 minut při 120 °C. Rozlévá se běžně do ploten. Hloubkové agary (Veillon) (anaeroby) 90 K Vf bujónu s peptonem nebo i bez peptonu přidáme 0,8 % agaru a 0,25 % glukosy. Upravíme pH na 7,2 — 7,4 po rozpuštění součástí a za tepla rozléváme do zkumavek 8 x ISO mm tak, aby byly vrstvy aga.ru asi 7 cm vysoké. Sterilisujeme 20 minut při 120 0O v autoklávu. Pro některé oitlivé nesporulující anaeroby, které v této běžné půdě nerostou, lze přidat globulární extrakt: Beraní krev se hemolysuje 4 objemy deštil, vody. Na každou zkumavku se přidává po rozehřátí a vychlazení na 50 °C po 0,5 — 1,0 ml. Půdy pro průkaz proteolysy (91 — 95) (anaeroby) Alkalická vaječná půda (McGlung) 91 2 žloutky a 4 bílky se emulgují v turmixu. Přidá se 1000 ml deštil, vody a 12 ml N-NaOIi. Znovu se důkladně promíchá v turmixu. Jeden díl suspense se smísí s pěti díly bujónu (s peptonem), rozplní do zkumavek ve vysokých vrstvách a autoklávuje se 20 minut přil20 °C. Půda je bělavě opaleskujíeí. Proteolysa se projeví vyjasněním. Mléčný agar k průkazu proteolysy (Reed a Orr). 92 Smícháme stejné množství sbíraného mléka (po případě rekonstruovaného z prášku) a agaru (Vf bujón s agarem). Autoklávujeme odděleně a smícháme před naléváním. Proteolysa se projeví širokou čistou zónou kolem kolonie. Agar k průkazu fibrinolysy (Christie a Wilscm) 93 Smícháme 12 ml sterilní králičí plasmy se 100 ml sterilního agaru (Vf bujónu s peptonem a 2 % agaru). Zahříváme ve vodní lázni při 56 0 10—15 minut, dokud se agar nezakalí do mírné opaíescence. Pak se rozlévá do misek. Plotny se naočkují zkoumaným kmenem a inkubují (anaerobně) 48 hodin při 37 °C a pozoruje se, zda nevzuiká vyjasnění kolem kolonií. To značí tvorbu fibrinolysinu. Kostky koagulovaných bílkovin 94 Vaječný bílek nebo koňské sérum se zředí stejným dílem deštil, vody, vylije se do Petriho misky a koaguluje se v páře při 80 — 90°. Po koagulaci se nakrájejí skalpelem kostky 5 X 5 mm, vhazují do zkumavek s Vf bujónem (nebo jinvm) a sterilisuje se v autoklávu 20 minut při 120°. Tekutá půda s vaječným bílkem (Reed) 95 K bujónu (Vf nebo jinému — s peptonem) se přidá 5 — 8 % vaječného bílku (nebo 8—10 % koňského S9ra). Promíchána v turmixu několik vteřin, necháme ustát pěnu, rozplnírne ve vysokých vrstvách do zkumavek a autoklávujeme 20 minut při 120 0O. Proteolytický kmen půdu vyjasní. Půda pro kultivaci D. pneumosintes a spirochet (Smith a Noguchi) 96 (anaeroby) K 10 ml sterilního ascitu nebo koňského sera (zředěného fysiol. roztokem v poměru 1 : 8) ve zkumavce se přidá část čerstvé a sterilně odebrané králičí ledviny nebo varlete, přelije se vrstvou parafínového oleje a očkuje. Lze přidat sterilní roztok thioglykolátu sodného, aby jeho konečná koncentrace byla 0,1 %. Polotuhá Noguchiho půda: 2 díly živného agaru se zředí 1 dílem sterilního ascitu a rozplní se do sterilních zkumavek obsahujících část sterilně odebrané králičí ledviny. Základní půda pro stanovení kvasných vlastností (anaeroby) 97 Je 2% peptonová voda, ke které přidáme 0,25 % agaru a 1 % zkoušeného uhlohydrátu, alkoholu či jiného substrátu. pH se upraví na 7,4. Autoklávujeme 15 minut při 115 °0. Pouze xylosu, arabinosu, levulosu a maltosu přidáváme ve formě 10% vodného roztoku sterilisovaného filtrací. Samozřejmě, že se půda plní ve vysokých vrstvách, očkuje se až ke dnu a pro běžné anaeroby není třeba uzavírat vaselinou ani parafinovým olejem. Indikátor se přidává až po skončené kultivaci, t. j. nejčastěji za 48 hodin. Nejlépe se osvědčila směs indikátorů: 0,04% lihový roztok bromthymolové modře se stejným dílem 0,02% lihového roztoku methylenové červeně. Při slabším okyselení (pH kolem 6,2) se indikátor zabarví žlutě, při pH pod 5 červeně. V případě, že se chceme o reakci půdy přesvědčit během růstu, odpipetujeme část kapilární pipetou a reakci provedeme na hodinkovém sklíčku. Půda pro zjištění tvorby NO', z NO'3 (anaeroby) 98 Pepton Organofarma 2%; fosforečnan sodný střední (Na2HP04) 0,2%; glukosa 0,1%; agar 0,1%; dusičnan draselný (KNOa) 0,1% v deštil, vodě. Upraví se na pH 7,4. Rozplní se ve vysokých vrstvách a autoklávuje 15 minut při 120 °C. Test: Při positivním růstu (nejčastěji po 48 hodinách kultivace) so přidá ke zkumavce několik kapek ředěné kys. sírové (H3S04) a několik kapek roztoku jodidu draselného ve škrobovém mazu (ke 2% škrobovému mazu se přidá 1% KJ. Roztok nevydrží dlouho — je lépe vždy připravit čerstvý). Zmodrání, až zčernání značí positivní test (tvorbu N0'2). Půda pro zjištění tvorby indolu a skatolu (anaeroby) 99 Tryptonu Difco 2%; fosforečnanu sodného středního (Na2HP04) 0,2%; glukosa 0,1%; agar 0,1% v deštil, vodě. pH se upraví na 7,4, rozplní ve vysokých vrstvách do zkumavek a sterilisuje se 15 min. při 120 °C v autoklávu. Nemáme-li k disposici trypton, použijeme jiného peptonu, připraveného tryptiekým na-trávením. Musíme však vyzkoušet, zda sterilní půda nedává již positivní reakci a zda na př. E. coli je schopna z daného peptonu indol tvořit. Jako základu můžeme však velice dobře použít Hartleyova bujónu (půda č. 78, str. 65), k němuž přidáme glukosu a agar v uvedeném množství. Pudu není třeba pro běžné anaeroby uzavírat vaselinou. Provedení testu (Roesler, McClung): Po 48hodinové inkubaci přeneseme kapilární pipetou 2 kapky kultury ode dna zkumavky na hodinové sklíčko, podložené bílým papírem. Přidáme 2 kapky roztoku vanilinu a 3 kapky kone. HC1. Tvoří-li mikrob indol, vznikne oranžové zabarvení. Je-li přítomen ska-tol, zbarví se zkouška fialově. Fialová barva skatolu se změní po přidání 1 kapky 0,1% NaN02 na temně purpurový tón, kdežto barva indolu se nemění. Hodinové sklíčko po provedení testu autoklávujeme. Rozloh vanilinu: 5% vanilinu v 95% ethanolu. Půda pro zjištění tvorby H2S 100 Půda 1: (Reed, Orr) Proteose-pepton 2%; fosforečnanu sodného středního (Na2HP04) 0,2%; glukosa 0,1%; agaru 0,2% v deštil, vodě. pH upravíme na 7,4 a na 1 litr přidáme 10 ml roztoku eitronanu vismutito-amonného v deštil, vodě (1,5% roztok). Rozplnírne ve vysokých vrstvách a autoklávujeme 15 minut při 120°. Půda 2: Základem je kterýkoli natrávený bujón (Vf bujón, Fildesův, Hartleyův), k němuž bylo přidáno fosforečnanu sodného středního (Na2HP04) 0,2%; glukosy 0,1 %;agaru 0,2%. Rovněž přidáváme 1,5% roztok oitronanu vismutito-amonného v uvedeném množství nebo 0,02% octanu olovnatého. Při užiti 0,02% octanu železitého se půdy značně zkalují. Positivní test: černáni půdy bud v celém sloupci nebo u dna. Mléčný bujón pro kultivaci botulinických klostridií 101 (anaeroby) bujón (Vf, Hartleyův nebo Fildesův) — s 2% peptonu.......... 1000,0 ml sušené mléko............................50,0 g glukosa .............................. 2,0 g natrium phosphoricum monobas. NaaHP04 . 12HaO........... 8,0 g kalium phosphoricum monobas. KH2P04 ............... 1,0 g pH se upraví na 7,4 před sterilisací. Přefiltrujeme přes mul. Rozlijeme jednak po 180 až 200 ml do „neutrálek" o obsahu 250 ml a do zkumavek 14 X 180 mm po 10—12 ml. Nikdy nepoužívejme tenkostenného skla! Sterilisace v autoklávu 20 minut při 120 °C. Ihned po sterilisací ochladit ve studené vodě a očkovat. Půdy pro diagnostiku anaerobních, mikrokoků (Douglas, Foubert) (anaeroby) (102—103) Půda pro zjištění zkvašování mléonanu nebo glucidů 102 Pcpton Difco (nebo jiný)....................... 20,0 g Kvasničný extrakt (Difco nebo jiný)................. . 20,0 g mléčnan sodný (nebo glucid) ..................... 10,0 g Thioglykolátu sodného........................ 1,0 g methylenová modř.......................... 2,0mg destií. voda..............•............... 1000,0 ml pH se upraví na 7,3 před sterilisací. Rozplní se ve vysokých vrstvách a autoklávuje 20 minut při 120 °C. Po inkubaci se přidá kapka indikátoru, jehož složení uvedeno u popisu půdy pro zjišťování kvasných vlastností (viz str. 69, půda č. 97). Půda pro stanovení tvorby plynu z peptonů (anaeroby) 103 Má stejné složení jako předchozí, ale bez mléonanu sodného (nebo glucidu) a s 0,8% aga.ru. Po rozehřátí sterilní půdy patřičně ochlazené se naočkuje zkoumaná kultura, důkladně se zamíchá a vychladí ve studené vodě. Tvorba plynu se pozná podle bublin vzniklých během růstu. Poloselektivní půdy pro pomnožování mikrobů blízkých aktino-mycetám 104 K 10 ml půdy (Vf bujón s játry, Vf s glukosou, Hartleyův bujón, Robertsonova půda a j.) čerstvě regenerované a ochlazené přidáme 0,1—0,2 ml 1% roztoku anilinových barviv (krystalová violeť, methylenová modř, malachitová nebo gentianová zeleň). Konečná koncentrace barviva je 1 : 10 000—1 : 5000. Ihned po přidání barviva očkujeme a zalepíme rozehřátou vaselinou. Pro jedno inokuluxn lze užít několika ředění — po případě i ředění vyšších. Během kultivace se půdy často částečně odbarvují. Hodí se zejména pro fusobakterie a leptotrichy, nekrobakterie a borrelie. Též aktinobakterie lze s úspěchem pomnožovat — ovšem nikoli ve zcela čisté kultuře. Po několika dnech kultivace vyočkováváme na krevní plotnu inkubovanou v anaerobiose. Bramborová půda 105 Zdravé brambory se dobře očistí a rozkrájej! na řezy, které se na 60—120 minut ponoří do roztoku (1%) sody. Po osušení se vloží do Rouxových zkumavek, dole zaškrcených, a steří-lisují se 20 min. v autoklávu při 120 °0. Glyeerinované brambory 106 Řezy připravené jako u půdy č. 10S se ponoří na 48 hod. do vody nebo bujónu s S—6 % glycerinu. Pak se vloží do Rouxových zkumavek a aby nevysychaly, přilije se něco glycerinového bujónu, který zůstane v zaškroené spodní části zkumavky. Storilisuje se 20 min. v autoklávn při 120 °C. Obr. 3. Kompletní rozplňovací Obr. 4. Improvisovaný roz-násoskový přístroj, skládající plňovací přístroj zhotovený se ze vzdušného vatového filtru, z Erlexrmayerovy baňky. ' zásobní láhve na sera, z násosky a zvonečku. Tekutá ascitová půda podle Šuly (Mycobacterium tbc) 107 Základní roztok: natrium phosphoricurn dibas. N"a2HP04 . 12 H20........... 1,25 g kalium phosphor, monobas. KHaP04 ................ 0,75 g magnesium sulphuricum MgS04 . 7 HaO............... 0.25 g natr. citricum.......................... 1,25 g ferriammonium oitricum...................... 0,025 g casein hydrolysát 10% IG..................... 25 ml glycerol bidest. spec. váha 1,26................... 15,00 ml 0,2% vodný roztok malachitové zeleně................. 1 ml deštil, voda.....■....................... 1000 ml Po rozpuštění solí základní roztok autoklávujeme 30 mih. při 120 °C a k chladnému přidáme za sterilních kautel 100 ml sterilní ascitové tekutiny o obsahu nejméně 1 % bílkoviny, měřeno podle Esbacha. Půda se musí rozplnit za přísně sterilních podmínek, nejlépe rozplňovacím aparátem (viz obr. 3), pokud je to možné, ve zvláštním boxu. Prakticky vystačí i improvisace se zásobní lahví (viz obr. 4). Do zkumavky se rozplňuje tekutá půda po 5 ml a potom se pro kontrolu sterility ukládá na 48 hodin do thormo3tatu 37 "O a část těchto zkumavek na 48 hodin do pokojové teploty. Sérii půd, které se zakalily bud v pokojové teplotě, nebo v thormostatu, vyřazujeme. Slabé vyvločkování po zkoušce sterility, je-li jinak půda čirá, neni na závadu, ale ztěžuje spolehlivost makroskopického odečítání kultur. Koncentrovaná půda pro kultivaci tbc 108 Koncentrát připravovaný Výzkumným ústavem tuberkulosy a rozesílaný bakteriologickým laboratořím obsahuje všechny chemikálie a ascites v lOnásobné koncentraci. Ascites je nahrazován hovězí plasmou, hovězím sérem nebo lidským serumalbuminem. Před rozplňo- váním se koncentrát ředí 1 : 10, t. j. 1 láhev a 100 ml koncentrátu +900 ml sterilní deštil, vody (autoklávované). Po ředění ukládáme láhev s půdou na 24 hodiny do thermostatu při teplotě 37 °C a potom na 24 hodiny do pokojové teploty. Teprve potom půdy rozplňujeme do zkumavek (stejně jako tekuté Šulovy půdy). Půda se serumalbuminem je vždy naprosto čirá (má jiskru), kdežto půda s hovězím sérem se ihned po slití s vodou mírně zakalí. Tento zákal po inkubaci v thermostatu sedimentuje. V půdách s hovězí plasmou nebo ascitera se někdy vytváří fibrinová vločka. Je-li již koncentrát zakalen v originální lahvičce nebo obsahuje-li vločky, je nutno jej do deštil, vody přefiltrovat přes Seitzův filtr o průměru 6 cm. Používá-li se větší Seitzův filtr (o průměru 14 cm), je velká ztráta malachitové zeleně na filtrační vložce a k ředicí vodě muaíme pak přidat patřičné množství malachitové zeleně, t. j. 0,5 ml 0,15% vodného roztoku na 1000 ml půdy. Při přípravě půd z koncentrátu je nutno dodržovat nejpřísnější podmínky aseptické práce. Sautonova půda (BK) 109 Asparagin.............................. 4,0 g Glyceol.............................. 60,0 g aoid. citricum............................ 2,0 g kalium phosphoricum bibas. K3HP04................. 0,5 g magnesium sulphuricum MgS04 ................... 0,5 g ferro ammonium citricum ...................., . 0,05 g deštil, voda............................. 1000,0 ml Vaječná půda s kaseinovým hydrolysátém (modifikace Loewenstein- Jensen-Holm) 110 Základní roztok kalium phosphoricum monobas. KH2F04 ......,......... 4 g. magnesium sulphuricum MgS04.................... 0,4 g ííatriumcitricum........................... lř7 g Hydrolysát kaseinu 10%....................... 50,0 g Glycerol (bidestil.) spec. váha 1,26 ................... 20,0 ml deštil, voda (bidestil.) ........................ 1000,0 ml Příprava půdy : 600 ml základního roztoku se autoklávuje 30 min. při 120 "O, potom se ochladí. Láhev s roztokem solí se dá do vodní láznč, přidá se 30 g bramborové moučky (škrobu) a opatrně za stálého míchání se zahřívá až do varu, Čímž se vytvoří hustá klihovitá suspense. Potom se vaří ještě 15 minut, ochladí se na 56 °C a přidá se 11 roztřepaných vajec (asi 22). Vajíčka musí být Čerstvá, a to nejlépe od slepic krmených zeleným. Nevhodná vejce jsou chlazená, neboť uvolněné mastné kyseliny ve starších nebo konservovanýcli vejcích mají silný inhibiční vliv na BK, takže půdy z těchto vajec připravované poskytují vesměs negativní výsledky. Vajíčka důkladně očistíme v mýdlové vodě kartáčkem, potom je otíráme 96% alkoholem, necháme zaschnout a skořápku otevřeme sterilní pinsetou a vajíčka vypustíme do neutrální láhve s perličkami. Do nádoby dáváme vaj íčka j edno po druhém za stálého míchání, aby se dokonale roztřepala. Vaječnou homogenní suspensi přidáme k základnímu roztoku se škrobem a přidáme k celému obsahu 10 ml 1,5% vodného roztoku malachitové zeleně a dokonale promícháme. Asi po 30 min. stání se mění tmavozelená barva na žlutozelenou a bubliny vzduchu se zachytí v pěně na povrchu půdy. Bozplňujeme po 5 ml do zkumavek, které uzavíráme zátkami z buničité vaty, Srážení se provádí v šikmé poloze proudící parou v Arnoldově přístroji, a to prvých 10 min. při 85°C, dalších 20 min. při 80 —82°C. Po správné koagulaci má ve zkumavkách zůstat trochu kondensační vody. Překročení koagu-lační teploty má za následek denaturaci bílkovin, která podstatně snižuje citlivost půd. Přinedosažení koagulační teploty jsou půdy měkké a nedají se pro očkování použít. Povrch musí být zrcadlově lesklý a barva slabě zelená. Prasklé bubliny na povrchu a bubliny uvnitř půdy jsou známkou převaření. K očkování použijeme půdy do 14 dnů po jejich přípravě, později rychle klesá jejich citlivost. Tekutá půda pro kultivaci L-organismů 111 bujón z hovězích srdcí (pH 7,8)..................... 1000 ml pepton (proteose 3 Difco)........................ lOg NaCl................................. 5 g Od obvyklé přípravy se liSí tím, že jenutno použít redestil. vody ze skla, aby % zachycených kmenů bylo větší. Je-li to možné, má se nechat rozemleté maso ve vodě 1 — 2krát zmrazit, aby macerace byla vydatnější. Před naočkováním se obohatí 5 — 10 % nativního koňského sera, inaktivováného před tím 30 minut při 56 °C nebo 20 — 25 % ascitu. Tuhá půda pro záchyt L-organismů 112 1,5 % sérový nebo ascitový agar z bujónu (viz půda ě. 107). Přidává se 10 % koňských krvinek. Sabouraudova půda (mykologie) 113 glukosa ............................... 30 g pepton................................ 10 g agar................................ • • 30 g deštil, voda.............................. 1000 ml pH 7,0-7,2 Autoklávujeme 60 minut při 0,5 atm. Po rozlití do zkumavek nebo na plotny znovu autoklávujeme 30— 45 minut při 0,5 atm. Vaječná půda Dorset-Sautetova (parasitologie) 114 Slepiěí vajíčko se na povrchu důkladně opere v 80 % alkoholu s několika kapkami jodové tinktury, na obou koncích se udělá otvor do skořápky, obsah se nechá vytéci do sterilní baňky obsahující 25 ml Ringerova roztoku (str. 685) a protřepá se skleněnýmiperličkami. S touto půdou plníme přes sterilní gáz menší zkumavky do výše asi 3 cm. Naplněné a vatou uzavřené zkumavky položíme šikmo do horkovzdušného sterilisátoru a zahříváme je asi 60 minut na 70— 80 °G. Při této teplotě půda koaguluje a zároveň se usmrtí většina bakterií a plísní, které se náhodou dostaly do půdy. Pasteuraei můžeme také ještě jednou nebo dvakrát opakovat. Je dobře dát půdy mezi oběma pasteuracemi na noc do lednice. Vydrží ^ak velmi dlouho. Před upotřebením převrstvíme utuhlou vrstvu asi 2 — 4 ml sterilního Lockeho roztoku, a očkujeme materiál s cizopasnými prvoky. Lockeho roztok: Dextrosa.............................0,2 — 0,5 g natrium bicarbonicum NaHCOa.................... 0,2 g kalium chloratum KC1 ....................... 0,4 g magnesium sulphuricum MgS04.................... 0,1 g natrium chloratum NaCl....................... 6—9,0 g deštil, voda............................. 1000 ml Koagulované sérum podle Dobell-Leidlawa (parasitologie) 115 Menší zkumavky plníme do výšky 2 — 3 cm lidským nebo koňským sterilním sérem (4 díly sera, 1 díl tlumivého roztoku), uzavřeme zátkou a v šikmé poloze dáme koagulovat při 70—80 °C po 60 minut. Pasteuraei příštího dne ještě opakujeme, převrstvujeme ředěným bílkem nebo sérem jako při vaječné půdě. Tlumivý roztok (Bingorův): natrium chloratum NaCl ....................... 6 g ealcium chloratum CaCl2........................ 0,1 g magnesium chloratum MgS04...................... 0,05 g kalium chloratum KC1 ........................ 0,1 g kaliuin phosphor. dibasic. KaHP04................... 3,0 g Po rozpuštění se přidá tolik N/10 NaOH, aby pH bylo 7,2 — 7,4, celkem asi 18 —24 ml. Sorový agar Westphalův (parasitologie) 116 A. Pevná sloíka sestává ze 3 dílů 2% agaru, obsahujícího 0,5 % peptonu a 1 dílu lidského krevního sera. Agar se rozvaří ve vodní lázni a po ochlazení na 50—60 0 se smíchá se sérem a hned plní do sterilních zkumavek do výše 2 — 3 cm. Půdy necháme ztuhnout při pokojové teplotě v šikmé poloze, načož je koagulujeme při 70 — 80 °C, což ještě příštího dne opakujeme. B. Tekutá složka se připraví takto: 25 ml lidského nebo koňského sera ředíme 25 ml tlumivého Ringerova roztoku o pH 7,2 — 7,4 (půda 115) a zahříváme ve vodní lázni po dobu 30 minut. Koagulát roztřepeme ve směsi 75 ml Ringerova roztoku se stejným objemem deštil, vody a znovu zahříváme ve vodní lázni 30 minut. Po vychladnutí filtrujeme vše vatou, rozdělíme do menších baněk a znovu 2kráfc varem sterilisujeme. Před naočkováním navrstvíme na složku A sterilní pipetou 2 —- 4 ml složky B. Půda pro kultivaci trichomonad 117 bujón (pH 6,0)............................. 90 ml čerstvé serum............................. 10 ml penicilin................................ 50 000 j. Korthofova půda (leptospiry) 118 Pepton "Witte............................. 0,8 g natrium chloratum NaCl........................ 1,4 g natrium bicarbonicum NaHC03 ..................... 0,02 g kalium chloratum KG1......................... 0,04 g calcium chloratum CaCl2........................ 0,04 g kalium phosphor, monobas. KH2POa .................. 0,2 g natrium phosphor, dibas. NA2HP04 . 2HaO deštil, voda .'............................ 1000,0 ml Roztok sterilisujeme po 3 dny vždy po 30 minut při 110 °C a po každé po vychladnutí zfiltrujeme filtračním papírem. Pakrozpmíme do zkumavek po 4—5ml, znovu sterilisujeme 3 dny po sobě vždy 60 minut při 100 °C. Nakonec přidáme do každé zkumavky 0,5 ml sterilního králičího sera, které jsme napřed vyzkoušeli, že na něm leptospiry rostou, a hotovou půdu ve zkumavkách pasteurujeme po 3 dny vždy 60 minut při 56 °C. Leptospiry rostou lépe na sem, které nebylo filtrováno bakterijními filtry.