NA STOPĚ PACHATELE Díl čtvrtý: 1) Desinfekce a sterilizace 2) Enterobakterie (a spol.) Mikrobiologický ústav uvádí L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c [USEMAP] Hlavní obsah Dekontaminační metody – včetně bonusů Enterobakterie – hlavní materiál Bonus k enterobakteriím: širokospektré betalaktamázy DEKONTA-MINAČNÍ METODY [USEMAP] Obsah této části prezentace Mikroby a vnější vlivy Dekontaminační metody – přehled Desinfekce Umývání a desinfekce rukou Vyšší stupeň desinfekce Sterilizace Kontrola účinnosti dekontaminace Kontrolní otázky [USEMAP] Pohádka Pohádka •Byl jednou jeden král, a ten měl tři syny. Protože měl na noze škaredý hnisavý vřed a zároveň potřeboval rozhodnout, kdo bude následníkem trůnu, prohlásil, že panovat bude ten princ, který ho toho škaredého vředu definitivně zbaví. Co udělali první dva princové •První dal vysterilizovat skalpel. Sterilizoval dost dlouho, ale příliš nízkou teplotou. Skalpel nebyl dost sterilní, a když princ tatínkovi vřed vyřízl, za několik dní zase zhnisal. •Druhý dal také vysterilizovat skalpel. Sterilizoval dost vysokou teplotou, ale příliš krátkou dobu – a vedlo se mu stejně jako bratrovi. Co udělal třetí princ •Dal skalpel vysterilizovat na teplotu, která byla dost vysoká, po dobu, která byla při dané teplotě vhodně dlouhá. Tak se mu podařilo učinit nástroj skutečně sterilní. Tatínkovi tedy vyřízl vřed, stal se králem, vzal si sexy* princeznu a jestli nezemřel, žije dodnes s tou princeznou ve svém království a má kupu dětí. Zní to blbě, že? Ale takový už je dnešní svět – muži říkají ženám, že jsou sexy, ačkoli ony by raději slyšely, že jsou krásné J Poučení z naší pohádky •Pokud se snažíme zahubit mikroby fyzikálními či chemickými faktory, musíme dodržet jejich parametry. •Tyto parametry jsou přitom vzájemně závislé, tj. hodnota jednoho se mění v.závislosti na druhém parametru. •Čas je v naprosté většině případů jedním z velice významných parametrů. [USEMAP] Mikroby a vnější vlivy Mikroby a vnější vlivy I Osa působícího faktoru U dekontaminačních metod je bezpodmínečně nutné dosáhnout takových hodnost působícího fyzikálního či chemického faktoru, aby došlo k usmrcení mikroba. Zajímá nás tedy primárně mez přežití, (zpravidla horní mez) nikoli mez růstu (ta nás zajímala, když jsme mikroby chtěli kultivovat). Praktické ověření meze přežití a růstu •Pokud chceme ověřit mez přežití bakterií, musíme je po odstranění testovaných extrémních parametrů přemístit do podmínek růstového optima a nechat je tam dostatečně dlouho (pokud byly jen inhibovány, tak se zvetí). •V opačném případě bychom ověřili pouze mez růstu, nikoli mez přežití (nedali bychom jim šanci se zvetit). RustPrez Nad čarou vždy působíme určitou teplotou 24 h Pod čarou jen 4 h, pak mikroby vrátíme do teploty optimální Mikroby a vnější vlivy II Někdy se účinek faktorů kombinuje Faktor, který se kombinuje vždy, je čas Rezistentní, sporulující bakterie 160 °C 170 °C 180 °C 20 min přežívá přežívá hyne 30 min přežívá hyne hyne 60 min hyne hyne hyne [USEMAP] Faktor, který se vždycky kombinuje s ostatními: čas •Všimněte si: čím je teplota nižší, tím musí být delší čas, aby bylo dosaženo kýženého sterilizačního účinku. To je zohledněno i ve vyhlášce při stanovení parametrů pro parní a horkovzdušnou sterilizaci. Dekonta-minační metody – přehled Dekontaminační metody •Jsou to fyzikální a chemické postupy likvidace mikrobů, hmyzu a hlodavců mimo organismus. (Někteří hygienici kladou metody k odstranění hmyzu a hlodavců zvlášť jako tzv. asanační metody) •Mezi dekontaminační metody nepatří likvidace mikrobů v organismu, byť lokální (použití antiseptik). •Antiseptikum je lék. •Desinfekční prostředek není lék. Přehled dekontaminačních metod Sterilizace Zničení všech mikrobů v daném prostředí Vyšší stupeň desinfekce a vícestupňová desinfekce Zničení naprosté většiny mikrobů, některé formy života mohou přežívat (cysty prvoků apod.) Desinfekce Zničení patogenních mikrobů (závisí na okolnostech) Desinsekce Zničení škodlivého hmyzu Deratizace Zničení škodlivých hlodavců [USEMAP] (Vyhláška 306/2012) *Materiály v praktiku stále pracují se starší vyhláškou číslo 195/2005; rozdíly však nejsou příliš výrazné Pojmy asepse a antisepse (nejsou ve vyhlášce, ale jsou též důležité) •Asepse: pasivně brání vniknutí infekce do takového prostřed •Antisepse: postupy, které aktivně zasahují proti infekci •Zásady asepse a antisepse vnesl – –do chirurgie lord Joseph Lister –do porodnictví Ignaz Semmelweis [USEMAP] Zásady správné dekontaminace (bez ohledu na typ metody) •Vybrat vhodnou sterilizační/desinfekční metodu/prostředek. „Vhodný“ znamená: –musí bezpečně ničit (St) všechny organismy, resp. (Df) všechny, které připadají v.daném prostředí v úvahu –nesmí ničit desinfikovaný či sterilizovaný materiál –musí být prakticky použitelný •Použít dostatečnou intenzitu faktoru (teplotu, intenzitu, koncentraci) •Příslušný faktor musí působit dostatečně dlouho Před a po dekontaminaci •Před dekontaminací je často nutná příprava – mechanické očištění, zajištění, aby dekontaminace správně proběhla. Tyto postupy opět přesně upravuje vyhláška •Po dekontaminaci je v některých případech nutno učinit určité kroky (např. odvětrat zbytek působící chemikálie). Je nutno dbát na pravidla uchovávání dekontaminovaných předmětů. •Uchovávání dekontaminovaných předmětů (jak dlouho vydrží sterilní) rovněž upravuje vyhláška Dekontaminace a čištění •Mechanicky špinavé nástroje je třeba před dekontaminací mechanicky omýt, jinak není dostatečně účinná Mytí a desinfekce [USEMAP] Desinfekce Desinfekce – příklady 1 •A. FYZIKÁLNÍ METODY •1. Var: •a) za normálního tlaku – ve zdravotnictví alespoň 30 minut. (Pro kuchyni stačí i méně, ale jídlo se musí provařit – i uvnitř!) •b) v tlakových hrncích – zkrácení času – ani v tom případě však nejde o sterilizaci!!! •2. Jiné fyzikální metody – filtrace, žíhání, slunění, UV záření apod. Desinfekce – příklady 2 •B. DESINFEKČNÍ PROSTŘEDKY •Oxidační činidla •3. Peroxidy: kyselina peroctová (CH3COOOH, u nás Persteril). Na spory, houby a tuberkulózu; 0,5% roztok = vyšší stupeň desinfekce. Nevýhodou je agresivita, odbarvování textilií a nestabilita roztoků. •4. Peroxid vodíku (H2O2) – podobný, méně agresivní, také ale méně účinný. Desinfekce – příklady 3 •5. Halogenové preparáty – chlornany: –chlornan sodný (NaOCl), u nás Savo –chlornan vápenatý (Ca(OCl)2; chlorové vápno) •6. Chloramin (Chloramin B; Chloraminy BM a BS jsou s přísadami). •7. Jodová tinktura + novější Jodonal B, Jodisol a Betadine, kde je jód vázán v.komplexu. U nealergických pacientů by měl mít Jodonal B přednost před Ajatinem Desinfekce – příklady 4 •8. Manganistan draselný se již neužívá. •9. Formaldehyd – ve směsích •10. Kresol (lysol) je účinný, pro zápach a agresivitu se již téměř neužívá. •11. Ethylalkohol – ve směsi, sám není příliš účinný; Relativně nejúčinnější je asi 70 % roztok. •12. Tenzidy: Orthosan BF 12 •13. Ajatin – běžný pro desinfekci pokožky. •14. Septonex – spíše antiseptikum. •15. Anorganické kyseliny a louhy, těžké kovy aj. •16. Kombinované přípravky, např. Incidur Účinnost desinfekce na různé mikroorganismy •V příručkách a jiných materiálech se zpravidla používá abecední systém: •A = účinné na (vegetativní) bakterie a kvasinky •B = účinné na viry •C = účinné na bakteriální endospory •T = účinné na tuberkulózní mykobakteria •M = účinné na atypická mykobakteria •V = účinné na vláknité houby [USEMAP] Vhodnost k různým účelům •Některé prostředky se hodí jen k něčemu: jsou třeba jen na povrchy, nebo jen na kůži. Zpravidla desinfekční prostředky dělíme na •prostředky na nástroje •prostředky na povrchy •prostředky na ruce (+ desinfekční mýdla) •desinfekce potrubí v potravinářství •desinfekce vhodná pro kuchyně Umývání a desinfekce rukou Umývání a desinfekce rukou •Pro ruce platí jiná pravidla než pro povrchy. Zpravidla na rukou nemáte tlustou vrstvu špíny J • Současná legislativa používá následující pojmy: •Mechanické mytí rukou (MMR) je běžné mytí mýdlem jako součást osobní hygieny nebo jako krok předcházející CHDR •Hygienické mytí rukou (HMR) používá desinfekční mýdla; je účinnější než MMR, ale méně účinné než HDR •Hygienická desinfekce rukou (HDR) např. alkoholovými prostředky, doporučená ve zdravotnictví •Chirurgická desinfekce rukou (CHDR) [USEMAP] Současná legislativa Vizte též [USEMAP] tento odkaz Jak by měl vypadat zdravotníkův den z hlediska mytí a desinfekce? •Při příchodu do práce by si měl umýt ruce mýdlem a otřít ručníkem. Poté na suché ruce aplikovat alkoholovou desinfekci •Během pracovního dne používat např. mezi pacienty pouze alkoholovou desinfekci, mytí zařadit jen při pocitu „lepivých rukou“ •Před cestou domů ruce zase umýt •Během pracovního dne je tedy doporučeno spíše jen desinfikovat, nikoli umývat ruce, jinak si ruce zničíte, ale mikroby nezničíte Správný postup při mytí či desinfekci •1. krok: Dlaň proti dlani. •2. krok: Dlaň pravé ruky přes hřbet levé a naopak. •3. krok: Dlaň proti dlani s propletenými prsty. •4. krok: Vnější část prstů proti dlani s „uzamčenými“ prsty. •5. krok: Sevřít pravý palec v levé dlani a vtírat krouživým pohybem a naopak. •6. krok: Krouživé pohyby sevřených konečků prstů pravé ruky v levé dlani a naopak. •(7. krok: Zápěstí levé ruky prsty pravé a naopak.) 25 hygienická desinfekce http://www.labor28.de/igel/mrsa.html Jak si mýt a desinfikovat ruce 25 hygienická desinfekce 1. Dlaň proti dlani http://www.labor28.de/igel/mrsa.html 25 hygienická desinfekce 2. Hřbet dlaní druhé ruky http://www.labor28.de/igel/mrsa.html 25 hygienická desinfekce http://www.labor28.de/igel/mrsa.html 3. Mezi prsty 25 hygienická desinfekce 4. Klouby prstů proti dlani http://www.labor28.de/igel/mrsa.html 25 hygienická desinfekce http://www.labor28.de/igel/mrsa.html 5. Velmi důležitý palec (krouživým pohybem) 25 hygienická desinfekce 6. Špetka na rýhy v dlani http://www.labor28.de/igel/mrsa.html (7. Zápěstí) 17 Handwash%20poster http://www.chilledfood.org/_gallery/Handwash%20poster.gif Na která místa se nejčastěji zapomene Nejčastěji opomíjená místa jsou znázorněna bleděmodře, tmavomodře tak místa rovněž poměrně často opomíjená. Oblíbená pověra •„Když používám rukavice, nemusím si mýt a desinfikovat ruce“ velmi nebezpečný nesmysl! Existují systémy, umožňující pod UV zářením zkontrolovat stav desinfekce rukou 20 UV kontrola mytí rukou http://www.newhamuniversityhospital.nhs.uk/press.php?15a2e6d35a31864e72c9a857450ee983 Návyky personálu obecně •Důležité od sanitářů až po primáře. •Není vůbec samozřejmostí správná technika mytí rukou – pro nácvik je nejlepší praktické otestování •Používání rukavic, popř. ústenek aj. •Správná manipulace s jehlami po použití •Organizace práce (oddělení „čisté“ a „špinavé“ manipulace místem a/nebo časem na všech úrovních: špinavé a čisté vozíky, vyčlenění místa pro přípravu infuzí a jiného pro manipulaci s.biologickým materiálem apod.) [USEMAP] Vyšší stupeň desinfekce [USEMAP] Vyšší stupeň desinfekce a vícestupňová desinfekce •„něco mezi sterilizací a desinfekcí“ •na rozdíl od sterilizace nemusí zničit například cysty prvoků nebo vajíčka červů. •glutaraldehyd, Sekusept nebo Persteril •koncentrace vždy jsou vyšší než pro běžnou desinfekci •k ošetřování flexibilních endoskopů, kde nelze použít žádné metody sterilizace. •„vyšší stupeň“ je o něco účinnější, používá se pro endoskopy umisťované do míst normálně sterilních, „vícestupňová“ slouží hlavně pro trávicí trakt Sterilizace Sterilizace – příklady I •1. Sterilizace horkou parou pod tlakem (autoklávování). Pára musí být právě nasycená. Hodí se na předměty ze skla, kovu, keramiky, kameniny, porcelánu, textilu, gumy a některých plastů. Teploty 121–134 °C. (už se nepoužívá dříve povolených 115 °C!) •2. Sterilizace horkým vzduchem (u přístrojů s nucenou cirkulací vzduchu 180 °C 20 minut nebo 170 °C 30 minut nebo 160 °C hodinu). Hodí se na kovy, sklo, porcelán a kameninu. •3. Sterilizace horkou vodou pod tlakem – již se v praxi nepoužívá Sterilizace – příklady II •4. Sterilizace gama zářením: používá se většinou při průmyslové výrobě, např. rukavic na jedno použití. •5. Plasmová sterilizace ve vysokofrekvenčním elektromagnetickém poli (moderní metoda) •6. Chemická sterilizace parami formaldehydu nebo ethylenoxidem (musí být přesně dodržen postup). Používá se tam, kde nelze použít fyzikální metody. Sterilizace – příklady III (co není ve vyhlášce) •7. Sterilizace ohněm se používá prakticky jen u mikrobiologických kliček, protože většinu materiálů silně poškozuje. Spalování se hodí u odpadů. •8. Paskalizace je sterilizace tlakem, používaná v potravinářství •9. Ostatní metody: frakcionovaná sterilizace, filtrace roztoků aj. jsou speciální, používají se ve výzkumu, ne v medicíně [USEMAP] Která metoda má být použita •Vhodnost metody je dána odolností příslušného materiálu vůči různé teplotě, vlhkosti, chemikáliím a dalším faktorům •V každém případě je nutno dodržet parametry (teplotu v °C, tlak v kPa, dávku záření v Gy) a vždy samozřejmě také čas! Kontrola účinnosti dekonta-minace Kontrola, zda byla dekontaminace provedena, a kontrola její účinnosti •Orientačně – smyslově – např. pomocí charakteristického zápachu •Stanovení skutečné koncentrace desinfekčních prostředků (chemicky) •Chemická kontrola sterilizace využívá indikátorů, které při určité teplotě mění vlastnosti (např. zbarvení) •Způsob biologický užívá odolné kmeny rodu Bacillus. Ty absolvují celý cyklus a pak se zjišťuje, zda přežily. Desf2 Desf3 Konec Foto O. Z. [USEMAP] [USEMAP] Lord Joseph Lister •(* 5. dubna 1827 - † 10. února 1912) •anglický lékař • •Lister byl ovlivněn Pasteurovými a Kochovými pracemi o bakteriích. A tak se rozhodl, že se nákaze při operaci musí předejít. Udává se, že první operaci pod antisepsí provedl Lister v roce 1865. Antisepse docílil obvazem nasáklým karbolovou kyselinou. Nedlouho po tom, v roce 1867 na sjezdu anglických lékařů v Dublinu, přednesl Lister sdělení o antisepsi. Zde měl naprostý neúspěch. Lister se však nedal odradit. V témže roce publikoval své názory na zavádění antisepse v anglické lékařském časopise Lancet. •V sedmdesátých letech 19. století už se našli chirurgové, kteří s ním souhlasili a přidávali se k němu. A tak byl v roce 1891 otevřen v Londýně Listerův ústav preventivního lékařství. •Podle Listera se jmenuje bakterie Listeria (viz P03) • •http://cs.wikipedia.org/wiki/Joseph_Lister Joseph_Lister http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Joseph_Lister.jpg Ignaz Fülöp Semmelweis •(1. července 1818 Budín, dnes Budapešť • – 13. srpna 1865 Döbling, dnes Vídeň) •maďarský lékař pracující v porodnictví • •Vyslovil teorii, že tzv. horečku omladnic přenáší sami lékaři při vyšetření a rození, a ustanovil hygienické zásady, jak epidemii potlačit. I přes evidentní úspěchy při aplikaci se jeho teorie setkala s prudkým odporem zejména starších kolegů, kteří odmítali připustit, že by za smrtí pacientek mohli stát oni sami. Někteří další jeho kolegové tuto pravdu neunesli – např. profesor Gustaf Michaelis, který jeho postupům uvěřil a úspěšně je zavedl na svém pracovišti, spáchal sebevraždu (mezi ženami, které dříve po porodu u něj zemřely na horečku omladnic, byla i jeho milovaná neteř). K neúspěchům doktora Semmelweise ovšem přispěla i jeho popudlivost a neschopnost a neochota zpracovat svá bezesporu přesná pozorování a experimenty do vědecky přijatelné a publikovatelné podoby. I tak se řadí mezi nejvýznamnější lékaře 19. století a býval nazýván Zachránce matek. 49 Semmelweis_stamp_Austria_1965 50 Wiener_AKH_zur_Zeit_der_Eroffnung_im_Jahre_1784 [USEMAP] www.answers.com/topic/ignaz-semmelweis http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/a/ac/Wiener_AKH_zur_Zeit_der_Eroffnung_im_Jahre_1784.jpg http://cs.wikipedia.org/wiki/Ign%C3%A1c_F%C3%BCl%C3%B6p_Semmelweis [USEMAP] Kontrolní otázky •1. Jaké časy a teploty jsou předepsány pro horkovzdušnou sterilizaci? •2. Existuje desinfekční postup doporučený pro použití na chirurgickém oddělení. Lze tento postup vzít a bez dalšího prověřování použít v tuberkulózní léčebně? •3. Proč se dnes postupům např. pro dekontaminaci flexibilních endoskopů říká „vyšší stupeň desinfekce“ a nikoli „chemická sterilizace“ jako dříve? •4. Právě proběhl sterilizační cyklus s bioindikátorem. Jaký bude následovat krok, chceme-li ověřit funkci sterilizátoru? •5. Jaké jsou předepsané teploty a časy pro autoklávování? •6. Jaký je chemický základ účinnosti Betadiny? •7. Jaký je vztah mezi desinfekcí a mechanickým čištěním? •8. Jak lze uspořádat testování účinnosti desinfekční látky? •9. Jak lze provést testování účinnosti sterilizátorů pomocí bioindikátoru? [USEMAP] ZPĚT NA HLAVNÍ OBSAH PREZENTACE ENTERO-BAKTERIE Na začátek báseň… •Nemůžem vždy slepici •kontrolovat stolici. •Jednou projdem drůbežárnou •a stolici najdem zdárnou. •Přiletí však holub bělý •zanese tam salmonely. •Odnesou pak vejce •pro cukráře – strejce •Cukrář – strýček nevinný •nadělá z ní zmrzliny •Mládež sní ji s důvěrou •a všichni se… Saen MAL Salmonella na MAL agaru 32 eggs-and-salmonella http://www.uwec.edu Foto: Mikrobiologický ústav, autor fotografie: prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc. [USEMAP] Přehled témat Klinický popis: Enterobacterales Campylobacter, Helicobacter, Vibrio, Aeromonas Obrázky bakterií Diagnostika enterobakterií Dg. Campylobacter, Helicobacter, Vibrio, Aeromonas Klinický popis: Enterobacterales Příběh první •Slečna Tereza je mlsná. Dnes si po obědě dala krémový zákusek. Odpoledne ji začala zvracet a měla průjem. Navštívila lékaře, ten jí odebral výtěr z řitního kanálu. Za několik dní volali Tereze z územního pracoviště krajské hygienické stanice. Tereza si byla jistá, že za všechno může krémový zákusek. Ukázalo se však, že její podezření bylo falešné… Kdo je tedy skutečný viník? •Bakteriálním viníkem je Salmonella enterica serovar Enteritidis, zkráceně Salmonella Enteritidis •Viník – jídlo nemůže být krémový zákusek! Neodpovídá totiž inkubační doba, které je u salmonelóz zpravidla dva dny, někdy ale i týden •Viníkem – jídlem se nakonec ukázal být žloutkový věneček, který Tereza zbaštila o dva dny dřív •Lidským viníkem bude pravděpodobně někdo v cukrárně „U hysterické cukrářky“, kde někdo něco nejspíš zanedbal. Právě teď po tom pátrá oddělení hygieny výživy KHS. Může jít o primární či sekundární kontaminaci jídla. Primární patogeny z řad enterobakterií •Enterobacterales je klinicky nejdůležitější řád gramnegativních tyčinek (ale důležitý je i pro ne-klinická odvětí mikrobiologie) •Řád zahrnuje především čeleď Enterobacteriaceae, některé enterobakterie ale budou pravděpodobně přeřezeny do nových čeledí. Pojem „enterobakterie“ se tedy týká řádu Enterobacterales •Nejhorší patogeny způsobují celkové infekce: je to Yersinia pestis (způsobuje mor) a tzv. antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C – způsobují břišní tyfus – onemocnění s vysokými horečkami a bolestí hlavy) •Závažné jsou ale i obligátní patogeny působící zpravidla „jen“ střevní infekce. I u nich je však riziko sepse, hlavně u oslabených osob •Týká se to rodů Salmonella, Shigella a Yersinia Bacilární úplavice (shigelóza) z hlášení KHS JMK za květen 2008 •Shigelóza (A03) •Rodinný výskyt – dítě nar. 2005 z Brna, rómské národnosti. První příznaky 10. 5. Teplota 38 °C, průjem, zvracení. Hospitalizace na KDIN FN Brno od 12. 5., kultivačně Shigella sonnei. V epidemické souvislosti hospitalizovány 17.5. a 22. 5. další 3 děti nar. 2003, 2002, 1994. Ve všech případech potvrzena Shigella sonnei. Poznámka k salmonelám a shigelám* •To, že mezi střevními patogeny jsou rozdíly, ukazuje příklad salmonel a shigel. •Salmonely potřebují vysokou infekční dávku. Musí se tedy pomnožit v nějaké potravině. Infekce jsou téměř výhradně z potravin. •Shigelám naproti tomu stačí malá infekční dávka, takže se snadno přenesou špinavýma rukama, klikou od záchodu nebo kontaminovanou vodou. •Existují také klinické rozdíly (rozdílný charakter průjmu apod.). Například shigelóza má svůj specifický název – bacilární úplavice/dysenterie (neplést s amébovou úplavicí) *Aby to bylo s taxonomií enterobakterií ještě složitější, mnoho současných taxonomů tvrdí, že rod Shigella ve skutečnosti neexistuje; shigely nejsou nic jiného, než zvláštní kmeny Escherichia coli. Nicméně se z mnoha praktických důvodů stále v praxi chováme tak, jako kdyby shigely existovaly. Příběh druhý •Paní Mokrá je v péči urologické kliniky pro přetrvávající potíže při močení •Paní Mokrá má podobné potíže opakovaně. Po třech porodech má narušenou svalovinu pánevního dna, léčila se i pro inkontinenci moče. Lékaři ji upozornili, že riziko močové infekce je u ní zvýšené, protože má narušené mechanismy normální obrany proti infekci. Je to trochu bludný kruh, protože opakované infekce stav sliznic dále zhoršují Kdo za to tentokrát může? •Viníkem je Escherichia coli, respektive její uropatogenní kmen (uropatogenní E. coli – UPEC) •Viníkem by mohla být i kterákoli jiná z podmíněně patogenních enterobakterií (ale i obligátně patogenní kmeny, např. salmonely, se uplatňují) •Escherichia coli je jednou z nejdůležitějších součástí střevní mikroflóry, kde je zdraví prospěšná: produkuje bakteriociny, které nedovolí jiným bakteriím kolonizovat sliznici. Escherichia coli dokonce zásobuje tělo vitamíny (zejména E a K). •Escherichia coli byla objevena německo-rakouským profesorem Theodorem Escherichem (zemřel 1911) Patogenita Escherichia coli •Uvnitř střeva §EPEC (enteropatogenní EC) §ETEC (enterotoxické EC) §EIEC (enteroinvazivní EC §STEC (shiga-toxigenní EC), tato skupina také zahrnuje EHEC – enterohemorhagické E. coli) §EAggEC (enteroaggregativní E. coli) –Kombinace (STEC + EAggEC = kmen O:104H:4, který způsobil těžkou epidemii v Německu 2011) •Mimo střevo –UPEC (uropathogenní E. coli) –Kmeny způsobující respirační infekce –Kmeny způsobující sepse, infekce ran atd. • Multirezistentní enterobakterie •Problémem moderní doby je přítomnost kmenů enterobakterií, které jsou rezistentní na mnoho antibiotik. Mohou to být kmeny různých druhů. Jde zejména o produkci širokospektrých betalaktamáz typu ESBL, případně ampC. [USEMAP] Některé další oportunně patogenní enterobakterie •Enterobacter, Klebsiella, Pantoea – často opouzdřené, mukózní kolonie. Zejména klebsiela je častým původcem nemocničních infekcí (dýchací cesty, cystitidy) •Proteus, Providencia, Morganella – proteolytické kolonie (v diagnostice typický zápach jejich kolonií). Občasní původci infekcí močových cest a dalších infekcí •Citrobacter – biochemicky podobný salmonele, ale má pozitivní ONPG test •Hafnia – primární patogen včel Přehled enterobaktérií Příběh Patogenita Příklady – Systémová Y. pestis, AP** salmonely 1. Střevní ZP* salmonely, shigely, yersinie 2. Potenciální E. coli, klebsiely, enterobaktery, protey, providencie, morganely, citrobaktery, serracie a jiné – Téměř nulová Mnoho druhů, například Pragia fontium a Budvicia aquatica *zoopatogenení **antropopatogenní [USEMAP] Klinický popis: Campylobacter, Helicobacter, Vibrio a Aeromonas Příběh třetí •Student František je častým návštěvníkem fast-foodů. Hlavně si rád a často pochutnává na jídlech z kuřecího masa. •Proto ani hygienici nepřišli na to, které konkrétní jídlo mohlo za jeho průjmové potíže. František si myslel, že má nejspíš salmonelózu. Hygienici mu však vysvětlili, že salmonelóza se přenáší hlavně z.vajíček, kdežto náš viník spíše z kuřecího masa. Viníkem je totiž •Campylobacter jejuni, gramnegativní zahnutá tyčinka. Není nijak blízce příbuzná enterobakteriím, dokonce patří do jiné třídy – epsilonproteobakterie (zatímco enterobakterie jsou gamaproteobakterie). Nicméně je kampylobakterióza svým průběhem a závažností srovnatelná se salmonelózou •Počet případů u nás je v posledních letech výrazně vyšší než počet případů salmonelózy. Je to dáno lepší diagnostikou, ale také úbytkem salmonelózy v důsledku očkování kuřat proti nejběžnějšímu serotypu salmonely (Salmonella Enteritidis) Odbočka, ale pro praxi důležitá: Něco málo o odběru stolice •Zatímco na parazitologii a virologii je nezbytná kusová stolice, na bakteriologii sice není chybou ji poslat, ale není nutná •Dříve se posílaly výtěry z řitního kanálu na suchém tampónu, nebo se používaly takzvané rektální rourky (natíraly se glycerinem, aby odběr nebolel – as. Zahradníček to při svých začátcích ještě zažil, děti ve školce to stejně snášely dost špatně) •Dnes je metodou volby tampon zanořený do transportního média (nejlépe Amiesova). Je to právě především kvůli kampylobakterům Příběh čtvrtý •Pan Žáha má problém: pálí ho žáha. Problémů má více, už také zvracel krev a je pravděpodobné, že má peptický vřed. •Pomalu už neví, jestli je víc doma doma, nebo na gastroenterologii, a fibroskopy polyká častěji než své dříve oblíbené utopence. •Při poslední gastrofibroskopii mu endoskopicky odebrali dva vzorky – jeden poslali na histologické, druhý na mikrobiologické vyšetření •Obě vyšetření potvrdila totéž: zločinec je tam. Tentokrát jen spolupachatel… •Peptické (tedy gastrické či duodenální) vředy jsou onemocněním, které vzniká souhrou více příčin. Takovým onemocněním říkáme obvykle multifaktoriální. •Dodnes se nejen mezi praktickými lékaři, ale i mezi specialisty liší názory na podíl bakterie Helicobacter pylori na vředové onemocnění. Jisto je, že jsou i zdraví lidé s helikobakterem, stejně tak je ale jisto, že helikobakter svůj, nikoli nevýznamný, podíl na onemocnění má. •Helicobacter patří do třídy Epsilonproteobacteria, řád Campylobacterales, čeleď Helicobacteraceae • Jak zločinec přežívá v extrémně nepříznivém prostředí žaludku? •Upravuje si své mikroprostředí – alkalizuje si ho, štěpě močovinu •Močovina se rozštěpí na kyselý oxid uhličitý, který vyprchá, a zásaditý čpavek, který zůstane a alkalizuje prostředí •Štěpení močoviny probíhá podle reakce: • •NH2-CO-NH2 + 3 H2O à CO2 + 2 NH4OH Příběh pátý •Pan Exot miloval exotickou dovolenou. Byl zvyklý pít vodu z místních zdrojů. •A tak se ani nedivil, že dostal průjem. •Tentokrát to ale bylo horší než obvykle. Průjem byl silný a vodnatý. •Příjem vody ústy nestačil. Až infusní doplnění chybějících tekutin mu pomohlo. [USEMAP] Vibria a aeromonády •Společně s enterobakteriemi patří mezi gamaproteobakterie, náleží ale do samostatných řádů Vibrionales a Aeromonadales. •Vibrio cholerae způsobuje choleru, těžké průjmové onemocnění v tropech a subtropech •Jiní členové rodu Vibrio mohou způsobovat také průjmy, ale i infekce ran. Tato tzv. „halofilní vibria“, preferují zvýšené koncentrace NaCl •Aeromonas také způsobuje ranné infekce, například při přípravě jídel z ryb a plodů moře. Obrázky bakterií saenmal3 Fotografie z databáze zločinců: Salmonela Saen Endo Endo Saen MAL MAL saenxld XLD Foto: Mikrobiologický ústav PRVUka Proteus mirabilis, P. vulgaris (dole) prmiKA2 PrmiKA Pro protey je typické, že nerostou jen v místě inokulace, ale šíří se po povrchu agaru do stran (plazivý růst, Raussův fenomén, také fenomén příbojové vlny Foto: Mikrobiologický ústav Proteus dle as. Petra Ondrovčíka peproteus2 „Je sice pěkné, kolego, že dovedete dekarboxylovat ornitin; mnohem smutnější ovšem je, že se ve většině případů neumíte pořádně plazit!“ Klebsiely a escherichie Kolonie klebsiel na KA jsou hlenovitější a bělejší než kolonie E. coli… klpn35 esco KA … i když zrovna tohle E. coli je taky poměrně bílé a hlenovité J Foto: Mikrobiologický ústav Escherichie Pokud escherichie na KA hemolyzují (a to je dost často), uvede se to případně do výsledku, ale nehodnotí se to jako zvláštní diagnostický znak esly KA Foto: Mikrobiologický ústav Heli cinaedi Helicobacter cinaedi Jeden méně známý helikobakter Foto: MiÚ Věnovala dr. Rita Gander [USEMAP] Diagnostika enterobakterií Enterobakterie – metody •Přímé metody –Mikroskopie – v praxi má malý význam, protože je jich mnoho a v mikroskopu jsou všechny stejné. Nicméně v praktiku ji použijeme –Kultivace – používá se mnoho různých půd –Biochemická identifikace – velmi důležitá –Antigenní analýza – salmonely, shigely, EPEC •Nepřímé metody (protilátky) –Widalova reakce u tyfu, protilátky proti yersiniím Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika) •Gramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií •Endova půda poprvé: rostou na ní z klinicky významných jen enterobaktérie, vibria s aeromonádami a gramnegativní nefermentující tyčinky •Nefermentující odliší to, že nefermentují glukózu (např. Hajnova půda zůstává po kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu) vibria a aeromonády odliší pozitivní oxidáza Gramnegativní tyčinky – vzájemné rozlišení skupin rostoucích na Endově agaru •Enterobakterie jsou oxidáza negativní (s výjimkou rodu Plesiomonas, který k nim byl nedávno přiřazen) a vždy štěpí glukózu •Vibria a aeromonády také štěpí glukózu, ale jsou vždy oxidáza pozitivní •Gramnegativní nefermentující baktérie (mohou to být tyčinky, ale i kokotyčinky či koky) nikdy neštěpí glukózu. Oxidázu mohou mít pozitivní i negativní Diagnostický algoritmus Neznámý kmen Roste na Endu Oxidáza „–“: jsou to enterobakterie, pátráme dál Neroste na Endu jiná morfologie G- tyčinka HAJNA červená: nefermentující b. HAJNA jiná než červená Oxidáza „+“: Vibrio/Aeromonas Rozlišení enterobakterií navzájem •Endova půda podruhé: orientační rozlišení obligátních patogenů (většinou L-) a potenciálních patogenů (zpravidla L+) •Spousta dalších půd: XLD, MAL, DC, WB a další na salmonely, CIN na yersinie aj. •Biochemické testy: Hajnova půda, test MIU, Švejcarova plotna, ENTEROtesty aj. •Antigenní analýza zpravidla sklíčkovou aglutinací •Diagnostika kampylobakterů, helikobakterů a vibrií bude probrána zvlášť. Kult9 Štěpení laktózy •Laktóza pozitivní bakterie mají na Endově půdě tmavočervené okolí. Laktóza negativní mají okolí bledé. Foto O. Z. Kultivační charakteristika některých enterobakterií •Na půdě XLD –salmonely mají bledé kolonie s černým středem (trochu jako malininkaté volské oko s černým žloutkem) –jiné bakterie buď nerostou vůbec, nebo rostou málo a v koloniích jiné morfologie •Na půdě MAL to vypadá podobně, ale některé barvy či velikosti kolonií se mohou lišit od výsledku na XLD •Na půdě CIN rostou yersinie v drobných, tmavě růžových koloniích. saenmal2 Salmonela na MAL agaru Foto: Mikrobiologický ústav Biochemické testování enterobakterií •Pro biochemické testování enterobakterií používáme různé testy. V Česku* používáme nejčastěji ENTEROtest 16 a ENTEROtest 24. My dnes použijeme první z nich •První reakce je ONPG test (zkumavka s činidlem na stripu, jako VPT ve STAPHYtestu a STREPTOtestu). První řada panelu odpovídá 2. až 9. reakci, druhá řada je 10. až 17. reakce. *tvar doporučený Ústavem pro jazyk český Antigenní analýza •Antigenní analýza se v diagnostice nepoužívá zdaleka vždycky •Použití je v zásadě dvojí: –U obligátních patogenů (salmonely, shigely, yersinie) pro potvrzení diagnózy a pro epidemiologické účely –U střevních izolátů E. coli v případě, že je podezření na EPEC* nebo STEC (ostatní skupiny se zpravidla takto neurčují) –*zpravidla je to u dětí do dvou let •Oba případy jsou demonstrovány příklady Aglutinace E. coli na průkaz EPEC •V současnosti detekujeme 12 serovarů EPEC •Je-li pozitivní nonavalentní sérum (I, II, III) –pokračujeme trivalentními séry (I, II a III) –je-li jedno z nich pozitivní, pokračujeme příslušnými monovalentními séry •Je-li pozitivní trivalentní sérum IV, pokračujeme s monovalentními séry patřícími do skupiny IV. •Chápejte: existují stovky serovarů E. coli. Zkrátka, výsledek „E. coli, EPEC vyloučena“ znamená „je to jeden z těch zbylých asi 200“ Aglutinace salmonel •Při aglutinaci kterékoli pohyblivé enterobakterie hodnotíme dva typy antigenů: tělové, tzv. O antigeny, a bičíkové, tzv. H antigeny (výjimečně i kapsulární K antigeny). •Tak i každá salmonela má svou specifickou antigenní strukturu. Například salmonela serovaru Enteritidis disponuje tělovými antigeny 9, 12 a bičíkovým H m. •Je-li tedy naše salmonela Salmonella Enteritidis, musí být pozitivní (aglutinace přítomna) jak při aglutinaci tělových, tak i bičíkových antienů. Testy antibiotické citlivosti •Antibiotická citlivost se zásadně neurčuje u kmenů ze stolice. (U bakteriálních průjmů většinou podání antibiotik paradoxně prodlužuje dobu vylučování patogena ze střeva; spíše než antibiotika se tedy užívá dieta a v rekonvalescenci probiotika.) •Určuje se tedy zpravidla u kmenů z moče, proto i antibiotika zahrnují léky používané k léčbě močových infekcí (např. furantoin) Ještě k citlivosti na antibiotika •Sestava užívaná v tomto úkolu je takzvaná „GNTM“ sestava, jedna z těch, které se u nás užívají: –Pro jiné než močové infekce máme G1 (základní sestava s převahou perorálních látek),G2 a G3 (spíše parenterální a širokospektrá antibiotika). –Pro močové infekce je test upraven: GNTM (základní) a G2M; G3 je stejný jako u jiných než močových infekcí –Ačkoli obě varianty obsahují při kombinaci všech tří sestav 21 antibiotik, existují producenti betalaktamáz, které jsou citlivé jen na 4–6 z nich. U producentů karbapenemáz je situace ještě horší. [USEMAP] Tabulka zón citlivosti – příklad *platí také pro doxycyklin Antibiotikum Zkratka „C“ je (mm) „R“ je (mm) Ampicilin (aminopenicilin) AMP ≥ 14 < 14 Cefazolin (CS 1 gener.) KF ≥ 15 < 14 Ko-trimoxazol (směs) SXT ≥ 16 < 13 Nitrofurantoin (nitrofuran) F ≥ 11 < 11 Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 15 < 12 Cefuroxim (CS 2 gener.) CXM ≥ 18 < 18 Norfloxacin (chinolon) NOR ≥ 22 < 19 Ani S, ani R à intermediární („I“) Diagnostika rodů Campylobacter, a Helicobacter, Vibrio a Aeromonas Diagnostika kampylobaktera •Kampylobaktera si s předchozími bakteriemi nespletete. Neroste na běžných půdách, navíc jde o zahnutou tyčinku •Jde o stříbřité kolonie s náznakem plazení jako u protea •Má pozitivní oxidázový test Několik poznámek k diagnostice kampylobakterů •Kampylobaktery vyžadují v zásadě čtyři věci: –Svoji černou půdu – říkáme jí běžně „půda pro kampylobaktery“, název CCDA se příliš nevžil –Zvýšenou teplotu na cca 42 °C. Jsou to totiž primárně ptačí patogeny a ptáci mají vyšší tělesnou teplotu –Zvýšenou tenzi CO2 –Prodlouženou dobu kultivace – nikoli 24, ale 48 hodin Ureázový test v diagnostice helikobaktera •Helicobacter také neroste na běžných půdách. Potřebuje asi pět dní na své speciální půdě, než je viditelný růst. •Velice typické je štěpení močoviny. Na rozdíl od jiných biochemických testů v mikrobiologii zde můžeme pracovat přímo se vzorkem (žaludeční tkání) a nikoli s kmenem. V úkolu 8 uvidíte rozdíl mezi pozitivním a negativním výsledkem. Ureázový dechový test (anglicky urea breath test) •Pacientovi se podá těžkým izotopem uhlíku (13C) nebo radioaktivním izotopem (14C) značená močovina •U zdravého močovina projde do dolní části trávicího traktu a vyloučí se stolicí •Je-li přítomen helikobakter, rozštěpí se už v žaludku a značený CO2 se objeví ve vydechovaném vzduchu. Čím více značeného CO2, tím více helikobaktera Diagnostika vibrií a aeromonád •Provádí se podobně jako u enterobakterií, ale jsou oxidáza pozitivní. •Mikroskopicky jsou vibria pohyblivé, zahnuté tyčinky •Používá se také speciálních půd, například alkalická peptonová voda a TCŽS (Thioglykolát, cystein, žlučové soli) •Používá se MALDI-TOF, popřípadě obdobných biochemických testů, jako u enterobaktérií •Musí se ovšem vybrat správná matice Diferenciální dg. vibrií a aeromonád •V mikroskopii, Vibrio je zahnutá tyčinka (podívejte se na obrázek na další obrazovce a zakreslete) •Pro kultivaci používáme půdu TCŽS (pevnou půdu) a alkalickou peptonovou vodu (tekutá půda) •Pro biochemickou identifikaci používáme týž Enterotest 16 jako pro enterobakterie,ale musíme použít jinou matici (v kódové knize či v počítači) •Antigenní analýzou odhalíme dva hlavní serovary Vibrio cholerae: O1 a O139. •Detailnější diagnostika uvnitř serovaru O1 (na biotypy Classic a El Tor) vyžaduje další biochemické testování [USEMAP] Konec [USEMAP] ZPĚT NA HLAVNÍ OBSAH PREZENTACE Foto: Mikrobiologický ústav P1010001.JPG [USEMAP] Bonus: Širokospektré betalaktamázy (ESBL) P1020707.JPG Foto: Mikrobiologický ústav Betalaktamázy TEM, SHV, CTX apod. •Vyskytují se především u enterobakterií: Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, ale mohou být i u nefermentujících tyčinek •Existuje jich mnoho typů •Geny pro ně jsou uloženy v plasmidech, mutace jsou časté, vznikají stále nové varianty •Z betalaktamů zůstávají citlivé karbapenemy [USEMAP] [USEMAP] Metalobetalaktamázy •Vyskytují se u G- nefermentujících bakterií, zejména pseudomonád •Štěpí i karbapenemy •Zbývají citlivé monobaktamy (aztreonam) •U enterobakterií se v poslední době vyskytují podobné karbapenemázy. V Brně se aktuálně objevily první takové kmeny – jde o kmeny citlivé většinou pouze na kolistin, případně ani na ten (jde-li o serratie, protey či morganely) [USEMAP] Induktory a selektory betalaktamáz •Tvorba některých betalaktamáz může být indukována používáním určitého antibiotika (induktoru). Příkladem induktoru je ko-amoxicilin •Nebezpečnější než induktory jsou však selektory: poměrně účinná antibiotika, která vyhubí citlivou část populace, a zůstanou pouze odolné, polyrezistentní kmeny. Příkladem jsou cefalosporiny třetí generace. Pokles jejich používání vedl ve všech nemocnicích k poklesu výskytu ESBL pozitivních kmenů. [USEMAP] Aktuální situace •V nemocnici u sv. Anny jsou bohužel velmi běžné. Lokálně se jejich výskyt na určitých klinikách či odděleních daří omezit, obecně se však stále vyskytují velmi často •Časté na urologii, interně, ARK – často nozokomiální a chronické (lze se pokusit o přípravu autovakcíny) •Před několika lety byly vzácné, poté nástup ESBL-producentních klebsiel. Nyní již i E. coli a řada dalších enterobakterií Zjištění produkce ESBL při běžném testování citlivosti mikrodilučním testem •Testy jsou záměrně uspořádány tak, aby ko-amoxicilin byl obklopen mohutnými betalaktamovými antibiotiky (aztreonam, cefotaxim). •V místě, kam difundoval jak např. aztreonam, tak i kyselina klavulanová z ko-amoxicilinu, vzniká charakteristické čočkovité projasnění růstu mikroba. [USEMAP] Test dvojité synergie jako součást běžného difusního diskového testu •Povšimněte si dvou čočkovitých zón kolem disku ko-amoxicilinu (= amoxicilin + klavulanová kyselina) DDSa.JPG Disk ceftazidimu Disk aztreonamu Disk ko-amoxicilinu Foto: O. Z. [USEMAP] „ABCD“ test •U tohoto testu ověřujeme přítomnost dvou typů betalaktamáz najednou. Rozdíly mezi jednotlivými antibiotiky jsou typické buď pro betalaktamázu typu ESBL (1) nebo pro ampC betalaktamázu konstitutivního typu (2) Foto: Mikrobiologický ústav C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\Petře14-12-2016\ABCD\IMG_4064_ESBL.JPG C:\Users\Petra\Desktop\projekt foto\původní foto\Petře14-12-2016\ABCD\IMG_4094 AmpC.JPG [USEMAP] 1 2 Terapie •Meropenem, imipenem, ertapenem •Aminoglykosidy – jsou-li citlivé •Případně další (chinolony, colistin) •Cefalosporiny 4. generace či laktamáz se nedoporučují, i když jsou in vitro účinné •Nedoporučují se ani kombinace s inhibitory betalaktamáz, i když i ty se jeví jako účinné •Náklady na tuto léčbu jdou do desítek tisíců/den [USEMAP] Prevence •Obdobná jako v případě MRSA – obecná opatření, vedoucí ke snížení rizika nozokomiálních nákaz •Cílená léčba neširokospektrými antibiotiky •Výrazná restrikce používání zejména cefalosporinů III. generace, ale i uvážlivější podávání cefalosporinů II. a I. generace, aminopenicilinů aj. •Případně screening střevního nosičství (není běžné) [USEMAP] [USEMAP] ZPĚT NA HLAVNÍ OBSAH PREZENTACE