NA STOPĚ PACHATELE Díl jedenáctý: Spolupráce při pátrání aneb Klinická mikrobiologie II + Pachatelé v biofilmu Mikrobiologický ústav uvádí L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c [USEMAP] Hlavní obsah •Poznámka: Z praktických důvodů tato prezentace zahrnuje celé téma mikrobiálního biofilmu v klinické mikrobiologii. V praktiku je ale toto téma rozděleno – část úkolů (ty, které se týkají trávicího traktu, konkrétně ústní dutiny) jsou součástí jedenáctého tématu, zbytek (biofilm na cévních katetrech) součástí třináctého tématu. Dýchací a trávicí infekce Biofilmové infekce Přehled témat [USEMAP] Dýchací infekce – úvod Indikace k vyšetření při chorobách dýchacích cest Odběry a vyšetřování u dýchacích infekcí Zpracování a vyhodnocení respiračních vzorků Význam a rozdělení infekcí trávicích cest Odběry a vyšetření u infekcí střeva DÝCHACÍ A TRÁVICÍ INFEKCE 70% Zpět na hlavní obsah Dýchací infekce – úvod Význam infekcí dýchacích cest (respiračních nákaz) lJsou to nejběžnější infekce v ordinaci praktického lékaře (mikroby se v dýchacích cestách snadno pomnožují) lMají obrovský ekonomický dopad (neschopenky, OČR) lMají sklon vyskytovat se v kolektivech a občas probíhat v podobě epidemií lTři čtvrtiny respiračních infekcí (a u dětí ještě více) vyvolávají viry Umístění nákazy v rámci dýchacích cest lNení jedno, kterou část dýchacích cest infekce postihuje (liší se vyšetřování, léčba i závažnost). –Příznaky infekcí různých částí dýchacího traktu jsou různé (smrkání u rhinitid, kašel u infekcí DCD) –Různí jsou také původci lProto je třeba rozlišovat infekce: –horních cest dýchacích (plus anatomicky i středního ucha, které s nimi souvisí) –dolních cest dýchacích, včetně plic (někdy se plíce kladou zvlášť, nejde už o „cestu“) –Je ale potřeba počítat také s tím, že infekce může postihovat více částí dýchacích cest současně. Rozdělení dýchacích infekcí •HCD a přilehlé orgány linfekce nosu a nosohltanu linfekce ústní části hltanu (faryngu) včetně mandlí linfekce vedlejších dutin nosních •někdy se sem přiřazují z anatomických důvodů také infekce středního ucha •DCD a plíce: linfekce příklopky hrtanové linfekce hrtanu (laryngu) a průdušnice (trachey) linfekce bronchů (průdušek) linfekce bronchiolů (průdušinek) linfekce plic Není chřipka jako „chřipka“ lVětšina běžných akutních onemocnění dýchacích cest probíhá jako rhinitidy, faryngitidy nebo smíšené rhinofaryngitidy (záněty nosu a hltanu). Epidemiologové používají zkratku „ARI“ – acute respiratory illness (akutní respirační onemocnění). Lidé často mluví o „chřipce“, ale o tu tady nejde lPravá chřipka sice postihuje dýchací cesty, ale spíše dolní, projevuje se suchým kašlem a také celkovými příznaky (schvácenost, horečka). Podobně se ovšem mohou projevovat i například tzv. parachřipky. Epidemiologové tady používají zkratku „ILI“ (influenza-like illness, chřipce podobná onemocnění). •. Normální osídlení dýchacích cest lNosní dutina nemá specifický mikrobiom, přechází tam však mikrobiom z kůže (přední část) a hltanu (zadní část) lV hltanu (stejně jako v ústní dutině) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme lPlíce a dolní dýchací cesty jsou za normálních okolností bez většího množství mikrobů lNa ostatních místech (hrtan) jsou různé přechody (hrtan – jako v hltanu, ale méně) [USEMAP] Indikace k vyšetření při chorobách dýchacích cest Vyšetřování a léčba infekcí nosu a nosohltanu lVyšetřování je zbytečné. Ani hlenohnisavý sekret není důvodem provádět bakteriologické vyšetření, pokud netrvá delší dobu. lLéčba je symptomatická (při ucpaném nosu kapky, jinak tekutiny, např. čaj; ani antipyretikum není příliš vhodné, protože zvýšená teplota pomáhá proti virům). Antibiotická léčba není indikována. Nanejvýš je možno zkusit lokální léčbu framykoinem. lPouze pokud infekce trvá déle než 10–14 dnů, je vhodné vyšetřit výtěr z nosu (vyhnout se kontaminaci z kůže!) a léčit cíleně antibiotiky dle citlivosti Co praví odborníci •„Více než 80 % rhinitid je provázeno změnami na sliznicích dutin, proto toto onemocnění bývá nazýváno také rhinosinusitida. Kašel provází asi 60–80 % rhinosinusitid. Hlenovitá sekrece z nosu se do tří dnů od počátku onemocnění mění v hlenohnisavou, obsahující deskvamované epiteliální buňky a kolonizující bakterie běžně se vyskytující v nose. Tato kvalitativní změna sekrece, která bývá často v ambulantní praxi nesprávně považována za bakteriální komplikaci, zejména provede-li se kultivační vyšetření hlenu nebo výtěru z nosu, však patří k přirozenému průběhu virové rhinosinusitidy.“ •(Respirační infekce – doporučený postup ČLS JEP) Vyšetřování a léčba infekcí přínosních dutin lLéčba sinusitidy pravděpodobného bakteriálního původu by měla být zahájena neprodleně, i bez vyšetření. lLékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), případně amoxicilin-klavulanát (AUGMENTIN, AMOKSIKLAV) alternativou může být doxycyklin (DOXYBENE), u dětí kotrimoxazol (např. BISEPTOL) lVyšetřovat výtěr z nosu či krku je k ničemu. lPokud máme pochybnosti o úspěšnosti léčby a chceme léčit cíleně, jediná možnost je správně provedená punkce či výplach dutin na ORL, samozřejmě pokud výplach, ne borovou vodou!! Na žádanku nutno uvést, zda jde o čistý punktát, nebo proplach fyziologickým roztokem Vyšetřování a léčba infekcí středního ucha lLéčba má smysl, pokud jde o skutečně prokázaný zánět (bolest, zarudnutí, horečka) a nereaguje na protizánětlivou léčbu lLékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), alternativou může být kotrimoxazol lVyšetřovat výtěr ze zvukovodu má smysl pouze po provedené paracentéze (propíchnutí bubínku) lJinak má samozřejmě smysl vyšetřit hnisavou tekutinu, která je při paracentéze odebrána Vyšetřování a léčba infekcí z krku lVždy by měl být proveden výtěr z krku (tonsil) k ověření bakteriálního původu a případně určení původce. (To, že mnozí lékaři výtěry nedělají, ještě neznamená, že je to tak dobře.) lProtože ale zpravidla není možné čekat na výsledek kultivace, provede se také vyšetření CRP (zvýšený u bakteriálních infekcí, typicky nad 60 mg/l – u virové naopak pod 40 mg/l), jehož výsledek je k dispozici mnohem dříve lLéčba by měla být cílená. U angín způsobených Streptococcus pyogenes (a těch je naprostá většina) je lékem první volby V-penicilin. Makrolidy (RULID, KLACID, SUMAMED, AZITROX) by se měly používat pouze u alergických pacientů. lPřípadně serologie EB viru a cytomegaloviru (vyloučení infekční mononukleózy a cytomegalovirózy) Vyšetřování a léčba zánětů hrtanu (a průdušnice) lNení co vyšetřit. Dělat např. výtěr z krku je nesmyslné, protože v krku jsou úplně jiné bakterie. Mikrobiologické vyšetření se tedy až na výjimky (chronické stavy) neprovádí lLéčba je jen symptomatická. Antibiotika nejsou indikována prakticky za žádných okolností Vyšetřování a léčba zánětů průdušek a průdušinek lZákladem je klinické vyšetření, které prokáže rozvoj kašle s vykašláváním, bez nálezu na plicní tkáni (podle rentgenu a klinického vyšetření) lLaboratorní vyšetřování je většinou zbytečné. U vykašlávání hnisu se zasílá sputum (chrchel), neboť je pravděpodobná sekundární bakteriální infekce. V tom případě má také smysl vyšetřit CRP. Dále je možno poslat krev na serologické vyšetření protilátek proti mykoplasmatům a chlamydiím. lLéčba antibiotiky je většinou zbytečná, u mykoplasmat a chlamydií se použijí tetracykliny nebo makrolidy Zvláštní případ: akutní zhoršení chronické bronchitidy lCharakterizována –zhoršením kašle –zvýšenou expektorací a změnou charakteru sputa i jeho barvy –často zhoršením dušnosti. lPůvodci jsou do 40 % viry lZ baktérií jsou nejčastějšími vyvolavateli H. influenzae, Streptococcus pneumoniae či Moraxella catarrhalis. lRutinní antibiotická léčba pacientů se nedoporučuje lPodání atb má prokazatelný účinek pouze pokud jsou u pacientů přítomny současně všechny tři příznaky onemocnění Mikrobiologické vyšetřování infekcí plic lU klasických komunitních pneumonií –krev na hemokultivaci (hemokultura) –sputum – mikroskopické a základní kultivační vyšetření –sputum – kultivační průkaz Legionella pneumophila* –moč – průkaz antigenu Legionella pneumophila* lU atypických pneumonií –krev – sérologické vyšetření (průkaz protilátek) –hemokultura a sputum na bakteriologii (pro jistotu) –virologické vyšetření (sérologie, přímý průkaz) –sputum – přímý průkaz původce (EIA, PCR) •Speciální případy: TBC (sputum na TBC), plicní aspergilóza (kultivace BAL, antigeny v krvi, serologie) •Pneumonie způsobené Legionella pneumophila jsou na pomezí mezi klasickými a atypickými. [USEMAP] Odběry a vyšetřování u dýchacích infekcí Odběr vzorků na vyšetření z dýchacích cest obecně (1) lNa bakteriologii posíláme –výtěry – (z krku, tonzil, nosu apod.), vždy na tamponu v transportní půdě (např. Amiesově), popsat odkud je výtěr –sputum, tracheální aspirát či bronchoalveolární laváž, případně také různé endotracheální kanyly a podobné vzorky, u bronchitid a pneumonií (požadavek vyšetření TBC musí být na žádance!) –hemokulturu u pneumonií –moč na legionelový antigen lNa mykologické vyšetření volíme výtěr na tamponu v soupravě FungiQuick (ale také běžný Amies) Odběr vzorků na vyšetření z dýchacích cest obecně (2) lViroví původci se většinou nevyšetřují. lJe-li výjimečně potřeba je vyšetřit, volíme např. výplachy z nosohltanu a bronchoalveolární laváže speciálním médiem, či krev na serologii respiračních virů (tj. na protilátky – je ale třeba počítat s tím, že protilátky se vytvoří až za týden či dva po propuknutí nemoci) lU viru chřipky se používá výtěr ze zadní stěny faryngu do speciálního transportního média Výtěr z krku – technika lOdběrový materiál: Tampon na tyčince v transportním mediu podle Amiese. lZpůsob odběru: –Tampon se zavede za pomoci špátle za patrové oblouky, aniž by došlo k dotyku se sliznicí dutiny ústní. –Válivým pohybem se razantně setře povrch obou tonsil a patrových oblouků tak, aby se do tamponu nasálo dostatečné množství slizničního sekretu. –Současně se provede výtěr ze zadní stěny faryngu. –Tampon se opatrně vyjme, aby se zabránilo jeho kontaminaci, a vloží se do sterilního obalu, nejlépe s transportním médiem. lUchovávání: Do 24 hodin při pokojové teplotě (na kapavku neuchovávat a zaslat okamžitě) lTransport: Do 2 hodin při pokojové teplotě. Výtěr z nosohltanu („pertussoidní“ syndrom, podezření na dávivý kašel) lOdběrový materiál: Tampon na drátu; na bordetely nutno ihned naočkovat na speciální kultivační půdu, na hemofily stačí zaslat v transportní půdě lZpůsob odběru: Koncová část (asi 3 až 4 cm) tamponu na drátě se ohne o hranu odběrové zkumavky do úhlu 90°, zavede se ústní dutinou za patrové oblouky k zadní stěně nasopharyngu, aniž by došlo k dotyku se sliznicí dutiny ústní nebo tonsil. Krouživým, vějířovitým pohybem se provede stěr z faryngeální sliznice (tamponem vzhůru). lUchovávání: Okamžitý transport do laboratoře. lTransport: Do 2 hodin od odběru při pokojové teplotě. Odběr sputa lOdběrový materiál: Sterilní průhledný kontejner z umělé hmoty se šroubovacím víčkem. lZpůsob odběru: –Odběr se provádí vždy za dohledu sestry nebo lékaře. –Pacient si vypláchne ústa a vykloktá vodou (omezení kontaminace ústními bakteriemi) –Poté pacient zhluboka zakašle tak, aby vykašlal sekret z dolních dýchacích cest, nikoliv sliny či sekret z nosohltanu. –Takto získané sputum se zachytí do sterilního kontejneru v objemu nejméně 1ml. lUchovávání: Do 24 hodin při chladničkové teplotě lTransport: Do 2 hodin při pokojové teplotě. Možná vyšetření u plicních infekcí lZákladem je klinické vyšetření a rentgen, důležité je rozlišení klasické × atypické pneumonie (zcela jiné spektrum původců) lU klasických pneumonií má smysl správně odebrané sputum, případně (zejména u septického průběhu) krev na hemokultivaci lU atypických pneumonií serologie mykoplasmat a chlamydií (případně v rámci „serologie respiračních virů“). lU nemocničních pneumonií může připadat v úvahu navíc cílené vyšetření na legionely. Kromě kultivačního vyšetření je možné i vyšetření moče na legionelový antigen, případně serologie Co napsat na žádanku o vyšetření lKromě vyplnění obvyklých polí (jméno, číslo pojištěnce…) je důležité pole požadavku, co má být vyšetřeno. lPříklady formulací na žádance: –výtěr z krku na bakteriologii –punktát čelní dutiny na bakteriologii + kvasinky –krev na serologii původců atypických pneumonií –sputum na bakteriologii –sputum na TBC (kultivace + PCR) –hemokultura č. II z periferie –bronchoalveolární laváž (BAL) na Pneumocystis jirovecii [USEMAP] Co je potřeba vědět lNa průvodku je nutno uvést, o jaký vzorek jde, jaké vyšetření je požadováno, a případně další podstatné údaje lMikrobiolog má právo odmítnout špatně odebraný vzorek sputa (nehnisavý, neobsahuje leukocyty, jen epitelie à jsou to sliny!!!) lKultivace tuberkulózy trvá několik týdnů, stejně tak kultivace některých hub lU virologie a průkazů různých antigenů závisí rychlost vyšetření hlavně na organizaci práce Zpracování a vyhodnocení respiračních vzorků Co se se vzorky děje v laboratoři lVětšina výtěrů se kultivuje na krevním agaru. Na ten se umisťují disky, jejichž cílem je odclonit běžnou flóru a umožnit záchyt patogenů. Kvůli hemofilovi, který na KA roste jen v přítomnosti např. zlatého stafylokoka, se na agar očkuje stafylokoková čára. (Poznámka: Některé laboratoře považují hemofily za normální nález, a tudíž po nich ve faryngu vůbec nepátrají.) lU sput apod. se také provádí mikroskopie lKromě KA se užívají další půdy, např. Endova lVirologické vzorky se izolují na vajíčkách či tkáňových kulturách, nebo se hledá antigen lV serologických vzorcích se hledají protilátky Jak najít možného patogena mezi běžnou orofaryngeální flórou •Běžná orofaryngeální flóra zahrnuje ústní streptokoky (bezbarvé drobné kolonie s viridací) a ústní neisserie (drobné žlutavé kolonie bez hemolýzy. To výrazně ztěžuje hledání možných patogenů. Přesto: –Hemolytické streptokoky (ale i zlatý stafylokok) se projeví výraznou hemolýzou na krevním agaru –Pro záchyt hemofilů se používá disk s bacitracinem – ve vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu (k odclonění běžné flóry) –Pro záchyt meningokoků se používá disk se směsí vankomycinu s kolistinem Záchyt patogena v krku či sputu Očkování krku 3 inverzní 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé), případně pneumokocích (podobné ústním streptokokům, ale penízkovité nebo naopak výrazně mukózní) Kultivační výsledek výtěru z krku s běžnou flórou a patogenem Foto: Filip Daněk Výtěr z krku Vysvětlivky k dalšímu textu •KA – krevní agar •EA – Endův agar; většinou lze místo něj použít alternativně také McConkeyho agar •KA+AMIK – krevní agar s amikacinem, selektivní pro streptokoky a enterokoky •NaCl – KA s 10 % NaCl, selektivní pro stafylokoky •B – bujón • Vyšetření sputa Diagnostické schéma (1) •Den 0: mikroskopie (Gramovo barvení) •Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA a EA. Je-li přítomna jen běžná flóra, EA se vyhodí a KA se prodlužuje do dalšího dne. Případný patogen se určuje a testuje se jeho citlivost; je-li ho málo, dělá se jeho izolace (kolonie se opatrně nabere kličkou a naočkuje se na celou misku křížovým roztěrem tak, aby se určitě získal čistý kmen. •NaCl se u sputa nevyužívá, ale u některých jiných respiračních vzorků (tracheální aspiráty, bronchoalveolární laváže) ano. Vyšetření sputa Diagnostické schéma (2) •Den 2: expedice negativních výsledků (prohlížení „prodlužek“, jak říkáme u nás, či „dohřívek“, jak říkají v nemocnici na Homolce). Expedice většiny pozitivních výsledků, je-li bližší určení hotovo a test citlivosti uspokojivý. Není-li, nebo je-li hotova teprve izolace, „jede se dál“. •Den 3: expedice většiny zbylých pozitivních výsledků (rezistentní, špatně určitelné, z izolací) •Den 4: výjimečně expedice posledních výsledků Sputum – možné nálezy •Běžná flóra: V DCD sice není, ale při průchodu HCD vždy dochází ke kontaminaci ústními streptokoky a neisseriemi •Patogeny: pneumokoky, pyogenní streptokoky, hemofily (klasické pneumonie). Původci atypických pneumonií většinou nejsou kultivovatelní. •Jedním z nejčastějších nálezů je Staphylococcus aureus. Lékem volby by měl být oxacilin, ovšem ten není t. č. dostupný v perorální formě. Mohl by se tedy použít např. některý cefalosporin I. generace. Praktická poznámka •Malé, našedlé kolonie, skoro bezbarvé, s viridací, to jsou ústní streptokoky. •Malé, nažloutlé kolonie, bez viridace, bez hemolýzy (nebo s nepatrně naznačenou hemolýzou), oxidáza pozitivní, to jsou ústní neisserie •Pokud na misce vidíme ještě něco jiného, a zvlášť pokud to „něco“ má výraznou hemolýzu, bude to asi hledaný patogen. „Odečítání“ bakteriologie Klin4 Archiv MiÚ LF MU Výtěr z krku Diagnostické schéma •Den 0: pouze nasazení kultivací •Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA a EA. NaCl se zde nepoužívá. I v tomto případě se KA s běžnou flórou prodlužují •Den 2: expedice všech negativních a většiny pozitivních výsledků •Den 3: expedice téměř všech zbylých pozitivních výsledků Farynx – možné nálezy •Běžná flóra: Ústní streptokoky a neisserie; hemofily (hlavně H. parainfluenzae), za normální se považuje i malé množství aureů, pneumokoků, meningokoků, moraxel apod. Další součásti běžné flóry (anaeroby, spirochety) se při běžné kultivaci neodhalí •Patogeny: pyogenní streptokoky, arkanobakteria; často se nenajde nic a původ je virový (EB viry a jiné respirační viry) •Nejvýznamnějším patogenem je Streptococcus pyogenes. Lékem volby u nealergických pacientů je jednoznačně – ale to přece víte J • [USEMAP] Význam a rozdělení infekcí trávicích cest Význam infekcí trávicích cest •Mnohé z nich jsou přenášeny kontaminovanými potravinami a vodou •Nepříjemné, ekonomické ztráty nejen při infekci, ale i při kontaktu s infekcí •Pro jejich předcházení je zásadní hygiena v potravinářských výrobnách a provozovnách a ochrana vodních zdrojů •Důležitá je také osobní hygiena včetně hygieny dutiny ústní •V léčbě jen výjimečné použití antibiotik Rozdělení trávicích infekcí •Rozlišujeme –infekce v dutině ústní –infekce hltanu – viz respirační infekce –infekce jícnu – velice vzácné, většinou sekundární při původně neinfekční nemoci –infekce žaludku (či spíše spolupůsobení žaludečních mikrobů u některých chorob) –infekce tenkého střeva (enteritidy) –infekce tlustého střeva (kolitidy) –často infekce obou částí (enterokolitidy) Normální osídlení trávicích cest •Rty znamenají přechod kožní a ústní flóry •V ústní dutině (stejně jako v hltanu) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme •Jícen a žaludek jsou za normálních okolností bez většího množství mikrobů •V tenkém a zejména tlustém střevě nacházíme zpravidla asi 1 kg anaerobů, dále enterobakterie, enterokoky, kvasinky, někdy i nepatogenní améby • Řiť je opět místem přechodu střeva a kůže [USEMAP] Odběry a vyšetřování u infekcí střeva Odběr a transport stolice na jednotlivá vyšetření •Bakterie – v Amiesově transportní půdě •Kvasinky – lépe sice v půdě FungiQuick, ale v zásadě také stačí Amiesova transportní půda •Viry – vzorek velikosti lískového oříšku; má-li být provedena izolace viru, je nutno chladit •Paraziti – opět velikosti lískového oříšku, nemusí být sterilní. Označit cestovatelskou anamnézu! Zpravidla tři vzorky (jeden negativní nevylučuje pozitivitu) •Toxin Clostridiodides (Clostridium) difficile – tekutá stolice ve zkumavce •Roupi – Grahamova metoda – perianální otisk na speciální lepicí pásku, mikroskopuje se •Otravy bakteriálním toxinem – zvratky, zbytky jídel Odběr stolice na bakteriologii •Pacient stojí (klečí) a opírá se o ruce (lokty) nebo leží. •Odběrový tampon se opatrně zavede za anální svěrač, opatrnou rotací se setře povrch anální sliznice a krypt •Při správném odběru je stolice makroskopicky zřetelná na povrchu tamponu. •Tampon se vloží do nádobky (zkumavky) určené k transportu, v nádobce s transportním mediem tampon musí být zanořen hluboko do media. Nádobka musí být dobře uzavřena. •Uchovávání a transport probíhají při pokojové teplotě, lepší je ovšem doručit vzorek ihned •Na žádanku je vhodné uvést adresu pacienta Proč adresu? •V případě nálezu obligátního patogena (salmonela, shigela, kampylobakter, yersinie) je laboratoř povinna hlásit nález na územně příslušné pracoviště hygieny, takže jednak musí vědět, na které okresní pracoviště volat, jednak při samotném hlášení je adresa vyžadována, aby mohl být pacient osloven •Pokud na žádance adresa není, zjistí laboratoř adresu telefonickým dotazem (což je ovšem zbytečně zdlouhavé) Odběr kusové stolice (na parazity, případně viry) •Pro odběr se používá kontejner s lopatkou, sterilita není striktně vyžadována (hlavně u parazitů) •Pacient odebere po defekaci kousek stolice velikosti lískového ořechu (ne menší), ne z povrchu stolice, ne tak, aby mohlo dojít ke kontaminaci •U parazitů nutno vyšetřit několikrát za sebou, zpravidla se provádí tři dny po sobě •Materiál lze uchovat v lednici, ale nesmí zmrznout •Při vyšetření na lamblie je lépe doručit materiál do laboratoře čerstvý; je vhodné domluvit s laboratoří čas odběru. U izolace virů nutno uchovávat při 0 °C •Je-li stolice tekutá, je možno odebrat vzorek do jakékoli nádobky. To platí také při testování na toxin Clostridioides difficile Ještě ke stolici na parazity •Důležité je uvedení tzv. cestovatelské anamnézy, tedy nejen „návrat ze zahraničí“, ale také přesně které oblasti, které pacient navštívil •Pokud je ve stolici přítomen makroskopicky přítomen celý parazit (např. škrkavka), lze poslat přímo tohoto parazita ve zkumavce •Ovšem pozor, často pacienti tvrdí, že si ve WC míse našli parazita a ve skutečnosti jim do mísy živočich (třeba žížala) spadl např. z okenního parapetu •Někdy je přesvědčení o přítomnosti parazita ve střevě součástí psychiatrické diagnózy pacienta Odběr na roupy (Grahamova metoda) •Odběr se provádí ráno bez omytí (samičky roupů přes noc nakladou vajíčka do perianálních řas) •Před odběrem průhlednou (!) lepicí pásku opatrně odlepit z podložního skla, přiložit na anální otvor a řasy v jeho okolí, stisknout hýždě proti sobě, pak zase rozevřít a pásku opatrně přemístit zpátky na sklo •U dospělých (bolestivost kvůli ochlupení) se použije odběr stolice (je ale menší výtěžnost), případně se použije tzv. Schüffnerova tyčinka Diagnostika bakteriálních původců •Mikroskopie nemá praktický význam •Kultivace se provádí na různých půdách (výběr závisí na stáří pacienta a diagnóze, u cestovatelů případně přidáváme i méně obvyklé půdy), nalezené patogeny jsou identifikovány – viz dále •Přímý průkaz toxinů A a B (Clostridioides difficile) jako antigenu. Průkaz toxinu je důležitější než samotný nález klostridia nebo nález strukturálního antigenu, na druhou stranu i nález antigenu bereme v případě odpovídajících příznaků vážně (více viz P07) Diagnostika virových původců: většinou průkaz antigenu, případně virové nukleové kyseliny. Diagnostika parazitárních a houbových původců: vizte speciální téma věnované této problematice Den 0. (přijatá stolice) •Negativní výsledek je za 48h •Pozitivní za 72h a déle selenit 24hod 48hod identifikace Endo Endo XLD MAL MCs KA NaCl CCDA CIN + 72hod 42°C 28°C *Není-li uvedeno jinak, kultivace probíhá při 37 °C Kultivace stolice Selenit, XLD, MAL – na salmonely CIN – na yersinie CCDA – na kampylobaktery NaCl – na stafylokoky MCS – na některé STEC Endo – na různé enterobakterie KA – na některé další bakterie Identifikace bakterie •Bakterie kultivujeme na různých půdách, po kultivaci je odečítáme s tím, že •U Endovy půdy se snažíme indentifikovat součásti běžné flóry (zpravidla E. coli) a možné patogeny •U ostatních půd zapisujeme pouze jako –„suspektní“ – podobné pozitivní kontrole, nutná další diagnostika –„negativní“ – nejen v případě, že na půdě nic neroste, ale také pokud se bakterie nepodobají kontrole •Bakterie dále identifikujeme, zpravidla biochemickými testy nebo jinak (např. MALDI-TOF) •V některých případech (salmonely, escherichie u malých dětí) je žádoucí antigenní analýza vypěstovaného kmene Interpretace vyšetření stolice •U výsledků vyšetření stolice je nutno rozlišovat, zda jde o primární patogeny (salmonely, shigely, yersinie, kampylobaktery) nebo jen podmíněné patogeny; u některých podmíněných patogenů (především u Escherichia coli) je velmi žádoucí bližší určení (EPEC, STEC, EAggEC a další) •Interpretace se musí dít v kontextu klinických příznaků (při masivním nálezu tzv. nepatogenních améb a zároveň výrazných potížích může být vhodné přeléčení) •V případě infekce Clostridioides difficile je důležité, zda je pozitivní klostridiový toxin. Nicméně i samotný nález antigenu při negativitě toxinu se považuje za významný, pokud odpovídají klinické příznaky. vytkrk [USEMAP] Archiv MiÚ LF MU Zpět na hlavní obsah BIOFILM Na úvod •My jsme skvělá flóra běžná •k našemu člověku něžná •osídlíme povrchy •číháme tu na mrchy • •Scházíme se každý pátek •za účelem tvorby látek •z kterých vzniká biofilm •pevnější než dub i jilm! • •(Píseň běžné flóry, in: O. Zahradníček – Advent v dutině ústní. Zkráceno) [USEMAP] Přehled témat Klinické případy spojené s biofilmem Základní charakteristika biofilmu Diagnostické a experimentální metody u biofilmu Bonus: Více o biofilmu Klinické případy spojené s biofilmem Příběh první (tentokrát skutečný) •Muž, 58 let, v roce 2001 zaveden kardiostimulátor, v roce 2002 opakovaně hospitalizován na interním oddělení s teplotami nejasné etiologie, vzestup zánětlivých markerů •V hemokulturách prokázán S. epidermidis s velmi dobrou citlivostí •Několikrát dlouhodobě přeléčován vysokými dávkami antibiotik v kombinacích (oxacilin, gentamicin, rifampicin, cefazolin, cefalotin, klindamycin) •Zpočátku vždy dobrá odezva, poté se objevují ataky teplot i v průběhu terapie. •Při transesofageálním vyšetření nález vegetace na komorové elektrodě o velikosti 1,5 × 1,5 cm. •Kardiologové opakovaně odmítají odstranění kardiostimulátoru. Nasazena kombinace antibiotik oxacilin + gentamicin + rifampicin, pacient v dobrém klinickém stavu. •Znovu však dochází k vzestupu teplot a zvýšení CRP. Nasazena terapie vankomycin + rifampicin, po zlepšení stavu je pacientovi odstraněn trombus a vyměněna elektroda (pod clonou ATB), to vede k celkovému zlepšení stavu pacienta. Příběh – pokračování Viníkem byl biofilm •Neúspěch zvolené ATB terapie byl zapříčiněn tím, že nebyla brána v úvahu vysoká rezistence mikroba rostoucího ve formě biofilmu vůči těmto antibiotikům. •Léčba nebyla od samého začátku dostatečně razantní a nedošlo k eradikaci ložiska biofilmu. •Teprve odstranění elektrody (pod clonou ATB) došlo ke zlepšení stavu pacienta. Příběh druhý •Michal byl 13letý kluk. Nenáviděl rodiče a rozhodl se udělat cokoli, co bude proti nim.. •Rozhodl se, že jedna z metod boje s rodiči by mohla být blokáda všeho, co po něm rodiče chtějí. •A tak si přestal čistit zuby, udržovat pořádek ve svém pokoji a dělat některé další podobné věci. •Brzy ho ale začaly bolet zuby. Musel k zubaři, který konstatoval těžký zubní kaz. Zubařka mu zuby spravila, ale také nemilosrdně trvala na tom, že si musí začít zuby zase čistit, jinak že bude mít problémy znova – ne jen s ní (a ostatními z generace „vraťte-se-do-hrobu), ale hlavně s vlastními zuby. Zločincem byl •…opět přerostlý biofilm. •V ústní dutině je biofilm normální. Je dokonce užitečný: normální ústní flóra se organizována ve formě biofilmu, a tak se může bránit vnějším vlivům včetně patogenních agens •Nicméně příliš přerostlý biofilm (jako výsledek příliš velkého množství zkonzumovaných cukrů a příliš malého čištění zubů) způsobuje, že biofilm se stává nepřítelem, místo aby byl přítelem pacienta. [USEMAP] Základní charakteristika biofilmu [USEMAP] Biofilm: co je to? •Biofilm je komplexní, organizovaná struktura •Skládá se z živých buněk (většinou bakterií), hmot jimi produkovaných (většinou polysacharidů) a kanálků •Není přítomen jen v živých organismech, ale i v prostředí. Například kámen, na které jsme uklouzli v létě v řece či rybníku, byl asi pokryt biofilmem. Biofilm je významný i například v potravinářství Různé obrázky biofilmu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Tol 01.JPG Foto: Archiv of Veroniky Holé Biofilm na katetru Různé obrázky biofilmu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Tol 01.JPG Foto: Archiv of Veroniky Holé Biofilm na katetru Bakterie Kanálek Katetr Polysacharidy Vznik biofilmu •Na začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie + •Bakterie adheruje na povrch •Následuje agregace dalších bakterií •Bakterie začnou produkovat polysacharidovou matrix •Až vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm • •Biofilm může být jedno- či vícedruhový E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Model.gif Význam tvorby biofilmu u bakterií •Bakterie mohou lépe regulovat početnost populace – v rámci biofilmu se totiž informují produkcí určitých látek (tzv. quorum sensing) •Bakterie se stávají odolnější vůči vnějším vlivům, např.: –desinfekčním prostředkům –antibiotikům –imunitní reakci hostitele • •Biofilm tvoří jak bakterie běžné flóry (z hlediska organismu spíše pozitivní), tak i patogeny. Mechanizmy ovlivňující rezistenci k antibiotikům •Vliv povrchového náboje •Snížení růstové rychlosti •Penetrační bariéra •Nehomogenní matrix •Fenotypové odlišnosti •Intercelulární signalizace •Imunitní mechanizmy... Eradikace biofilmu •Antibiotická léčba často potlačí pouze symptomy infekce způsobené buňkami uvolněnými z matrix biofilmu a jejich interakcí s imunitním systémem, buňky uložené v matrix biofilmu není schopna zasáhnout. •K eradikaci biofilmu je možno využít vysokých koncentrací ATB či jejich kombinací (např. ATB zátka katétru), pokud léčba selhává, je nutno vyjmout ložisko biofilmu •V budoucnu se určitě budeme pokoušet přímo rozbít biofilm, například pomocí enzymoterapie Prevence •Katétry a kostní cementy –vyrobené z nové generace plastů (snížení rizika adheze a tvorby biofilmu) –s koloidním stříbrem a dalšími povrchově aktivními látkami –s antimikrobiálními substancemi, např. •minocyklin •rifampicin •Proplachy katétrů •Dodržování pravidel asepse, správné dekontaminační postupy apod. [USEMAP] Diagnostické a experimentální metody u biofilmu Biofilm a mikrobiologická diagnostika •a) Průkaz biofilmu –aa) fenotypovými metodami (Christensenova metoda, Kultivace na agaru s kongo červení) • • • • –ab) genotypovými metodami •b) Stanovení citlivosti bakterií v biofilmu k jednotlivým antibiotikům (MBEC) •c) Zohlednění tvorby biofilmu při běžné bakteriologické diagnostice: např. při kultivaci žilních katetrů se volí specifické metody (viz dále) namísto klasického pomnožení v bujonu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Dizertacka obrazky\CTT 01.JPG E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Dizertacka obrazky\CRA 02.JPG Foto: Archiv Veroniky Holé Mikroskopie orálního biofilmu •Vedle oficiálních metod pro průkaz biofilmu existují i další možnosti, jak zviditelnit biofilm. •V případě orálního biofilmu: •Gramovo barvení umožňuje pozorovat shluky bakterií (G+ i G- ) a případně buňky makroorganizmu (epitelie apod.). Polysacharidové hmoty zůstávají nezbarvené. E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Alcian 02.JPG nBarvení alciánovou modří naopak umožňuje i znázornění polysacharidového materiálu, tj. nebuněčné části biofilmu, buňky jsou zde znázorněny negativním barvením Foto: Archiv Veroniky Holé Průkaz vlivu čištění zubů na orální biofilm E:\Pracovní\Mikrobiální biofilmy\Kapitoly kniha\Zuby\Obrazky\ zubní kámen 2.jpg E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\detekce plaku - erytrosin.jpg nDobrovolník má připravený jodový roztok či tablety s barvivem barvícím zubní plak. nRoztok se nechá působit v dutině ústní cca 2 min. Foto: Archiv Veroniky Holé Foto: Archiv Veroniky Holé Kultivace bakterií tvořících biofilm nPokud bakterie tvoří biofilm, je doporučeno použít před vlastní kultivací materiálu speciální postupy nV případě kultivace centrálního venózního katétru s předpokládanou kolonizací existují dvě metody. Obě jsou výhodnější než klasická kultivace v bujónu, sonifikace je však ještě o něco lepší než Makiho metoda •Klasická kultivace v bujonu: Uvolní se bakterie v planktonické formě. Bakterie ve formě biofilmu se uvolní málo nebo vůbec. Vzhledem k použití bujónu jako pomnožovací půdy nevíme nic o kvantitě (kontaminace × infekce). •Semikvantitativní metoda: Umožňuje nám zmapovat povrch katétru a semikvantitativně posoudit nález, nevypovídá však o bakteriích v lumen a bakterie se nemusí uvolnit z biofilmu. •Sonifikace: rozrušuje biofilm na povrchu i v.lumen katétru. Vyočkování určitého objemu vzorku je kvantitativní metoda, takže dává možnost posoudit množství mikrobů. Možnosti Průkaz vlivu přítomnosti sacharidů na tvorbu zubního plaku •Princip pokusu je jednoduchý. Na plastovém důlku (který imituje povrch zubu) je kultivována jedna z ústních bakterií při různých koncentracích glukózy a po různě dlouhé časové úseky •Vzniklý biofilm je poté vizualizován genciánovou violetí a jeho intenzita je kvantifikována ve formě absorbance pomocí spektrofotometru Aby se zabránilo náhodné chybě, má vždy šest sousedních důlků stejné hodnoty koncentrace glc i času H:\Documents\Seropanl biofilm.bmp Staré a nové zkratky pro určování účinnosti antibiotik •MIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba •MBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ a podobně. •MBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace •MBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN Kontrola růstu Diagnostické možnosti – stanovení MBEC Foto: Archiv Veroniky Holé MBEC … minimální biofilm eradikující koncentrace (Existuje také hodnota: MBIC … minimální biofilm inhibující koncentrace – hodnota nepodporovaná všemi vědci) •Zatímco MIC je metoda určující minimální •inhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, •MBEC zjistí eradikaci bakteriálního biofilmu. •Vypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika •na bakterie žijící ve formě biofilmu. •MBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (nepřítomnost živých buněk, nedochází ke změně pH média, důlek tedy zůstává červený) MIC versus MBEC C:\Nika\Pracovní\1.JPG Foto: Archiv Veroniky Holé Diagnostické možnosti II. •Hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro daná antibiotika (bakterie jsou k.nim rezistentní) •Hodnoty MBEC jsou také zpravidla několikanásobně vyšší než MIC •Mikroby v biofilmu jsou zpravidla rezistentní i ke kombinacím antibiotik, jedinou možností potom zůstává vyjmutí biofilmového ložiska (katétru, ale i kloubních náhrad, zubních implantátů apod.) Konec C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Rodinné a jiné\2005\2005-12-19 Fotky Ančete Haraščete z kruhovky pětky\A2%20023.jpg [USEMAP] (Studentka K. C. před několika lety zapomněla index, takže zápočet pak dostala v hospodě J) Prezentace byla vytvořena ve spolupráci ing. Veroniky Holé, PhD., MUDr. Lenky Černohorské, PhD., a MUDr. Ondřeje Zahradníčka Foto: Archiv O. Z. Zpět na hlavní obsah Bonus: více o biofilmu Kde všude působí biofilm problémy •biofilm vzniklý na umělých površích v organismu člověka i zvířete (katetry, implantáty a podobně) •méně často biofilm na přirozených površích (zde si s tím organismus spíše poradí), ale i zde mohou být komplikace (zubní plak člověka, biofilm v žlázovém epitelu vemene u krávy) •a samozřejmě také biofilm na různých površích či v potrubních systémech mimo organismy, zejména ve vodárenství a potravinářství [USEMAP] [USEMAP] Materiály a místa •Na čem se tvoří: •nerez •hliník •sklo •teflonu •guma •plasty •Nejčastější výskyt: mrtvá místa výrobního zařízení •ventily •klouby •těsnění •apod. Použity texty z publikace: Petra Sedláčková, Petra Klodnerová, Miroslav Čeřovský: Metody inaktivace a odstranění biofilmu [USEMAP] Jaké jsou možné problémy u průmyslových biofilmů •zdroj křížových, postpasteračních a poststerilačních kontaminací → znehodnocení potravinářských produktů, kažení potravin, popř. přenos nákaz potravinami •koroze kovových částí zařízení •turbulence protékajících tekutých materiálů v průtokových trubkách •snížení účinnosti a energetické ztráty v důsledku tvorby tepelné izolační vrstvy ve výměnících tepla [USEMAP] Biofilm jako zdroj dalšího šíření •Poté, co se biofilm vytvoří, uvolňují se z něj mikroorganismy, které pak mohou kolonizovat zase další povrchy, takže biofilm vzniká na dalších místech •Neodstraněný biofilm tedy představuje potenciální riziko pro vznik biofilmu na jiných místech Účinnost na biofilm = účinnost na bakterie •Účinnost chemických látek na biofilm jako celek je dána zcela jinými mechanismy a vlivy než účinek na bakterie samotné. Často se právě uplatňuje povrchový náboj •Proto postupy méně účinné na jednotlivé bakterie mohou být účinnější na biofilm •U biofilmů v chirurgických ranách je například důležitější lokální ošetření rány (např. koloidní stříbro – povrchový náboj) než celkově podaná antibiotika [USEMAP] [USEMAP] Odstranění biofilmu (obecně) •Odstranění povrchu (výměna zařízení, části potrubí apod.) je samozřejmě radikální krok. Otázkou je, zda se biofilm nevytvoří znovu, bude-li nová část stejné konstrukce •K mechanickému odstranění biofilmu lze přistoupit, pokud to umožňuje situace •Z fyzikálních metod lze použít např. ultrazvuk •Chemická cesta je možná, je však nutné mít ověřeno, že příslušný postup (látka a koncentrace) na biofilm působí. Často se používají chlorové preparáty •Kombinace různých postupů je též možná Detergenty a desinfekce: možnost kombinace (v průmyslu) •Účinná může být kombinace •působení detergentu, který rozpustí a rozruší organickou hmotu na povrchu biofilmu, následně •opláchnutí rozrušený biofilm odplaví, a tím obnaží mikroorganismy, a poté •desinfekční látka pronikne dovnitř biofilmu a inaktivuje přítomné mikroorganismy •Nebo lze využít prostředků, které mají účinek detergentu i desinfekčního prostředku; problém je v tom, že vlastní desinfekční účinek detergentů je spíše slabý. [USEMAP] [USEMAP] Je možná prevence? •Šanci pro prevenci dávají materiálové vědy, zejména makromolekulární chemie •Povrchy nejsou stejně náchylné ke kolonizaci; méně náchylné jsou zpravidla hydrofobní povrchy. I jednotlivé plasty se liší •V medicíně se již používají materiály se speciální povrchovou úpravou, případně dokonce napuštěné antibiotiky (to ovšem nelze v potravinářství připustit) [USEMAP] Shrnutí bonusového materiálu •Biofilm působí komplikace nejen ve zdravotnictví, ale i v jiných oborech •Nejčastějším dalším oborem, kde se biofilm uplatňuje, je potravinářství •I zde ovšem existuje významná souvislost s lidským zdravím. Biofilm v technologických zařízeních se může stát zdrojem kontaminace potravin, případně vody Zpět na hlavní obsah